王自娥，鄧 婕，梁婷婷，蘇琳琳，葛 鋒，劉迪秋

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500)

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物響應(yīng)生物和非生物脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，具有長(zhǎng)度約60個(gè)氨基酸殘基的WRKY結(jié)構(gòu)域。WRKY結(jié)構(gòu)域高度保守，在N末端包含短肽‘WRKYGQK’，在C末端包含一個(gè)CX7CX23-HXC(C2HC)或CX4-5CX22-23HXH(C2H2)鋅指基序[1]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合靶基因啟動(dòng)子中的W-box元件(C/T)TGAC(T/C)，從而激活或抑制靶基因的表達(dá)[2-3]。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和鋅指基序的類型可將WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族分為3組：第Ⅰ組包含2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域；第Ⅱ組包含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2鋅指基序；第Ⅲ組也只包含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，但鋅指基序?yàn)镃2HC。第Ⅰ組WRKY蛋白可進(jìn)一步分為2個(gè)亞組，Ⅰa含有C2H2鋅指基序，Ⅰb含有C2HC鋅指基序；第Ⅱ組WRKY蛋白則被分為5個(gè)亞組(a—e)[4]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物對(duì)多種生物脅迫免疫應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)控因子，廣泛參與植物應(yīng)對(duì)多種病原菌的防御反應(yīng)[5]。植物響應(yīng)病原菌脅迫時(shí)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子對(duì)病原菌脅迫呈現(xiàn)出正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)作用。從辣椒(Capsicumannuum)的基因組中分離出了62個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，絕大多數(shù)CaWRKY的表達(dá)水平在辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、辣椒斑駁病毒(pepper mottle virus)、煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus)和黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus)侵染過程中上調(diào)[6]。在單胞銹菌(Uromycesvignae)侵染的早期，赤豆(Vignaangularis)VaWRKY33迅速響應(yīng)并起到正調(diào)控作用[7]。在煙草(Nicotianatabacum)中瞬時(shí)表達(dá)甘蔗(Saccharumspp.)ScWRKY5使煙草對(duì)茄腐鐮刀菌(Fusariumsolanivar.coeruleum)表現(xiàn)出更高的敏感性。并且ScWRKY5的瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo)致煙草中超敏反應(yīng)(hypersensitive response，HR)標(biāo)記基因NtHSR515及水楊酸(salicylic acid, SA)信號(hào)通路相關(guān)基因NtPR-1a/c和NtPR2的轉(zhuǎn)錄水平下降，ScWRKY5通過抑制HR和SA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)負(fù)調(diào)控甘蔗對(duì)茄腐鐮刀菌的抗性[8]。從芍藥(Paeonialactiflora)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選了一個(gè)差異表達(dá)的PlWRKY65基因，通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默降低PlWRKY65的表達(dá)后，芍藥植株對(duì)細(xì)鏈格孢(Alternariatenuissima)更加敏感，表現(xiàn)出更嚴(yán)重的感染癥狀，且PlWRKY65表達(dá)量的下降會(huì)導(dǎo)致PlPR2、PlPR4B、PlPR5和PlPR10的表達(dá)顯著降低[9]。

百合(Lilium)是世界上著名的鮮切花，深受世界各國(guó)人民的喜愛。但是百合容易感染主要由尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)引起的枯萎病，枯萎病會(huì)導(dǎo)致百合根部腐爛壞死，影響百合的產(chǎn)量和品質(zhì)，給百合的生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。岷江百合(L.regaleWilson)為中國(guó)特有的野生百合，主要分布于中國(guó)四川西部，具有極強(qiáng)的抗真菌、抗病毒特性，是培育百合抗病品種的重要種質(zhì)資源[10]。前期研究表明過表達(dá)岷江百合LrbZIP1、Lr14-3-3、LrGSTU5和LrPR10s等抗病基因的煙草對(duì)尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)的抗性[11-14]。通過岷江百合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到了一系列響應(yīng)尖孢鐮刀菌侵染的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因[15]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，岷江百合在被尖孢鐮刀菌侵染后WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因LrWRKY4的表達(dá)量顯著上調(diào)，并在根中大量表達(dá)。信號(hào)分子SA、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、乙烯利(ethephon, ETH)和過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)處理后均能不同程度上調(diào)LrWRKY4在岷江百合根中的轉(zhuǎn)錄水平。因此推測(cè)LrWRKY4可能參與岷江百合抗尖孢鐮刀菌的防御反應(yīng)。本研究分析了LrWRKY4的生物學(xué)功能。首先通過在洋蔥(Alliumcepa)表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)GFP-LrWRKY4融合蛋白，分析其在植物細(xì)胞中的表達(dá)部位。將LrWRKY4轉(zhuǎn)入模式植物煙草中過量表達(dá)，分析轉(zhuǎn)基因株系對(duì)尖孢鐮刀菌的抗性。同時(shí)對(duì)JA/SA信號(hào)途徑相關(guān)基因及部分抗病相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因煙草株系中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。此外，在岷江百合鱗片中瞬時(shí)表達(dá)LrWRKY4的RNAi片段，分析LrWRKY4表達(dá)量降低對(duì)尖孢鐮刀菌抗性和JA/SA信號(hào)途徑的影響。

1 材料和方法

1.1 材 料

岷江百合采集于四川省汶川縣，種于昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院溫室中。用于遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的煙草種子由本課題組保存，種子經(jīng)表面消毒后播種于1/2 MS培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)5周后的無菌煙草幼苗用于遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。尖孢鐮刀菌由本課題組從具有典型枯萎病癥狀的西伯利亞百合中分離、鑒定和保存，使用前在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆與生物信息學(xué)分析根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的LrWRKY4的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，通過PCR克隆得到LrWRKY4的開放閱讀框(ORF)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。然后將PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體(Promega, USA)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR篩選pGEM-T-LrWRKY4陽性克隆送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

將LrWRKY4所編碼的氨基酸序列在NCBI tblastn (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線軟件進(jìn)行同源分析查找相似蛋白。利用ClustalW 1.83軟件對(duì)LrWRKY4的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析；用ExPASY-ProtParam (http://web.expasy.org/ protparam/)在線軟件分析LrWRKY4的理化性質(zhì)；用ScanProsite (http://prosite.expasy.org/scanprosite/)在線軟件分析LrWRKY4的結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 亞細(xì)胞定位以pGEM-T-LrWRKY4為模板，設(shè)計(jì)帶有BamHⅠ和XbaⅠ限制性酶切位點(diǎn)的特異性引物(表1)，通過PCR獲得不含終止密碼子的LrWRKY4 ORF。使用BamHⅠ和XbaⅠ對(duì)pBIN m-gfp5-ER載體進(jìn)行酶切，然后通過T4DNA連接酶將LrWRKY4 ORF連接到酶切后的載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR篩選pBIN m-gfp5-ER-LrWRKY4陽性克隆。采用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105菌株中，通過PCR篩選陽性克隆。將包含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，以包含pBIN m-gfp5-ER空載體的農(nóng)桿菌EHA105菌液為陽性對(duì)照。24 h后用核定位標(biāo)記碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行染色，隨后在激光共聚焦掃描顯微鏡(Nikon, Japan)下觀察LrWRKY4的亞細(xì)胞定位。

1.2.3 植物過表達(dá)載體的構(gòu)建及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ為識(shí)別位點(diǎn)，設(shè)計(jì)基因特異性引物(表1)，以pGEM-T-LrWRKY4為模板通過PCR獲得LrWRKY4 ORF。將目的片段連接到pCAMBIA2300s載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR篩選出含pCAMBIA2300s-LrWRKY4重組質(zhì)粒的陽性克隆。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株中，經(jīng)PCR篩選出陽性克隆后轉(zhuǎn)化野生型(WT)煙草葉盤。煙草遺傳轉(zhuǎn)化參照張應(yīng)鵬等[16]的實(shí)驗(yàn)方法。使用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA，采用LrWRKY4的特異性引物進(jìn)行PCR，篩選陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株。隨機(jī)挑選陽性轉(zhuǎn)基因株系在溫室內(nèi)自交培育T2代轉(zhuǎn)基因株系。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草中LrWRKY4的表達(dá)及對(duì)尖孢鐮刀菌的抗性通過qRT-PCR分析LrWRKY4在隨機(jī)選擇的T2代轉(zhuǎn)基因煙草株系中的表達(dá)水平。總RNA提取、cDNA合成、qRT-PCR反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件參照Liu等[17]的實(shí)驗(yàn)方法，每個(gè)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以煙草肌動(dòng)蛋白基因NtACT(AB158612.1)為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法分析相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)值。用于qRT-PCR的基因特異性引物見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

為了進(jìn)一步驗(yàn)證LrWRKY4的功能，選取基因表達(dá)水平較高的T2代轉(zhuǎn)基因煙草株系進(jìn)行抗病性分析。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)相同、大小均一的WT和T2代轉(zhuǎn)基因煙草幼苗葉片，用無菌砂紙?jiān)谌~片相同位置進(jìn)行傷害處理，然后在傷口處接種200 μL尖孢鐮刀菌孢子懸浮液(2×106孢子/mL)。將感染的葉片平鋪在濾紙上，放在28 ℃氣候箱中培養(yǎng)7 d。此外，還在T2代轉(zhuǎn)基因煙草株系和WT煙草的根部接種尖孢鐮刀菌。用剪刀將煙草根部剪出傷口，然后浸入尖孢鐮刀菌孢子懸浮液(2×106孢子/mL)中30 min，水培7 d后收集煙草，記錄發(fā)病情況，并使用Photoshop軟件計(jì)算葉片病斑面積。每個(gè)單株包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草中防衛(wèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平挑選LrWRKY4基因表達(dá)水平較高的T2代轉(zhuǎn)基因煙草株系，通過qRT-PCR分析一些防衛(wèi)相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因煙草株系中的轉(zhuǎn)錄水平。包括JA生物合成途徑相關(guān)基因NtLOX(脂氧合酶)、NtAOC(丙二烯氧化物環(huán)化酶)、NtOPR(12-氧代植二烯酸還原酶)、NtJMT(茉莉酸羧基轉(zhuǎn)甲基酶)、NtAOS(丙二烯氧化物合成酶)、NtPACX(酯?；?Co氧化酶)，病程蛋白相關(guān)基因NtGlu2(β-1,3-葡聚糖酶2)、SA信號(hào)途徑標(biāo)記基因NtPR1(病程相關(guān)蛋白1)，超氧化物歧化酶NtSOD、NtCu-ZnSOD和NtMnSOD，以煙草肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閮?nèi)參基因。用于qRT-PCR的基因特異性引物見表1。

1.2.6LrWRKY4 RNAi片段在岷江百合鱗片中瞬時(shí)表達(dá)及對(duì)尖孢鐮刀菌的抗性設(shè)計(jì)帶有attB接頭的特異性引物(表1)擴(kuò)增LrWRKY4的RNAi片段(463 bp)。使用Gateway?BP ClonaseTMⅡEnzyme Mix kit (Invitrogen, USA)將PCR產(chǎn)物與pHellsgate2載體進(jìn)行BP重組反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞。再將pHellsgate2-LrWRKY4重組質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株中，通過PCR篩選陽性克隆。

用無菌砂紙對(duì)健康的岷江百合鱗片進(jìn)行傷害處理，放在潮濕的濾紙上保濕。將含有重組質(zhì)粒pHellsgate2-LrWRKY4和空載體pHellsgate2(對(duì)照)的農(nóng)桿菌懸浮液(50 μL)分別滴加到岷江百合鱗片傷口處，然后將鱗片置于28 ℃氣候箱中培養(yǎng)24 h，使載體在岷江百合鱗片中瞬時(shí)表達(dá)，提取此時(shí)百合鱗片總RNA，并通過qRT-PCR檢測(cè)瞬時(shí)表達(dá)RNAi片段后百合鱗片中LrWRKY4的表達(dá)水平及JA信號(hào)途徑相關(guān)基因LrAOS、LrOPR、LrPDF1.2(植物防御素)，SA信號(hào)途徑相關(guān)基因LrICS(異分支酸合酶)、LrPAL(苯丙氨酸解氨酶)的表達(dá)情況。然后在傷口處接種200 μL尖孢鐮刀菌孢子懸浮液(2×106孢子/mL)，置于28 ℃氣候箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集百合鱗片，拍照記錄發(fā)病癥狀，使用Photoshop軟件計(jì)算鱗片病斑面積。最后提取百合鱗片總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，以岷江百合三磷酸甘油醛脫氫酶LrGAPDH(JZ391059)為內(nèi)參基因。用于qRT-PCR的基因特異性引物見表1。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析基因表達(dá)水平和病斑面積均采用均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，野生型和轉(zhuǎn)基因植株之間的統(tǒng)計(jì)差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LrWRKY4的生物信息學(xué)分析

從岷江百合中分離到一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因LrWRKY4(MW125549)，全長(zhǎng)cDNA為1 138 bp，開放閱讀框?yàn)?93 bp，5′非翻譯區(qū)為68 bp，3′非翻譯區(qū)為77 bp。生物信息學(xué)分析表明，LrWRKY4編碼含330個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)分子量大小為36.8 kD，理論等電點(diǎn)約為6.32。序列分析顯示LrWRKY4蛋白含有一個(gè)高度保守的‘WRKYGQK’七肽序列和一個(gè)C2H2鋅指基序，說明LrWRKY4屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的Ⅱc組(圖1，A)。LrWRKY4的氨基酸序列與一些單子葉植物WRKY蛋白序列高度相似(圖1，B)。

A. LrWRKY4蛋白結(jié)構(gòu)分析；B. LrWRKY4的氨基酸序列與4條同源序列進(jìn)行多重比對(duì)：Ll. 麝香百合(QIL87957.1)；Eg. 油棕櫚(XP_010924354.1)；Ca. 椰子(KAG1367963.1)；Dc. 鐵皮石斛WRKY71(XP_020688893.1)圖1 LrWRKY4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及序列比對(duì)A. The protein structure analysis of LrWRKY4; B. The multiple alignment of LrWRKY4 and four homologous sequences: Ll. L. longiflorum (QIL87957.1); Eg. Elaeis guineensis (XP_010924354.1); Ca. Cocos nucifera (KAG1367963.1); Dc. Dendrobium catenatum (XP_020688893.1)Fig.1 Secondary structure prediction and sequence alignment analysis of LrWRKY4 protein

為了確定LrWRKY4的亞細(xì)胞定位，構(gòu)建了GFP-LrWRKY4融合載體，并通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將其轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。如圖2所示，在激光共聚焦顯微鏡下，GFP-LrWRKY4融合蛋白表達(dá)的綠色熒光特異性地分布在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中，且與核定位標(biāo)記PI共定位。而作為對(duì)照的GFP蛋白在整個(gè)細(xì)胞中都能觀察到綠色熒光信號(hào)。這表明LrWRKY4是一個(gè)細(xì)胞核定位蛋白。

圖2 GFP-LrWRKY4融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)Fig.2 Transient expression of GFP-LRWRKY4 protein in onion epidermal cells

2.3 LrWRKY4在煙草中的表達(dá)及對(duì)尖孢鐮刀菌的抗性

為了進(jìn)一步分析LrWRKY4的生物學(xué)功能，構(gòu)建了植物過表達(dá)載體pCAMBIA2300s-LrWRKY4，將其轉(zhuǎn)化至模式植物煙草中。以煙草基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，共篩選出45株T0代陽性轉(zhuǎn)基因煙草(圖3)。將轉(zhuǎn)基因煙草植株培養(yǎng)于溫室中，通過連續(xù)自交，得到T2代煙草種子，并培養(yǎng)無菌苗。再生的LrWRKY4轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草在表型上無明顯差異。通過qRT-PCR分析LrWRKY4在WT和11株T2代轉(zhuǎn)基因株系(L4-1/3/5/6/18/19/28/32/33/34/37)幼葉中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，LrWRKY4在11個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系中均有表達(dá)(圖4)。其中在L4-37株系中的表達(dá)水平最高，在L4-3和L4-28株系中的相對(duì)表達(dá)水平較低。表明LrWRKY4能夠在轉(zhuǎn)基因煙草中穩(wěn)定表達(dá)。

M. DL2000；1-15. 轉(zhuǎn)基因煙草；+. pGEM-T-LrWRKY4；-. 野生型煙草圖3 轉(zhuǎn)LrWRKY4基因煙草的PCR檢測(cè)M. DL2000; 1-15. Transgenic tobacco; +. pGEM-T-LrWRKY4; -. Wild-type tobaccoFig.3 PCR detection of LrWRKY4 transgenic tobacco

WT. 野生型煙草；采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析，** 表示與WT相比在0.01水平差異顯著，圖5、6同圖4 T2代轉(zhuǎn)基因煙草株系中的LrWRKY4表達(dá)WT. Wild-type tobacco; The t test was used to analyze the statistical difference; ** means the significance difference compared with WT at 0.01 level, the same as Fig.5 and Fig.6Fig.4 The expression of LrWRKY4 in T2 generation transgenic tobacco lines

為了評(píng)估LrWRKY4轉(zhuǎn)基因煙草的抗性水平，將煙草根部接種尖孢鐮刀菌孢子懸浮液后水培7 d。結(jié)果顯示，WT煙草根部明顯變黑甚至腐爛，葉片開始萎縮，而T2代LrWRKY4轉(zhuǎn)基因煙草株系的根部健康，未出現(xiàn)發(fā)黑，葉片仍然保持舒展?fàn)顟B(tài)(圖5，A)。此外，葉片接種實(shí)驗(yàn)也表現(xiàn)出相同的結(jié)果。煙草葉片接種尖孢鐮刀菌孢子懸浮液7 d后，轉(zhuǎn)基因煙草葉片只在接種的傷口附近出現(xiàn)了輕微黃化，伴隨著小面積的腐爛，而WT煙草葉片病斑沿著傷口擴(kuò)大且出現(xiàn)大面積腐爛黃化(圖5，B)。WT葉片的病斑面積達(dá)325 mm2，轉(zhuǎn)基因煙草株系的病斑面積均低于50 mm2(圖5，C)。這些結(jié)果表明LrWRKY4基因在煙草中的過表達(dá)提高了煙草對(duì)尖孢鐮刀菌的抗性。

A. 根部接種尖孢鐮刀菌；B. 葉片接種尖孢鐮刀菌；C.接種尖孢鐮刀菌后葉片的病變面積圖5 T2代轉(zhuǎn)LrWRKY4基因煙草的抗性分析A. The roots were inoculated with F. oxysporum; B. The leaves were inoculated with F. oxysporum; C. Lesion area of leaves after F. oxysporum inoculationFig.5 Resistance analysis of T2LrWRKY4 transgenic tobacco lines

2.4 LrWRKY4轉(zhuǎn)基因煙草中相關(guān)防衛(wèi)基因的轉(zhuǎn)錄水平

選擇4個(gè)LrWRKY4表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因煙草株系(L4-19/33/34/37)進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)分析，通過qRT-PCR分析JA生物合成途徑相關(guān)基因、病程蛋白相關(guān)基因SA信號(hào)途徑標(biāo)記基因及抗氧化相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因煙草株系和WT煙草中的表達(dá)水平。結(jié)果如圖6所示，與WT煙草植株相比，參與JA生物合成途徑相關(guān)基因NtLOX、NtAOC、NtOPR、NtJMT、NtAOS、NtPACX的表達(dá)量在LrWRKY4轉(zhuǎn)基因煙草中均有明顯上調(diào)。其中NtJMT在L4-33轉(zhuǎn)基因株系中與WT相比上調(diào)了11.7倍，NtAOC在L4-19轉(zhuǎn)基因株系中與WT相比上調(diào)了10.8倍。病程蛋白相關(guān)基因NtGlu2、SA信號(hào)途徑標(biāo)記基因NtPR1在LrWRKY4轉(zhuǎn)基因煙草株系中相對(duì)表達(dá)量也均有上調(diào)，NtGlu2、NtPR1在L4-33轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平分別達(dá)到了WT煙草的22和12.5倍。逆境響應(yīng)相關(guān)的3種超氧化物歧化酶基因NtSOD、NtCu-ZnSOD、NtMnSOD在轉(zhuǎn)基因煙草中的相對(duì)表達(dá)量也有不同程度上調(diào)?？傊?，LrWRKY4基因在煙草中的過表達(dá)，引起了煙草中JA/SA信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，還誘導(dǎo)了部分病程蛋白相關(guān)基因以及抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，以增強(qiáng)煙草對(duì)尖孢鐮刀菌的抗性。

圖6 T2代轉(zhuǎn)LrWRKY4基因煙草株系中11個(gè)防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)水平Fig.6 The expression levels of 11 defense-related genes in T2LrWRKY4 transgenic tobacco lines

2.5 LrWRKY4 RNAi片段在岷江百合鱗片中的瞬時(shí)表達(dá)

在岷江百合鱗片中瞬時(shí)表達(dá)LrWRKY4 RNAi載體，從而分析LrWRKY4表達(dá)下調(diào)對(duì)尖孢鐮刀菌抗性。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)LrWRKY4 RNAi載體在百合鱗片中瞬時(shí)表達(dá)，然后接種尖孢鐮刀菌孢子懸浮液。接種72 h后，RNAi載體浸染后和RNAi空載浸染后的岷江百合鱗片均有明顯的腐爛現(xiàn)象(圖7，A)。通過對(duì)病斑面積進(jìn)行測(cè)量和計(jì)算，發(fā)現(xiàn)LrWRKY4 RNAi載體浸染后的岷江百合鱗片的腐爛程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于RNAi空載浸染后的鱗片，前者的平均病變面積約為100 mm2，后者的病變面積不到20 mm2(圖7，B)。同時(shí)，qRT-PCR結(jié)果顯示，瞬時(shí)表達(dá)LrWRKY4 RNAi載體的鱗片與對(duì)照相比，LrWRKY4的表達(dá)水平降低了約45.7%，表明RNAi能夠降低LrWRKY4在百合鱗片中的表達(dá)量；此外，瞬時(shí)表達(dá)LrWRKY4 RNAi載體的鱗片在接種尖孢鐮刀菌72 h后，LrWRKY4的表達(dá)水平與對(duì)照相比下降了約93.8%(圖7，C)?？梢娫卺航俸削[片中LrWRKY4表達(dá)量的降低增加了岷江百合對(duì)尖孢鐮刀菌的敏感性。

A. 接種尖孢鐮刀菌72 h后RNAi載體和空載的岷江百合鱗片；B.尖孢鐮刀菌感染后岷江百合鱗片的病變面積(** P < 0.01)；C. RNAi載體及空載中LrWRKY4表達(dá)水平(* P < 0.05，** P < 0.01，圖8同)圖7 LrWRKY4 RNAi在岷江百合鱗片中的瞬時(shí)表達(dá)分析A. The RNAi vector and empty RNAi vector scales of L. regale inoculation F. oxysporum after 72 h; B. The L. regale scale lesions area caused by F. oxysporum infection (** P < 0.01); C. Expression levels of LrWRKY4 in RNAi vector and empty RNAi vector (* P < 0.05, ** P < 0.01, the same as Fig.8)Fig.7 Analysis of the LrWRKY4 RNAi transiently expressed in L. regale scales

2.6 LrWRKY4 RNAi瞬時(shí)表達(dá)的岷江百合鱗片中JA/SA信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)

為了分析LrWRKY4表達(dá)下調(diào)對(duì)JA/SA信號(hào)途徑的影響，檢測(cè)了LrWRKY4 RNAi瞬時(shí)表達(dá)的岷江百合鱗片中JA/SA信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，LrWRKY4 RNAi瞬時(shí)表達(dá)后24 h SA信號(hào)途徑相關(guān)基因LrICS、LrPAL的表達(dá)量與對(duì)照相比分別下降了11.8%和8.2%；接種尖孢鐮刀菌72 h后， 2個(gè)基因的表達(dá)量與對(duì)照相比分別降低了47.9%和43.4%(圖8)。此外，JA信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平與對(duì)照相比顯著下調(diào)，LrAOS、LrOPR和LrPDF1.2的表達(dá)量分別下降了38.3%、76.9%和36.5%；接種尖孢鐮刀菌72 h后，3個(gè)基因的表達(dá)水平分別降低了73.9%、92.5%和82.3%。這些結(jié)果表明LrWRKY4表達(dá)量的降低下調(diào)了幾個(gè)JA/SA信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平。

圖8 瞬時(shí)表達(dá)LrWRKY4 RNAi的岷江百合鱗片中JA/SA信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)Fig.8 Expression levels of JA/SA signaling pathway related genes in the L. regale scales with LrWRKY4 RNAi transient

3 討 論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是一大類植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與多種生物學(xué)過程，包括生物和非生物脅迫反應(yīng)、激素反應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝[18-20]。岷江百合是中國(guó)重要的百合抗病種質(zhì)資源，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)一些岷江百合WRKY轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)尖孢鐮刀菌的誘導(dǎo)[15]。從中分離得到了LrWRKY4轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)構(gòu)分析表明LrWRKY4蛋白含有一個(gè)高度保守的‘WRKYGQK’七肽序列和一個(gè)C2H2鋅指基序，說明LrWRKY4屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的Ⅱc組。已有研究證實(shí)，許多Ⅱc類WRKY轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)控植物對(duì)生物和非生物脅迫的防衛(wèi)反應(yīng)[21-23]。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明LrWRKY4表達(dá)于細(xì)胞核中，可能作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在前人的研究中，一些WRKY轉(zhuǎn)錄因子也顯示了類似的定位模式[24]。如香蕉(Musaacuminata)的MaWRKY31、MaWRKY33、MaWRKY60、MaWRKY71，番茄(Solanumlycopersicum) SlWRKY6均定位于細(xì)胞核[25-26]。

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子基因的異位表達(dá)，進(jìn)而分析轉(zhuǎn)基因植株中基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，從而可以分析轉(zhuǎn)錄因子的功能以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。SpWRKY3在番茄中的過表達(dá)正調(diào)控番茄對(duì)致病疫霉(P.infestans)的防御反應(yīng)，表現(xiàn)為壞死細(xì)胞數(shù)量減少、病斑面積變小和病害指數(shù)降低，而SpWRKY3沉默后，番茄對(duì)致病疫霉抗性減弱[27]。OsWRKY80在水稻(Oryzasativa)中的過表達(dá)顯著增強(qiáng)了對(duì)紋枯病(Rhizoctoniasolani)的抗性，并上調(diào)了轉(zhuǎn)基因株系中病程相關(guān)蛋白基因PR1a、PR1b、PR5和PR10的轉(zhuǎn)錄水平。而OsWRKY80 RNAi的表達(dá)則顯著降低了水稻對(duì)紋枯病的抗性，上述病程相關(guān)蛋白基因在OsWRKY80 RNAi株系中的表達(dá)水平均下降[28]。在本研究中，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)驗(yàn)證了LrWRKY4的功能。LrWRKY4轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出了對(duì)尖孢鐮刀菌較強(qiáng)的抗性。瞬時(shí)表達(dá)LrWRKY4 RNAi載體的岷江百合鱗片與對(duì)照相比表現(xiàn)出更大的腐爛程度和發(fā)病面積，表明LrWRKY4在岷江百合鱗片中的表達(dá)下降增加了對(duì)尖孢鐮刀菌的敏感性。上述結(jié)果表明，LrWRKY4是岷江百合防御枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌的正調(diào)節(jié)因子。

在菊花(Chrysanthemummorifolium)中，外源性SA能強(qiáng)烈誘導(dǎo)CmWRKY15-1的表達(dá)，在易感菊花中過量表達(dá)CmWRKY15-1增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)柄銹菌(Pucciniahoriana)的耐受性，并且提高了內(nèi)源SA含量和SA生物合成基因的表達(dá)。而在相同條件下，CmWRKY15-1 RNAi植株表現(xiàn)出相反的結(jié)果，其對(duì)柄銹菌的敏感性增加，內(nèi)源SA含量降低，表明CmWRKY15-1通過SA信號(hào)途徑在菊花對(duì)柄銹菌的抗性中發(fā)揮正調(diào)控作用[29]。煙草NtWRKY50是一個(gè)受多種脅迫因子誘導(dǎo)的基因，馬鈴薯Y病毒(potato virus Y)、紋枯病(R.solani)及黑脛病菌(P.parasitica)侵染、非生物脅迫(熱脅迫、冷脅迫及傷脅迫)和信號(hào)分子處理(SA、JA、H2O2及ETH)均能誘導(dǎo)NtWRKY50的表達(dá)。NtWRKY50在煙草中過表達(dá)導(dǎo)致SA和JA含量上升以及防御相關(guān)基因(PR3、H1N1、PR1B、PR2、ACS1和EFE26)的表達(dá)量上升[22]。我們的前期研究也表明，SA、MeJA、ETH和H2O2的處理誘導(dǎo)了LrWRKY4的表達(dá)量[15]。本研究獲得了過表達(dá)LrWRKY4的轉(zhuǎn)基因煙草株系，分析發(fā)現(xiàn)JA/SA信號(hào)途徑相關(guān)基因(NtLOX、NtAOC、NtAOS、NtJMT、NtOPR、NtPACX、NtPR1)的表達(dá)與WT煙草相比顯著上調(diào)。而在RNAi 的百合鱗片中則表現(xiàn)出相反的結(jié)果，JA/SA信號(hào)途徑相關(guān)基因(LrAOS、LrOPR、LrPDF1.2、LrICS、LrPAL)的表達(dá)均下降。此外，幾個(gè)病程相關(guān)蛋白基因(NtGlu2)、抗氧化脅迫相關(guān)基因(NtSOD、NtCu-ZnSOD、NtMnSOD)的轉(zhuǎn)錄水平在轉(zhuǎn)基因煙草中均有不同程度的上升?？梢?，LrWRKY4可能參與JA/SA信號(hào)途徑調(diào)節(jié)岷江百合對(duì)枯萎病菌的抗性。

綜上所述，LrWRKY4編碼一個(gè)定位于細(xì)胞核的Ⅱc類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。過表達(dá)LrWRKY4的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)尖孢鐮刀菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，并且上調(diào)了煙草中一系列JA/SA信號(hào)途徑相關(guān)基因、病程相關(guān)蛋白基因以及抗氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平，從而增強(qiáng)了煙草對(duì)尖孢鐮刀菌的抗性。此外，LrWRKY4 RNAi片段的瞬時(shí)表達(dá)降低了JA/SA信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)并增強(qiáng)了岷江百合對(duì)尖孢鐮刀菌的敏感性。這些結(jié)果表明，LrWRKY4在岷江百合的免疫應(yīng)答中起到正調(diào)控作用，可能通過參與JA/SA介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)岷江百合對(duì)尖孢鐮刀菌的抗性。本研究的開展有助于揭示珍稀抗病種質(zhì)資源岷江百合響應(yīng)尖孢鐮刀菌侵染的抗性分子機(jī)理。