嚴(yán)勇 孫洵 馬紹翔 鄭昕 王亮 李勇 王珂

膀胱癌是泌尿系最常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有治療后復(fù)發(fā)率高、死亡率高的特點(diǎn)，其在我國(guó)泌尿系腫瘤中的發(fā)病率及死亡率均為首位，近年來(lái)其發(fā)病率和死亡率有所下降[1]。而造成膀胱癌患者死亡的主要原因是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。進(jìn)入外周血并能存活的腫瘤細(xì)胞是循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTC)，其在一定條件下能在遠(yuǎn)處定植而形成遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移灶，因此，CTC是腫瘤能進(jìn)行血行轉(zhuǎn)移的前提。早期檢測(cè)外周血CTC對(duì)評(píng)估患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、疾病預(yù)后以及治療手段的選擇具有重要意義[3]。本研究聯(lián)合運(yùn)用多種標(biāo)志物，優(yōu)選了免疫芯片分選法，檢測(cè)膀胱癌患者外周血中的CTC，并分析CTC的表達(dá)與不同病理分期膀胱癌患者的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、臨床資料

收集2019年9月至2021年3月在昆明市第一人民醫(yī)院就診的不同病理分期的膀胱癌患者20例，其中男14例，女6例；年齡46～90歲，平均年齡(65.4±7.4)歲，均為膀胱尿路上皮細(xì)胞癌。T1期2例，T2期9例，T3期6例(2例合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，T4期3例(均合并有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)；腫瘤直徑≤3 cm者12例，直徑>3 cm者8例；單發(fā)9例，多發(fā)11例；患者均無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及其他惡性腫瘤，均未接受過(guò)放化療。本研究通過(guò)了醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有患者或家屬均簽署了知情同意書(shū)。

二、治療方案

所有膀胱癌患者均按照指南要求治療，非肌層浸潤(rùn)患者采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)，術(shù)后常規(guī)進(jìn)行表柔比星灌注治療，表柔比星溶于0.9%氯化鈉溶液，濃度為 600 μg/ml，灌注后膀胱內(nèi)維持45 min～1 h，方案為1次/周，灌注8周，之后 1 次/月，灌注8個(gè)月；肌層浸潤(rùn)患者采用根治性膀胱切除術(shù)+尿流改道/原位新膀胱+淋巴結(jié)清掃術(shù)。所有患者均于術(shù)前行CTC檢測(cè)。

三、CTC的檢測(cè)及陽(yáng)性判定

采集不同病理分期膀胱癌患者外周靜脈血10 ml，裂解紅細(xì)胞后去上清液，重懸，微流體芯片中推入EDTA、PBS和小牛血清白蛋白。將血樣推入另一螺旋微通道入口，加入一抗混合液(CK8/18/19，CD45)、二抗混合液(Alexa488及Alexa555)后，再加入核染試劑(DAPI)孵育，電子顯微鏡下觀察捕獲的細(xì)胞，CK、Alexa488(+)/CD45、Alexa555(-)判定為陽(yáng)性并予以計(jì)數(shù)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以頻數(shù)表示計(jì)數(shù)資料，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或者Fisher確切概率法，多因素分析采用Logistic回歸分析檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

20例患者中有11例檢出CTC，陽(yáng)性率為55%(11/20)，CTC的計(jì)數(shù)為1～33個(gè)，1個(gè)CTC的患者有3例，2～8個(gè)CTC的患者有5例，8個(gè)以上的有3例。單因素分析顯示，CTC的陽(yáng)性率在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者中明顯高于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者；在病理分級(jí)高級(jí)別的患者中較低級(jí)別的患者陽(yáng)性率高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽(yáng)性率高；多發(fā)腫瘤者較單發(fā)者陽(yáng)性率高；腫瘤直徑>3 cm者較直徑≤3 cm者陽(yáng)性率高?；颊咝詣e、年齡則與CTC的陽(yáng)性率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。多因素Logistic回歸分析顯示，腫瘤高T分期(OR：T22.21、T34.15、T46.46)、病理分級(jí)高級(jí)別(OR：1.72)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OR：4.87)和腫瘤直徑>3 cm(OR：6.84)是CTC陽(yáng)性的危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表2。

表1 膀胱癌患者病理特征與CTC陽(yáng)性率的關(guān)系

表2 多因素Logistic回歸分析

討 論

有研究表明膀胱腫瘤中非肌層浸潤(rùn)型占70%[4]，其治療后復(fù)發(fā)率高達(dá)78%，進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)為45%，保留膀胱治療后的死亡率為16%～23%[5]；而肌層浸潤(rùn)型則占30%[4]，即使行根治性膀胱全切術(shù)，其術(shù)后5年局部復(fù)發(fā)率仍可達(dá)20%，其中約50%的患者會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶或最終死亡，其主要原因?yàn)?0%的患者在確診時(shí)、手術(shù)前已存在微轉(zhuǎn)移灶[6]。但目前傳統(tǒng)影像學(xué)檢查并不能較早發(fā)現(xiàn)這些微小體積的轉(zhuǎn)移灶，也沒(méi)有一種公認(rèn)的可應(yīng)用于早期檢測(cè)這些微轉(zhuǎn)移灶的生物學(xué)標(biāo)志物。因此，臨床上需要一種能精確檢測(cè)這些微轉(zhuǎn)移灶的新方法，以期早期診斷并指導(dǎo)治療，從而提高膀胱癌的臨床療效，減少腫瘤進(jìn)展和降低復(fù)發(fā)率。

從1869年首次報(bào)道CTC存在于腫瘤患者的血液循環(huán)中，到現(xiàn)在CTC檢測(cè)逐漸被重視并廣泛采用，其檢測(cè)創(chuàng)傷小、特異性及靈敏度高，在臨床應(yīng)用中發(fā)揮了一定作用。CTC被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的最直接因素[7]，目前已有外周血CTC檢測(cè)用于乳腺癌、肺癌、直腸癌、前列腺癌等腫瘤的診斷和預(yù)后判斷的研究，并取得重大進(jìn)展[8-10]。因此，美國(guó)食品藥品管理局已允許CellSearch CTC檢測(cè)系統(tǒng)運(yùn)用于臨床，以監(jiān)測(cè)乳腺癌、前列腺癌、肺癌和直腸癌患者的預(yù)后[11]。而目前CTC檢測(cè)在膀胱癌中應(yīng)用的報(bào)道尚不多，關(guān)于非轉(zhuǎn)移膀胱癌的大宗前瞻性研究表明，即使外周血中僅出現(xiàn)1個(gè)CTC，也標(biāo)志著患者在腫瘤相關(guān)病死率、腫瘤復(fù)發(fā)及總生存率等方面預(yù)后較差[6]。另一項(xiàng)研究表明，每7.5 ml外周血中發(fā)現(xiàn)≥1個(gè)CTC的膀胱癌患者中87%的病例短期內(nèi)出現(xiàn)首次復(fù)發(fā)，并伴有病情進(jìn)展，而CTC陰性的患者則沒(méi)有出現(xiàn)疾病進(jìn)展[12]。Gazzaniga等[13]研究證實(shí)術(shù)前CTC陽(yáng)性率與膀胱腫瘤T1分期之間存在相關(guān)性，且CTC陽(yáng)性與非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌復(fù)發(fā)時(shí)間有關(guān)聯(lián)性。Anantharaman等[14]報(bào)道了肌層浸潤(rùn)性或轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者外周血中程序死亡配體基因-1(programmed death-ligand 1, PD-L1)表達(dá)于 CTC，所有25例患者均檢測(cè)出CTC和PD-L1，提示PD-L1在CTC中的表達(dá)情況將可能用于監(jiān)測(cè)膀胱腫瘤的治療效果和預(yù)后判斷。有薈萃分析表明，外周血CTC的檢出為膀胱腫瘤患者有無(wú)預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，因而可應(yīng)用于膀胱癌的診斷，而CTC的陽(yáng)性率與膀胱腫瘤的病理分期、有無(wú)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)[3]。這些研究均提示CTC與膀胱癌的病理分期有一定的相關(guān)性，對(duì)患者的療效評(píng)估、預(yù)后監(jiān)測(cè)和個(gè)體化治療均有較大意義。

本研究中，我們也得出了相似的結(jié)果，選用免疫芯片分選法檢測(cè)具有不同病理特征的T1～T4期膀胱腫瘤患者外周血CTC，并分析其不同病理特征與CTC陽(yáng)性率的相關(guān)性，結(jié)果提示CTC與腫瘤T分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及數(shù)目有相關(guān)性(P<0.05)；多因素分析顯示CTC與腫瘤T分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小有相關(guān)性(P<0.05)。故CTC的檢測(cè)有利于在不同病理特征膀胱癌患者中早期明確易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移者，從而準(zhǔn)確地評(píng)估病情、調(diào)整治療和判斷預(yù)后。但同樣也應(yīng)認(rèn)識(shí)到：腫瘤的轉(zhuǎn)移其實(shí)是個(gè)低效過(guò)程，即使進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞量大，真正能在遠(yuǎn)處定植成功的卻極少。其主要原因是CTC沒(méi)有了原位腫瘤的基質(zhì)依托，面臨著巨大生存壓力，包括血流剪切力、氧化應(yīng)激及免疫追殺等。因此，通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTC，則有助于盡早判斷復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移傾向、評(píng)判療效，便于臨床甄選合理、個(gè)體化的治療方案，以期提高臨床治療效果。但由于目前的檢測(cè)方法尚未完全統(tǒng)一，仍存在一定的假陰性或假陽(yáng)性可能，且本研究也存在樣本量小的不足，因此，未來(lái)研究應(yīng)進(jìn)一步建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)質(zhì)量控制體系，以確保所有研究結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)的一致性；并早日進(jìn)行大規(guī)模、多中心的臨床研究，且可將CTC與其他生物標(biāo)志物如循環(huán)腫瘤DNA聯(lián)合檢測(cè),以進(jìn)一步提升其早期判斷預(yù)后、評(píng)估治療效果和調(diào)整治療策略的應(yīng)用價(jià)值[15]。相信在不久的將來(lái)，CTC檢測(cè)有望成為臨床膀胱腫瘤診斷、早期預(yù)后評(píng)估、療效評(píng)價(jià)及指導(dǎo)個(gè)體化治療無(wú)創(chuàng)、便捷的重要監(jiān)測(cè)手段，并在膀胱癌的綜合診療體系中展現(xiàn)出較大的應(yīng)用前景。