袁薪茹，閆吉軍，范金石，褚金芳,3

(1.青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東 青島 266042；2.中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，國家植物基因研究中心(北京)， 北京 100101；3.中國科學院大學現(xiàn)代農業(yè)科學學院，北京 100039)

植物小肽激素是植物激素研究領域的一個新興分支，是一類天然氨基酸以不同組成和排列方式構成的活性生物分子，通常可以與周邊細胞膜表面的受體激酶(主要是富含亮氨酸的類受體蛋白激酶)相互作用，在植物細胞間信息交流中發(fā)揮著關鍵作用[1-2]。隨著技術手段的快速發(fā)展和研究的不斷深入，人們陸續(xù)在番茄及其他植物中發(fā)現(xiàn)了與植物免疫、細胞分化、生殖與發(fā)育等植物生理活動密切相關的系統(tǒng)素、植物磺肽素、CLE (CLAVATA3/Embryo surrounding region)和快速堿化因子等數(shù)十種小肽激素[1-2]，其中CLE作為維持干細胞增殖與分化平衡的關鍵調控因子[3],在低等植物和高等植物(包括單子葉植物和雙子葉植物)中均有分布。CLE小肽結構具有一定的保守性，其保守序列由14個氨基酸組成，其中12個氨基酸序列(十二肽基序)足以使CLE發(fā)揮其生理作用[4]。根據(jù)生物信息學預測，在擬南芥中有32個CLE成員[5]，在水稻中有47個CLE成員[6]，其他物種中也含有類CLE同源基因[7]。在CLE家族中，目前研究較為透徹的只有CLV3、導管分化抑制因子(tracheary elements differentiation inhibitory factor, TDIF)等少數(shù)成員，還有大量的預測小肽尚未得到證實。植物體內潛在的CLE小肽及其類似物的數(shù)量十分龐大，因此CLE小肽的篩選與結構鑒定極具挑戰(zhàn)性。質譜技術具有準確性高、靈敏度高、選擇性強等優(yōu)點，在CLE小肽的發(fā)現(xiàn)、結構鑒定和定量分析中發(fā)揮著關鍵作用[8-9]，小肽的質譜碎裂規(guī)律和碎片信息是小肽定性、定量分析的重要依據(jù)。

本工作擬采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法(UPLC-QTOF MS)系統(tǒng)性地研究CLV3、CLE19、CLE40、TDIF和GmRIC1(Glycine max Rhizobia-induced CLE1)5種典型的CLE小肽激素的質譜特征，并利用合成的1個CLE類似小肽(CLEL)對碎裂規(guī)律進行驗證。通過研究CLE小肽的碎裂規(guī)律和特點，提出利用質譜手段對未知CLE小肽進行篩選與結構鑒定的可能性思路，希望可以幫助生物學家準確定量分析CLE小肽以及尋找和鑒定新的CLE小肽。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

AcquityTMUPLC-Synapt G2 QTOF-MS聯(lián)用儀：美國Waters公司產品，配有電噴霧離子源(ESI)及MassLynx4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

CLV3、CLE19、CLE40、TDIF、GmRIC1：純度>95%，均由杭州中肽生化有限公司合成；CLEL：由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所許操研究員實驗室提供，各小肽標品的氨基酸序列等信息列于表1；乙腈、甲醇：色譜純，美國Thermo Fisher公司產品；甲酸：色譜純，美國Sigma-Aldrich公司產品；其他化學試劑均為分析純或更高純度級別；去離子水(電阻率≥18.2 MΩ)：由Milli-Q純化水凈化系統(tǒng)制備。

表1 CLE小肽及CLEL的氨基酸序列和一級質譜特征準分子離子Table 1 Amino acid sequences and typical quasi-molecular ions of five CLE peptides and CLEL

采用去離子水配制小肽標準儲備液(1 g/L)，放于-80 ℃冰箱中保存；用含0.1%甲酸的5%乙腈酸性水溶液逐級稀釋儲備液，配制工作溶液。

1.2 實驗條件

1.2.1色譜條件 色譜柱：Waters Peptide CSH C18柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～1 min(99%A)，1～10 min(99%～43%A)，10～13 min(43%～0%A)，13～14 min(0%A)，14～16 min(0%～99%A)；流速0.3 mL/min；柱溫為室溫；進樣量5 μL。

1.2.2質譜條件 電噴霧電離源正離子模式(ESI+,m/z50～1 500)，毛細管電壓3.0 kV，樣品錐孔電壓30 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，樣品載氣流量30 L/h，脫溶劑氣流量800 L/h，采用亮氨酸腦啡肽為質量校準溶液(濃度1 mg/L，流速5 μL/min)。二級質譜實驗采用氬氣作為碰撞氣，碰撞誘導解離(CID)模式，除了設定碰撞電壓外，其他實驗條件與一級質譜參數(shù)一致。

2 結果與討論

2.1 CLE家族小肽激素的一級質譜圖分析

選取的5種典型CLE小肽激素均可檢測到多種多電荷離子，示于圖1，TDIF的最強準分子離子為雙電荷，而其他4種小肽的最強準分子離子均為三電荷。結合小肽序列結構可知(表1)，上述5種典型CLE小肽的最強準分子離子攜帶電荷數(shù)與其堿性氨基酸殘基的數(shù)目呈正相關，小肽的質子化位點可能是空間上遠離的堿性氨基酸側鏈及端氨基，這一規(guī)律可能同樣適用于其他CLE小肽。

注：加粗表示準分子離子；*表示脫水離子

從檢測靈敏度的角度出發(fā)，最強準分子離子占所有準分子離子的比例及其相關CID碎片離子是小肽定量分析的關鍵。除CLE19外，其余小肽的最強準分子離子峰比例大部分達到90%以上，這有利于譜圖解析和定量分析，示于圖2a。譜圖分析過程中，除TDIF外，其余小肽均發(fā)生了脫水現(xiàn)象，脫水離子峰的產生可能主要來源于氨基酸側鏈(O、S、T、Y)上的羥基。脫水離子的比例隨著電荷數(shù)目的增加而增加，CLE40和CLV3的四電荷準分子離子甚至接近100%，中性丟失形成了[M+4H—H2O]4+，示于圖2b。隨著樣品錐孔電壓的增加，脫水離子所占比例越來越大(結果未展示)，可見一級質譜的脫水離子是源內碎裂的結果。因此，在對CLE家族進行分析尤其是定量分析時，需要特別關注含有存在羥基的氨基酸殘基的小肽，防止源內碎裂給分析靈敏度帶來不利的影響。另一方面，該結果表明不同電荷的小肽離子穩(wěn)定性具有較大差異，電荷數(shù)越多越容易碎裂。不同電荷的小肽準分子離子峰的碎裂特征將在下文繼續(xù)探討。

圖2 攜帶電荷數(shù)目對CLE小肽準分子離子強度(a)及脫水效率(b)的影響Fig.2 Influence of the charge state of CLE peptides parent ions on corresponding ion abundance (a) and dehydration efficiency (b)

小肽多電荷離子的分布情況是影響檢測靈敏度及譜圖解析難度的重要因素。除小肽自身的結構特征外，流動相組成及工作溶劑的選擇也非常關鍵。Kebarle等[10]研究發(fā)現(xiàn)，小肽離子化后的電荷狀態(tài)與工作溶劑密切相關。氣相狀態(tài)下具有高質子親和勢的溶劑(乙腈、丙酮等)會使小肽的電荷數(shù)減少，而具有低質子親和勢的溶劑(如甲醇和水)對小肽離子的電荷狀態(tài)沒有影響。為此，本研究將流動相B由乙腈換為甲醇，以期減少低電荷離子豐度，提升最強準分子離子峰的比例。然而，實驗結果表明，甲醇體系下各小肽最強準分子離子峰的比例變化不顯著，而且出現(xiàn)色譜峰變寬、峰分叉及靈敏度下降等問題。故后續(xù)實驗仍然采用乙腈-水溶液作為流動相。

2.2 CLE家族小肽激素的二級質譜圖分析

在相同的質譜條件下，GmRIC1的雙電荷、三電荷和四電荷準分子離子的二級質譜圖示于圖3。可以看出，在20 V碰撞電壓下，[M+2H]2+基本未碎裂，[M+3H]3+大部分被裂解，而[M+4H]4+幾乎完全碎裂成子離子，特征碎片離子峰較少?？梢?，小肽準分子離子所帶電荷越多，越容易發(fā)生碎裂，此結果與一級質譜研究中的脫水程度與所帶電荷數(shù)的關系相符，也與文獻[11]報道一致。進一步分析表明，最強準分子離子[M+3H]3+產生的碎片離子最豐富且強度較高，更適合用于小肽結構鑒定。另一方面，小肽的定量分析時，為了獲得最佳的分析效果，一般選擇最強的準分子離子為母離子，選擇豐度高的特征碎片離子為子離子。因此，本實驗選擇每個CLE小肽最強的準分子離子探索CID碎裂規(guī)律。

注：a.[M+2H]2+;b.[M+3H]3+;c.[M+4H]4+

在CID碎裂模式下，碰撞能量是影響二級質譜圖質量的主要因素。在低碰撞電壓(10 V/15 V)下，小肽CLV3無法有效裂解，可獲取的子離子信息較少；當碰撞電壓升高(18 V/20 V)，小肽產生的碎片離子峰較多，強度高且穩(wěn)定，適合對其進行定性定量分析；繼續(xù)升高碰撞電壓至25 V時，特征碎片離子峰減少且強度降低，示于圖4。綜合對比，CLV3、CLE19、CLE40、TDIF以及GmRIC1的最佳碰撞能量分別為18、15、18、20、18 V。雙電荷TDIF需要的碰撞能量比三電荷的其他小肽高，這進一步表明，小肽準分子離子碎裂程度與其所帶電荷的數(shù)目正相關。鑒于CLE家族小肽的高度結構保守性，其他CLE小肽的最佳碰撞能量可能也在15～20 V之間，實際應用時需要考慮最強準分子離子的電荷數(shù)，電荷數(shù)越多，能量越低。

注：a.10 V；b.15 V；c.18 V；d.20 V；e.25 V

在最佳碰撞能量下，CLE家族5種小肽激素的二級質譜圖示于圖5?？梢钥闯觯贑ID模式下，CLE小肽主要產生b型和y型碎片離子，還有少量的a型離子。CLV3的碎片離子中，b3、b6、y4的相對豐度最高，b5、y6、y7次之，表明3位纈氨酸和4位脯氨酸、6位甘氨酸和7位脯氨酸以及8位天冬氨酸和9位脯氨酸之間的肽鍵最容易斷裂，5位絲氨酸和6位甘氨酸之間的酰胺鍵次之。CLE19的碎片離子中，b3、y6的相對強度最高，b5、y4、y7次之，表明3位異亮氨酸和4位脯氨酸、6位甘氨酸和7位脯氨酸的肽鍵最容易斷裂，5位蘇氨酸和6位甘氨酸以及8位天冬酰胺和9位脯氨酸之間的肽鍵次之。CLE40的碎片離子中，b3、y4的相對強度最高，b5、b6、y7次之，說明3位纈氨酸和4位脯氨酸、8位天冬氨酸和9位脯氨酸之間的肽鍵最容易斷裂，5位蘇氨酸和6位甘氨酸以及6位甘氨酸和7位蘇氨酸之間的肽鍵次之。GmRIC1的碎片離子中相對強度最高的為b3、b5、b6、y4，說明酰胺鍵的斷裂容易發(fā)生在3位丙氨酸和4位脯氨酸、5位谷氨酸和6位甘氨酸、6位甘氨酸和7位脯氨酸以及8位天冬氨酸和9位脯氨酸。TDIF的碎片離子中，b8、b9、b10、b11、y2的相對強度最高，b3、y4次之，說明末端5個氨基酸之間的肽鍵均容易斷裂，3位纈氨酸與4位羥脯氨酸之間的肽鍵次之。綜合對比分析，CLE小肽N端的精氨酸或組氨酸的羧基位置很難碎裂，均未檢測到b1離子，而y1、y4、y7和b3離子則普遍存在于各CLE標品的二級質譜圖中，尤其以y4和b3離子豐度較高。在CLE小肽結構中，脯/羥脯氨酸的氨基(特別是氨端起4位和9位脯/羥脯氨酸)以及甘氨酸的氨基和羧基端最容易發(fā)生斷裂。根據(jù)自由移動質子引發(fā)的電荷誘導碎裂模型， b/y離子形成的主要驅動力是電荷在肽段上的轉移。在外界能量激發(fā)下，電荷向熱力學更穩(wěn)定的位置移動，當電荷移動到肽鍵上的氮原子時，酰胺鍵的電子云密度分布發(fā)生改變，從而使肽鍵鍵能減弱而更容易碎裂[12]。因此，肽鍵碎裂難易的關鍵因素是肽鍵中氮原子的質子親和勢。脯氨酸作為唯一的環(huán)狀氨基酸，其氮原子的pKa(10.6)大于其他氨基酸，更容易結合質子。在這種情況下，小肽鏈中脯氨酸的氨基側肽鍵比其他位置更容易發(fā)生斷裂，從而產生相應的高豐度b/y離子。文獻[11]報道表明，煙草系統(tǒng)素也容易在脯氨酸的氨基端發(fā)生斷裂。可見，脯氨酸氨基側肽鍵容易碎裂形成相應的y離子及互補b離子這一規(guī)律可能具有普適性，可用于其他活性小肽的定性定量分析。目標小肽中都存在相對強度較高的b5、y7以及b6、y6互補離子對，對于CLE家族其他小肽激素的定量分析具有重要的參考意義。

注：a.CLV3；b.CLE19;c.CLE40;d.TDIF;e.GmRIC1

CLE家族的小肽激素具有特定的保守結構域，這些保守結構提供了受體結合和信號轉導的關鍵作用位點，是該家族成員間具有顯著功能冗余性的重要原因。6位甘氨酸在中心區(qū)域扭折結構的形成中發(fā)揮著關鍵作用。4、7、9位脯氨酸構成了典型的聚脯氨酸結構域，通常形成剛性的螺旋結構，能夠用作蛋白-蛋白作用域或組裝多肽鏈。1位精氨酸或組氨酸對前體蛋白剪切定位及成熟小肽的形成十分重要，12位組氨酸或天冬酰胺則普遍存在于擬南芥、水稻等物種的CLE結構中。這些保守結構的存在與否可以作為CLE小肽激素篩選的重要判斷依據(jù)。結合前述質譜碎裂特點， CLE小肽激素定性分析的關鍵碎片離子為y1(12位組氨酸或天冬酰胺)、b1(1位精氨酸或組氨酸)、b4(包含4位脯氨酸)、y3(包含9位脯氨酸)。在現(xiàn)有條件下，b1離子難以檢出，而b4和y3離子的質荷比可能性太多(包含可變氨基酸)，使用價值有限。綜合判斷，y1離子是CLE分析的關鍵離子之一。6位甘氨酸位于肽鏈中間，無法直接通過b和y型離子判斷其存在與否。而甘氨酸兩端的肽鍵容易碎裂，可以通過中性丟失分析，間接推測6位甘氨酸的存在(b7-b6或 y8-y7)。同樣的，脯氨酸氨基側的肽鏈容易碎裂，也可通過類似的思路間接解析。因此，上述保守離子可作為小肽篩選的依據(jù)，構建合適的質譜篩選方法(數(shù)據(jù)依賴或非數(shù)據(jù)依賴)，幫助研究人員探尋新的CLE小肽激素。

2.3 CLE家族小肽質譜碎裂規(guī)律驗證

為了檢驗上述總結的規(guī)律，實驗合成了1個與CLE結構十分相似的小肽CLEL，其基本信息列于表1。根據(jù)上文研究，CLE小肽的質譜特征為：1) 最強準分子離子峰攜帶的電荷數(shù)目為空間分散的堿性氨基酸個數(shù)加1；2) 最強準分子離子峰的最佳碰撞能量在15～20 V之間，雙電荷需要20 V左右，三電荷需要18 V左右，四電荷的最佳碰撞能量更低；3) 在CID模式下，主要產生y1、y4、y7和b3離子，其中b3和y4為高豐度離子。據(jù)此，推測CLEL的最強準分子離子為三電荷離子，最佳碰撞能量為15～20 V，容易在脯氨酸氨基側及甘氨酸兩側斷裂形成b3、y9、y4、y8、b5、y7、b6和y6離子。CLEL的最強準分子離子為[M+3H]3+,最佳碰撞電壓為18 V，碎片離子中b3、b5、b6、y4、y6的豐度最高，示于圖6，該結果與推測結果完全契合。上述質譜碎裂規(guī)律對CLE小肽的相關研究具有較強的實用性。

圖6 在最優(yōu)碰撞電壓(18 V)下，CLEL的一級質譜圖(a)和準分子離子[M+3H]3+的二級質譜圖(b)Fig.6 MS spectrum of [M+3H]3+ (a) and MS/MS spectrum of CLEL (b)under the optimized collision energy (18 V)

2.4 CLE家族小肽質譜碎裂規(guī)律的應用

在擬南芥的CLE十二肽基序中[13]，N端為組氨酸或精氨酸，中間大多含有PxxPxPP表示脯氨酸，x表示可變氨基酸殘基)片段，C端為天冬酰胺或組氨酸，6號位置為甘氨酸。根據(jù)出現(xiàn)頻次，最普遍的保守序列為R-x-x-P-x-G-P-D/N-P-L-H-H/N?？梢?，對未知CLE小肽篩選與鑒定最有價值的是保守性極強的b1、y1、y2、y3、y4離子。結合CLE小肽的質譜碎裂特點和碎片離子的豐度分布，適合未知小肽篩選標準的子離子為y1和y4。基于上述依據(jù)，可對擬南芥26個十二肽基序以及其他物種中未知CLE小肽的質譜行為進行預測，結果列于表2。可以看出，由于結構的保守性，CLE小肽的子離子分布具有很大的相似性，因此可以提出1種基于質譜的未知CLE小肽的篩選策略。以Synapt G2 QTOF-MS的MSE(一種非數(shù)據(jù)依賴采集模式)為例，同時以低能量和高能量進行質譜掃描，典型條件如下：1) 低能量掃描，正離子掃描模式(ESI+，m/z100～800)，碰撞能量0 V，可采集一級質譜圖；2) 高能量掃描，正離子掃描模式(ESI+，m/z100～1 500)，碰撞能量18 V，可采集二級質譜圖。數(shù)據(jù)采集后，在高能量總離子流圖(TIC)中采用表中預測的y1(133.061/156.077)和y4(406.220/383.204/421.195/303.167/333.177/449.237)離子提取色譜圖(EIC)，篩選出保留時間相同的譜峰，即同時具有y1和y4子離子的化合物，然后運用MassLynx軟件的譜圖合并(combine spectrum)功能分別提取這些化合物的一級和二級質譜圖，分析母離子和子離子分布，推測小肽序列。為了考察這一策略的可行性，本文假定CLEL是一種未知CLE小肽，利用MSE方法進行搜尋和序列鑒定，最終軟件預測該化合物的小肽序列為RGVPAGODHPLH。CLEL的真實序列為RGVPAGODPLHH，預測的氨基酸組成與實際氨基酸組成基本相符，僅C端4個氨基酸的排列順序有差異?？梢?，該篩選策略對未知CLE小肽的篩選和結構鑒定具有潛在的應用價值。

表2 擬南芥中已知CLE十二肽基序的質譜行為預測Table 2 Predicted mass spectrometric characteristics of CLE dodecapeptide motif in Arabidopsis

由于CLE家族的小肽激素內源含量低、數(shù)量龐大，而且具有一定的物種差異性，其篩選和鑒定是一項極富挑戰(zhàn)性的工作。本文提供的篩選策略可用于CLE家族小肽的初步篩選，后期的工作可以從以下幾個方面進行深入研究。首先，可根據(jù)需要進一步挖掘CLE小肽的保守性質譜特征，提高篩選的靶向性。通過提高碰撞能量、改變惰性氣體、綜合運用多種碎裂方式(如主要產生c型和z型子離子的電子轉移碎裂，改善低質量碎片丟失效應的高能誘導裂解等)等方法獲得CLE保守氨基酸殘基(6位甘氨酸，4、7、9位脯氨酸，1位精氨酸/組氨酸)相關的高豐度碎片離子。其次，可利用高靈敏的多反應監(jiān)測(MRM)模式作為輔助提高篩選效率。通過質譜碎裂規(guī)律和生物信息學預測的CLE結構可以推算出典型的子離子，從而給出MRM檢測的離子對，設置合適的信號閾值觸發(fā)二級質譜掃描，從而實現(xiàn)對可能真實存在的CLE小肽的檢測和結構確定。最后，與生物學家合作，結合遺傳學研究，發(fā)現(xiàn)和鑒定不同物種中的CLE小肽激素。

3 結論

本工作采用UPLC-QTOF MS聯(lián)用技術研究了5種典型CLE小肽激素的一級質譜特征和最強準分子離子的CID碎裂規(guī)律，發(fā)現(xiàn)CLE小肽的質譜行為具有較高的相似性。在ESI離子化方式下，5種CLE小肽的最強準分子離子攜帶的電荷均等于空間分散的堿性氨基酸殘基數(shù)目加1。CID模式下進行二級質譜碎裂，最佳碰撞能量與母離子的電荷數(shù)相關，所帶電荷數(shù)越高，需要的最佳碰撞能量越低，雙電荷與三電荷的最佳碰撞能量分別約為20 V、15～18 V。最強準分子離子主要產生b型和y型碎片，也會產生少量的a型碎片。從碎裂位置看，脯/羥脯氨酸的氨基(特別是氨端起4位和9位脯/羥脯氨酸)以及甘氨酸的氨基和羧基端最容易發(fā)生斷裂，從而形成高豐度的b3和y4離子。人工合成的CLE類似肽的質譜碎裂與上述規(guī)律完美契合，可為CLE小肽激素的定性定量分析提供科學依據(jù)。結合CLE的結構特點和質譜碎裂規(guī)律對擬南芥十二肽基序的質譜行為進行預測，提出一種非數(shù)據(jù)依賴的CLE篩選思路，有可能應用于新CLE小肽激素的發(fā)現(xiàn)與結構鑒定中。

致謝：感謝中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所許操研究員實驗室提供的人工合成CLE類似肽標準品(CLEL)，感謝本實驗室辛培勇博士對實驗和數(shù)據(jù)分析提供的幫助和建議。