宋偉，王金輝，胡貴鵬，陳修來，劉立明，吳靜

（1 江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122； 2 江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

引 言

β-酪氨酸是非蛋白氨基酸，在自然界中較少見，主要存在于海洋生物和陸地原核生物產(chǎn)生的許多次級代謝物中[1-3]。近年來，關(guān)于多種β-酪氨酸衍生物的藥理學和構(gòu)象特性研究較多，其表現(xiàn)出多種生物活性[4]。例如，含有(R)-β-酪氨酸結(jié)構(gòu)的環(huán)肽Jasplakinolide 和Chondramide 具有非常突出的抗腫瘤活性；(S)-β-酪氨酸是抗生素依地堿A(Edeine A)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元(圖1)[5-7]。因此，β-酪氨酸及其衍生物的不對稱合成引起了人們廣泛的關(guān)注。

β-酪氨酸的合成方法主要包括以下幾種途徑[8]：(1)α-氨基酸的Arndt-Eistert 同系化[9]；(2)酶法拆分[10]；(3)立體選擇性Mannich 反應[11]；(4)胺與同手性α,β-不飽和脂肪酸的共軛加成[12]；(5)N-芐基羥胺與亞酰胺的加成反應[13]；(6)β-氨基巴豆酸鹽[14]或β-酰氨基丙烯酸鹽[15]的催化還原；(7)同手性硝基化合物的偶極環(huán)加成等[16]。其中，同手性胺基鋰介導的α-甲基芐胺與α,β-不飽和脂肪酸的共軛加成可以用作不對稱合成β-酪氨酸及其衍生物的一般途徑。例如：Davies 等[17]使用n-BuLi 為催化劑，以(S)-N-芐基-N-α-甲基芐胺和肉桂酸酯衍生物為底物，在THF 和-78℃條件下合成了氨基和羧基被保護的β-酪氨酸，ee 值>95%，產(chǎn)物得率為63%。Yamagiwa等[18]以Li 配合物為催化劑，以N-吡咯?；?肉桂酸酯衍生物和酰胺為底物，在THF 和-30℃條件下合成了氨基和羧基被保護的β-酪氨酸類似物，ee 值81%～82%，產(chǎn)物得率53%～63%。然而，目前報道的這些方法需要較為復雜的底物而且大多依賴于貴金屬催化劑，反應產(chǎn)物需要進一步脫去保護基團才能獲得目標化合物。為了有機合成工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，以酶轉(zhuǎn)化法為代表的綠色合成方法越來越受到人們的歡迎和重視[19]。多酶級聯(lián)為一些化合物合成困難的問題提供了可靠的解決方案，因此被越來越多的合成化學家們所關(guān)注[20-21]。多酶級聯(lián)能夠使用一些廉價化合物作為初始底物，經(jīng)過多酶之間的協(xié)同合作，促使反應朝向終產(chǎn)物進行，有助于提高整體轉(zhuǎn)化效率和最終產(chǎn)量[21-24]。多酶級聯(lián)被廣泛地應用于有機合成領域[25-30]，包括苯丙酸類化合物的合成，如酪氨酸衍生物[31-34]和苯丙氨酸衍生物[35]等。盡管上述策略可以合成一些苯丙酸類化合物，但是目前鮮有多酶級聯(lián)合成β-酪氨酸的文章報道。

C—H 功能化介導的小分子不對稱組裝是合成非天然氨基酸最具潛力的合成途徑。因此，通過生物催化逆合成分析可知，(R)-β-酪氨酸可由L-酪氨酸通過α-NH2變位獲得，而L-酪氨酸可通過苯酚、丙酮酸和游離銨根的C—C 偶聯(lián)和選擇性氨化獲得。于是，基于小分子不對稱組裝，本研究設計了如圖2 所示的級聯(lián)路徑：首先利用酪氨酸酚裂解酶(TPL)將苯酚、丙酮酸和NH+4轉(zhuǎn)化為具有α-NH2的L-酪氨酸；隨后，再通過引入酪氨酸氨基變位酶(TAM)將L-酪氨酸的α-NH2轉(zhuǎn)變?yōu)棣?NH2生成(R)-β-酪氨酸。本研究將酪氨酸酚裂解酶(TPL)和酪氨酸氨基變位酶(TAM)級聯(lián)，以苯酚、丙酮酸和銨鹽等廉價化合物為底物，合成了(R)-β-酪氨酸，為(R)-β-酪氨酸的綠色酶法生產(chǎn)提供了理論指導。

圖2 合成(R)-β-酪氨酸級聯(lián)路徑設計Fig.2 Design the cascade route for the synthesis of(R)-β-tyrosine

1 實驗材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 所用的克隆宿主(Escherichia coliJM109)和表達宿主(Escherichia coliBL21)購自Invitrogen公司；Citrobacter freundii菌株為本實驗室保藏。所用的質(zhì)粒包括單T7lac 啟動子(pET28a)和雙T7lac 啟動子(pRSFDuet-1、pACYCDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1)，均購自Invitrogen公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母粉，10 g/L NaCl；121℃滅菌15 min。

TB 培養(yǎng)基：12 g/L 蛋白胨，24 g/L 酵母粉，4 g/L甘油，2.31 g/L KH2PO4，12.54 g/L K2HPO4；121℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑 使用限制性內(nèi)切酶、DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、DNA Maker 和SDS-PAGE Protein Marker 等購自TaKaRa(大連)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、抗生素、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、磷酸吡哆醛(PLP)、Tris購自生工生物工程(上海)股份有限公司；基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；酵母粉、蛋白胨購自英國OXIOD 公司；苯酚、丙酮酸鈉、L-酪氨酸、(R)-β-酪氨酸購自上海阿拉丁生化有限公司；PCR 引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；其他試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 儀器 所使用的主要儀器有：Agilent 1260高效液相色譜、恒溫培養(yǎng)箱、SpetraMax M3多功能酶標儀、超凈工作臺、XD-650D 超聲破碎儀、BIORAD Thermal Cycler PCR 儀、核酸電泳儀、Invitrogen iBright智能成像系統(tǒng)、全自動凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2 重組菌的構(gòu)建

1.2.1 DNA 基本操作 基因組的提取、質(zhì)粒提取、酶切、連接、定點突變、感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化等按照試劑盒的說明書進行相關(guān)操作。

1.2.2 重組菌株的構(gòu)建 單酶表達菌株構(gòu)建方法：(1)基因組提?。?2)PCR 擴增目的片段；(3)表達載體提??；(4)雙酶切和膠回收；(5)酶切回收片段的連接；(6)測序驗證；(7)提取測序正確的重組質(zhì)粒，導入宿主菌；(8)蛋白電泳和酶活檢測，驗證目的基因是否正確表達。

共表達菌株的構(gòu)建方法：擴增TcTAMC107S,L104A基因，用EcoRI和SalI雙酶切pETDuet-1質(zhì)粒和擴增出的TcTAMC107S,L104A基因片段，然后經(jīng)過連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pETDuet-1-TcTAMC107S,L104A。 接下來擴增TPLM379V基因，用BglII 和XhoI 雙酶切pETDuet-1-TcTAMC107S,L104A質(zhì)粒和擴增出的TPLM379V基因片段，然后經(jīng)過連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pETDuet-1-TcTAMC107S,L104ACfTPLM379V。隨后用EcoRI和XhoI分別雙酶切表達質(zhì)粒pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1 以及重組質(zhì)粒pETDuet-1-TcTAMC107S,L104A-CfTPLM379V。將得到的TcTAMC107S,L104A-CfTPLM379V基因片段，與具有相同黏性末端的表達質(zhì)粒片段分別進行連接。隨后，把構(gòu)建好的重組質(zhì)粒分別導入表達宿主，成功構(gòu)建四種重組表達菌株。

重復表達菌株的構(gòu)建：擴增TcTAMC107S,L104A基因，用SalI和HindIII雙酶切pRSFDuet-1-TcTAMC107S,L104ACfTPLM379V質(zhì)粒和擴增出的TcTAMC107S,L104A基因片段，然后經(jīng)過連接構(gòu)建了重復表達質(zhì)粒：pRSFDuet-1-TcTAMC107S,L104A-TcTAMC107S,L104A-CfTPLM379V。隨后，把構(gòu)建好的重組質(zhì)粒導入表達宿主，構(gòu)建TcTAMC107S,L104A重復表達的工程菌。

所使用的引物如表1 所示，所構(gòu)建的表達菌株如表2所示。

表1 所使用的引物Table 1 The primers used in this study

表2 所構(gòu)建的重組菌株Table 2 The recombinant strains constructed in this study

1.2.3 重組菌株的培養(yǎng)方法 從平板中挑取重組大腸桿菌單菌落，接種至LB 培養(yǎng)基中，根據(jù)表達載體的抗性基因，添加適宜的抗生素(100 mg/L 氨芐霉素、50 mg/L 氯霉素、50 mg/L 卡那霉素、50 mg/L 鏈霉素或者它們的組合；過濾除菌)。在200 r/min、37℃條件下培養(yǎng)8 h 后，轉(zhuǎn)接至含相同抗生素的100 ml的TB 培養(yǎng)基中(接種量1%)。在相同條件下培養(yǎng)至菌種OD600為0.6～0.8 時，在培養(yǎng)基中加入過濾除菌后的IPTG(終濃度為0.4 mmol/L)進行誘導。然后將培養(yǎng)溫度降至20～25oC 進行誘導，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，待蛋白充分表達，離心收集濕菌體。

1.3 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

(1)溫度優(yōu)化：在25、30 和37oC 的溫度條件下分別進行轉(zhuǎn)化實驗，考察轉(zhuǎn)化溫度對(R)-β-酪氨酸產(chǎn)量的影響，確定最優(yōu)轉(zhuǎn)化溫度。1 ml反應體系：苯酚1 mmol/L、丙酮酸鈉2 mmol/L、氯化銨8 mmol/L、PLP 50 μmol/L、E. coliS10 濕菌體50 g/L、Tris-HCl 緩沖液(pH 8.0，含5% DMSO)100 mmol/L。于200 r/min反應2 h 后，12000 r/min 離心10 min，通過HPLC 檢測上清液中(R)-β-酪氨酸的濃度。

(2)pH 優(yōu)化：在pH 7.0～10.0 的條件下分別進行轉(zhuǎn)化實驗，考察轉(zhuǎn)化pH對(R)-β-酪氨酸產(chǎn)量的影響，確定最優(yōu)轉(zhuǎn)化pH。1 ml反應體系：苯酚1 mmol/L、丙酮酸鈉2 mmol/L、氯化銨8 mmol/L、PLP 50 μmol/L、E. coliS10 濕菌體50 g/L、Tris-HCl 緩沖液(pH 7.0～10.0，含5% DMSO)100 mmol/L。于25℃和200 r/min反應2 h 后，12000 r/min 離心10 min，通過HPLC 檢測上清液中(R)-β-酪氨酸的濃度。

(3) 菌體濃度優(yōu)化：在10～50 g/L 菌體濃度下分別進行反應，考察菌體用量對(R)-β-酪氨酸產(chǎn)量的影響，確定最優(yōu)菌體濃度。1 ml 反應體系：苯酚1 mmol/L、丙酮酸鈉2 mmol/L、氯化銨8 mmol/L、PLP 50 μmol/L、E.coliS10 濕菌體10～50 g/L、Tris-HCl 緩沖液(pH 9.0，含5% DMSO)100 mmol/L。于25℃、200 r/min 反應2 h 后，12000 r/min 離心10 min，通過HPLC檢測上清液中(R)-β-酪氨酸的濃度。

1.4 分析檢測方法

1.4.1 酶活檢測

(1)PAL 活力檢測：將10 mg 表達PAL 的大腸桿菌全細胞加入到1 ml(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)包含70 mmol/L 苯酚、140 mmol/L 丙酮酸鈉、560 mmol/L 氯化銨、50 μmol/L PLP 的反應體系中檢測酶活。于25℃反應5 min 后，12000 r/min 離心10 min取上清液，通過HPLC 檢測L-酪氨酸生成量。酶活單位(1 U)：在單位時間(1 min)內(nèi)生成1 μmol L-酪氨酸所需的酶量。

(2)TAM 活力檢測：將10 mg表達TAM 的大腸桿菌全細胞加入到1 ml(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)包含2 mmol/L L-酪氨酸的反應體系中檢測酶活。于25℃反應5 min 后，12000 r/min 離心10 min 取上清液，用HPLC 檢測(R)-β-酪氨酸生成量。酶活單位(1 U)：在單位時間(1 min)內(nèi)生成1 μmol(R)-β-酪氨酸所需的酶量。

1.4.2 產(chǎn)物濃度和對映選擇性分析

(1)濃度的測定：取轉(zhuǎn)化液12000 r/min 離心10 min，收集上清液，HPLC 測定L-酪氨酸和(R)-β-酪氨酸的含量。檢測條件：色譜柱：Agilent SB-AQ C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：10 mmol/L KH2PO4溶液(pH 5.3)；流動相B：乙腈/甲醇/A相=5∶3∶1(體積比；pH 5.3)；流速：1 ml/min；柱溫：35℃；熒光檢測器：激發(fā)波長330 nm，發(fā)射波長465 nm。

(2) ee 值的測定：取轉(zhuǎn)化液12000 r/min 離心10 min，收集上清液，HPLC 測定L-酪氨酸和(R)-β-酪氨酸的ee 值。檢測條件：色譜柱：Daicel Crownpak CR-I(+)(150 mm×3 mm，5 μm)；流動相：高氯酸溶液/乙腈(80/20，體積比；pH 1.5)；流速：0.4 ml/min；柱溫：25℃；紫外檢測器：波長為210 nm。

1.4.3 產(chǎn)物純化和產(chǎn)物鑒定 首先通過Dowex 50WX8 型陽離子交換樹脂進行離子交換，得到的離交物為氨基酸混合物。然后，用磷酸鹽緩沖液(90 mmol/L，pH 7.0)溶解離交物，將得到的溶液與二氯甲烷溶液(含1 mmol/L 雙三苯基磷二氯化鈀)混合，體積比為1∶1。對混合溶液進行攪拌(12 h，6℃)，然后進行沉降(大于30 min)分層，取水相凍干，再用乙醇溶液(90%)洗滌得到固體即可得到純化產(chǎn)物。最后，使用高分辨質(zhì)譜(HRMS)確定純化產(chǎn)物的分子量是否與目標化合物一致，并使用核磁共振譜圖(NMR)鑒定純化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)是否正確。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 TPL酶的挖掘

由于本研究設計的級聯(lián)催化是由兩個酶組成，任意一個酶存在缺陷均會影響級聯(lián)反應的催化效率。因此，需要篩選高效率的目標酶元件。本研究通過對Brenda數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘和基因挖掘，篩選了6種不同來源的TPL(表3)。通過對比分析這六種來源的TPL的比酶活，發(fā)現(xiàn)來源于弗式檸檬桿菌(Citrobacter freundii)的TPL比酶活最高，為10.01 μmol/(min·mg)。根據(jù)文獻報道，Seisser 等[36]對CfTPL 進行了蛋白質(zhì)工程改造，通過以結(jié)構(gòu)為導向的改造獲得了突變體CfTPLM379V，該突變體具有較寬的底物譜，可以催化一系列的苯酚衍生物，具有較好的轉(zhuǎn)化率(幾乎完全轉(zhuǎn)化)和對映選擇性(ee 值>97%)。因此，本研究選擇CfTPLM379V作為第一步反應的催化劑，來轉(zhuǎn)化苯酚、丙酮酸和氯化銨合成L-酪氨酸。首先以C.freundii的基因組作為模板進行擴增，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-CfTPL。然后再以pET28a-CfTPL 為模板，進行定點突變，構(gòu)建突變體質(zhì)粒pET28a-CfTPLM379V，并通過基因測序驗證突變點是否準確引入目標位點。將測序正確的重組載體導入表達宿主E. coliBL21 DE3，獲得表達CfTPLM379V基因的重組大腸桿菌，命名為E.coliS01。為了驗證目標蛋白是否能夠正常表達，對E.coliS01 進行了培養(yǎng)和誘導，收集菌體后進行全細胞蛋白電泳。結(jié)果如圖3 所示，CfTPLM379V在電泳圖上顯示出清晰的條帶，與目標蛋白大小相符(約51.5 kDa)，且酶活測試顯示E. coliS01 濕細胞對苯酚的催化活力為0.086 U/mg，說明CfTPLM379V正確表達。

圖3 蛋白電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis

表3 不同來源的TPL及其比酶活對比Table 3 Comparison of TPLs from different strains and its specific enzyme activity

2.2 TAM酶的挖掘

通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)關(guān)于TAM 酶的報道比較少。來源于球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)[43]的SgTAM 催化效率和對映選擇性較低，盡管該酶能夠催化L-酪氨酸及其類似物，但會生成香豆酸及其類似物等副產(chǎn)物。番紅軟骨(霉)菌(Chondromyces crocatus)[44]來源的CcTAM 對映選擇性較差；經(jīng)過改造的突變體CcTAME399K[45]可將ee 值從70%提高到97%，但卻大大降低了酶活。來源于水稻(Oryza sativa)[46]的OsTAM 具有對映選擇性高、副產(chǎn)物少的優(yōu)點，但其催化活性不高。而來源于南方紅豆杉(Taxus chinensis)的TcTAM 具有良好的對映選擇性，其改造后的突變體TcTAMC107S[47]對L-酪氨酸也表現(xiàn)出相對較好的催化活性。相關(guān)TAM 酶性質(zhì)匯于表4。因此，通過活性和選擇性的綜合對比，選擇TcTAMC107S作為多酶級聯(lián)的第二步反應的酶。由于TcTAMC107S來源于紅豆杉，不便于基因擴增，因此根據(jù)E.coliBL21(DE3)表達系統(tǒng)的密碼子偏好性，對編碼TcTAMC107S的基因進行密碼子優(yōu)化，通過全合成獲得重組質(zhì)粒pET28a-TcTAMC107S。將合成的重組質(zhì)粒導入表達宿主E. coliBL21 DE3，獲得表達TcTAMC107S基因的重組大腸桿菌，命名為E.coliS02。為了驗證目標蛋白是否能夠正常表達，通過全細胞蛋白電泳考察E. coliS02 的蛋白表達情況，結(jié)果如圖3 所示，可清晰地觀察到TcTAMC107S的蛋白條帶，大小約75.2 kDa，與蛋白膠結(jié)果相符，說明TcTAMC107S正確表達。隨后的酶活測試顯示E. coliS02 濕細胞對L-酪氨酸的催化活力為0.004 U/mg。通過酶活數(shù)據(jù)對比分析發(fā)現(xiàn)，TcTAMC107S的酶活力遠小于CfTPLM379V，轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)也表明L-酪氨酸的催化效率較低。為了提高TcTAMC107S的催化效率，以高效地合成(R)-β-酪氨酸，遂對TcTAMC107S進行了蛋白質(zhì)工程改造。如圖4 所示，通過結(jié)構(gòu)分析可以發(fā)現(xiàn)，TcTAM 結(jié)構(gòu)(PDB ID:3NZ4)中的L104 殘基與含苯環(huán)的底物香豆酸(TCA)存在空間沖突，那么該位點對更大體積的對香豆酸的空間沖突將更嚴重。為了消除空間位阻，本研究選擇用具有較小側(cè)鏈的氨基酸(纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸)來替代L104殘基，成功構(gòu)建了三株突變菌株E. coliS03～S05。最優(yōu)突變體TcTAMC107S,L104A(E. coliS04)對L-酪氨酸底物的初始反應速率達到59.8 μmol/(L·min)，比TcTAMC107S(4.6 μmol/(L·min))提高了13倍。

2.3 路徑組裝構(gòu)建全細胞催化劑

全細胞催化劑使用方便，無須對酶進行分離純化，大大降低了成本。因此，將篩到的兩個酶元件組裝到一個菌株中，構(gòu)建全細胞催化劑。首先，通過四個不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒(pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1 和 pRSFDuet-1) 對TcTAMC107S,L104A和CfTPLM379V的表達進行整體的調(diào)控。成功構(gòu)建了四株共表達CfTPLM379V和TcTAMC107S,L104A重組菌株，將這四株菌株命名為E.coliS06～S09。通過全細胞蛋白電泳考察E. coliS06～S09 的蛋白表達情況，結(jié)果如圖5(a)所示，可清晰地觀察到兩條目標蛋白條帶，表明CfTPLM379V和TcTAMC107S,L104A共表達成功。隨后，以苯酚、丙酮酸鈉和氯化銨為底物，考察這四株菌株合成(R)-β-酪氨酸的能力。結(jié)果如圖5(b)所示，在所構(gòu)建的四株重組菌株中，E.coliS09的轉(zhuǎn)化效果最好，但是最終轉(zhuǎn)化率僅有62.1%。由上述結(jié)果可知，造成轉(zhuǎn)化效率低的原因是TcTAMC107S,L104A的酶活較低。因此，為了進一步提高TcTAMC107S,L104A的酶活，基于E.coliS09 菌株重復表達TcTAMC107S,L104A基因以提高其表達量，構(gòu)建了菌株E.coliS10，該菌株的轉(zhuǎn)化率達到了74.0%。

圖5 (R)-β-酪氨酸合成菌株的構(gòu)建Fig.5 Construction of(R)-β-tyrosine synthesis strain

隨后，對轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化以進一步提高轉(zhuǎn)化率(圖6)，主要包括：溫度、pH 與菌體濃度等條件的優(yōu)化。首先考察了轉(zhuǎn)化溫度對轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果表明當轉(zhuǎn)化溫度為25℃時的轉(zhuǎn)化率最高，達到了64%[圖6(a)]；接下來在pH 7.0～10.0 的范圍內(nèi)考察pH 對轉(zhuǎn)化率的影響，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)pH 為9.0，此時轉(zhuǎn)化率達到了73%[圖6(b)]；最后考察了菌體濃度對轉(zhuǎn)化率的影響，在菌體濃度為50 g/L 時達到最大轉(zhuǎn)化率(75%)[圖6(c)]。因此，確定了最佳的轉(zhuǎn)化條件為：pH 9.0 (含5% DMSO)，50 g/LE. coliS10 濕菌體，轉(zhuǎn)化溫度為25℃。最后，將底物苯酚濃度提升到20 mmol/L，在上述的最適條件進行轉(zhuǎn)化，(R)-β-酪氨酸合成曲線如圖7 所示，(R)-β-酪氨酸的產(chǎn)量在24 h 后達到最大值2.7 g/L，轉(zhuǎn)化率為78%，ee 值為99%。轉(zhuǎn)化率不能達到接近完全轉(zhuǎn)化，主要是由于TAM 催化效率不足。因為在以L-酪氨酸作為底物時，TAM 所催化的反應轉(zhuǎn)化率僅為40%～62%(表4)，而級聯(lián)催化可以使得整體轉(zhuǎn)化效率提升到76%。經(jīng)過多酶之間的協(xié)同合作，促使反應朝向終產(chǎn)物進行，有助于提高整體轉(zhuǎn)化效率和最終產(chǎn)量[21]。

圖6 (R)-β-酪氨酸合成條件優(yōu)化Fig.6 Condition optimization for(R)-β-tyrosine synthesis

圖7 (R)-β-酪氨酸合成過程曲線Fig.7 The time course of(R)-β-tyrosine synthesis process

2.4 全細胞催化合成(R)-β-酪氨酸

將(R)-β-酪氨酸合成體系放大到1 L，以進一步評估本研究設計的多酶級聯(lián)催化系統(tǒng)的合成潛力。以50 g/LE. coliS10 濕細胞為催化劑，以20 mmol/L苯酚為底物，經(jīng)過24 h的轉(zhuǎn)化，以78%的轉(zhuǎn)化率合成了(R)-β-酪氨酸(ee 值99%)。然后對產(chǎn)物進行分離純化，(R)-β-酪氨酸的分離收率為63%，所得樣品為白色固體，純度為95%。隨后通過HRMS 和NMR 對純化獲得的產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)分析鑒定。首先使用HRMS對產(chǎn)物的分子量進行鑒定，由于使用的是陰離子色譜，產(chǎn)物的羧基在堿性溶液中電解為—COO-，故得到的是理論分子量減一的產(chǎn)物峰，為180.0654[圖8(a)]。在確定分子量正確之后，又通過NMR，鑒定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，鑒定時使用含有NaOD 的D2O 溶液溶解樣品進行NMR分析，活潑氫在這種檢測條件下是不出峰的，因此H 譜只有4 個峰[圖8(b)]，按照產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，分析C 譜應出7 個峰[圖8(b)]。結(jié)果表明純化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和分子量均與目標產(chǎn)物分子相符合。與目前文獻中報道的(R)-β-酪氨酸合成水平相比(ee值>95%，產(chǎn)物得率為53%～63%)[17-18]，本研究設計的方法具有較好的轉(zhuǎn)化率(78%)和選擇性(99%)，為(R)-β-酪氨酸的綠色高效生產(chǎn)提供了理論指導。

圖8 (R)-β-酪氨酸的鑒定Fig.8 Identification of(R)-β-tyrosine

3 結(jié) 論

(1)開發(fā)了生物酶法綠色合成β-酪氨酸及其衍生物的路線?；贑-H 功能化介導的小分子不對稱組裝，通過生物催化逆合成分析設計了兩步級聯(lián)反應合成(R)-β-酪氨酸。該反應以價格低廉、簡單易得苯酚、丙酮酸和氯化銨為底物，具有較好的成本優(yōu)勢。

(2)通過數(shù)據(jù)庫挖掘和蛋白質(zhì)工程改造篩選了性能優(yōu)良的酶元件?；跀?shù)據(jù)挖掘和基因挖掘分別獲得了初始酶元件，并通過蛋白質(zhì)工程改造提高TAM 對底物的催化效率。通過雙酶共表達和表達水平調(diào)控，構(gòu)建了全細胞催化劑。

(3)通過表達水平調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，進一步提高了(R)-β-酪氨酸的生產(chǎn)性能。在1 L 規(guī)模制備級轉(zhuǎn)化實驗中，最優(yōu)菌株E. coliS10 可生產(chǎn)2.7 g/L(R)-β-酪氨酸，轉(zhuǎn)化率達到了78%，ee 值為99%，收率為63%。本研究為(R)-β-酪氨酸的綠色酶法生產(chǎn)提供了理論指導。