張 俊，汪浩鑫，陳夢佳，閆 茜，盧嘉卡，余 慶，石德順，陸鳳花

(廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004)

顆粒細(xì)胞(granulosa cells，GCs)在卵泡發(fā)育和閉鎖過程中起至關(guān)重要作用，一方面GCs控卵泡閉鎖[1-8],另一方面GCs分泌雌激素，雌激素能促進(jìn)卵泡發(fā)育和抑制GCs凋亡，卵泡的發(fā)育閉鎖與GCs狀態(tài)密切相關(guān)[9-11]。以卵泡內(nèi)膜細(xì)胞分泌雄激素作為底物，在雌激素合成關(guān)鍵酶細(xì)胞色素芳香化酶(CYP19A1)作用下，同時(shí)在促卵泡素(FSH)調(diào)控下，GCs合成雌激素雌二醇促進(jìn)卵泡生長[12-14]。

卵巢內(nèi)雄激素主要是雄烯二酮和睪酮，在細(xì)胞色素17β羥類固醇脫氫酶(17β-HSD)作用下，雄烯二酮可轉(zhuǎn)化為睪酮。有研究報(bào)道睪酮可通過激活PI3K/AKT/FOXO3信號(hào)通路誘導(dǎo)小鼠原始卵泡的激活[15]。有研究指出睪酮能促進(jìn)牛卵巢初級(jí)卵泡向次級(jí)卵泡的轉(zhuǎn)變，且直接通過睪酮受體發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用[16]。也有研究表明睪酮可直接通過其受體發(fā)揮作用，通過提高間隙連接蛋白CX37表達(dá)促進(jìn)小鼠卵巢發(fā)育[17]。但睪酮對(duì)水牛GCs雌激素合成的影響，目前尚未見有報(bào)道。本研究通過在水牛GCs培養(yǎng)液中添加睪酮，探討睪酮對(duì)水牛GCs雌激素合成相關(guān)基因表達(dá)和雌二醇分泌水平的影響，進(jìn)而研究睪酮對(duì)水牛GCs雌激素合成能力的影響，以期從雌激素合成角度為進(jìn)一步研究水牛卵泡發(fā)育雌激素分泌機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及配制睪酮(testosterone，Tes)購自Solarbio公司；DMEM和血清(FBS)購自Gibco公司；其他試劑無特別說明均購自Sigma公司。細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM+10%FBS+60 mg/L青霉素+100 mg/L鏈霉素，并用0.22 μm微孔濾器過濾。

1.2 材料來源及處理

1.2.1水牛卵巢的收集 從南寧市屠宰場收集中國沼澤型水牛卵巢，收集后放置盛有37℃生理鹽水的保溫瓶，確保2～3 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。用眼科剪刀將卵巢周圍的脂肪組織去除，用一次性12號(hào)10 mL注射器抽取直徑2～6 mm卵泡(大卵泡閉鎖比例較高，小卵泡發(fā)育程度較低)的卵泡液，將卵泡液移至60 mm玻璃皿，體式顯微鏡下觀察卵泡液中GCs狀態(tài)，注意只選取來源于健康卵泡的水牛GCs進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2水牛GCs的分離培養(yǎng) 將抽取卵泡液用孔徑40 μm細(xì)胞篩過濾，并收集到離心管，1 200 r/min離心5 min，棄上清后用雙抗鹽酸鹽緩沖液(PBS)重懸清洗細(xì)胞，離心再用PBS重懸，如此反復(fù)1次，最后將清洗干凈的水牛GCs接種至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。選取第1代生長狀態(tài)良好水牛GCs，傳至12孔板4個(gè)孔中，確保每孔細(xì)胞貼壁后匯合度至少達(dá)到80%，進(jìn)行后續(xù)睪酮處理相關(guān)試驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞免疫熒光將水牛原代GCs接種到四孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，再加4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min；用阻斷液(含100 mmol/L甘氨酸和0.3%BSA的PBS)清洗3次，然后加入1%Tritonx-100室溫透化15 min；再用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉2 h；用TBP(Tritonx-BSA-PBS)清洗3次，加入一抗4℃孵育過夜；第2天室溫孵育30 min，用TBP清洗3次，加入二抗室溫孵育1 h；用TBP清洗3次，然后在熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.4 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量RT-PCR使用TRIzol試劑裂解已收集的水牛GCs，氯仿和異丙醇抽提，75%酒精清洗，DEPC水溶解即得到細(xì)胞總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅲ RT Super Mix合成cDNA，然后用SYBP Premix Ex TaqTMⅡ試劑進(jìn)行qRT-PCR。本研究所用引物序列如表1所示，使用GAPDH作為內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化其他基因表達(dá)。

表1 水牛GCs qRT-PCR引物序列及條件反應(yīng)

1.5 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)檢測水牛GCs培養(yǎng)液中雌激素雌二醇的分泌水平。將水牛GCs培養(yǎng)液收集后，按照ELISA試劑盒說明書(江蘇晶美生物科技有限公司)要求進(jìn)行樣品的預(yù)處理和后續(xù)試驗(yàn)步驟，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度值。根據(jù)所做標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得出水牛GCs培養(yǎng)液雌二醇的含量。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)1：本試驗(yàn)主要探討細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度睪酮對(duì)水牛GCs雌激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響。將處于相同細(xì)胞來源和生長狀態(tài)的水牛GCs分別在添加不同濃度睪酮(0，10-9，10-7，10-5mol/L)的培養(yǎng)液中均處理48 h，檢測水牛GCs雌激素合成相關(guān)基因(CYP11A1、CYP19-A1、3β-HSD和17β-HSD)的表達(dá)情況。

試驗(yàn)2：本試驗(yàn)主要探討細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度睪酮對(duì)水牛GCs雌二醇分泌水平的影響。將處于相同細(xì)胞來源和生長狀態(tài)的水牛GCs分別在添加不同濃度睪酮(0，10-9，10-7，10-5mol/L)的培養(yǎng)液中均處理48 h，檢測水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇的分泌水平。

試驗(yàn)3：本試驗(yàn)主要探討細(xì)胞培養(yǎng)液中不同睪酮處理時(shí)間對(duì)水牛GCs雌激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響。將處于相同細(xì)胞來源和生長狀態(tài)的水牛GCs分別在添加睪酮濃度10-7mol/L的培養(yǎng)液中處理不同時(shí)間(0，24，48，72 h)，檢測水牛GCs雌激素合成相關(guān)基因(CYP11A1、CYP19A1、3β-HSD和17β-HSD)的表達(dá)情況。

試驗(yàn)4：本試驗(yàn)主要探討細(xì)胞培養(yǎng)液中不同睪酮處理時(shí)間對(duì)水牛GCs雌二醇分泌水平的影響。將處于相同細(xì)胞來源和生長狀態(tài)的水牛GCs分別在添加睪酮濃度10-7mol/L的培養(yǎng)液中處理不同時(shí)間(0，24，48，72 h)，檢測水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇的分泌水平。

1.7 數(shù)據(jù)分析利用SPSS 22.0軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并分析差異顯著性，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著，每個(gè)試驗(yàn)至少3次生物學(xué)重復(fù)(n=3)，即同一試驗(yàn)處理中用相互獨(dú)立的水牛GCs進(jìn)行至少3次重復(fù)。坐標(biāo)圖中柱狀圖上所標(biāo)字母不同均表示差異顯著(P<0.05)，所標(biāo)字母相同均表示差異不顯著(P>0.05)。

2 結(jié)果

2.1 水牛卵泡GCs的分離、培養(yǎng)和鑒定選擇直徑為2～6 mm的水牛卵泡用于分離水牛GCs(圖1A)。結(jié)果顯示：水牛原代GCs貼壁后呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞狀，傳代3次后，仍能保持典型GCs形態(tài)(圖1B)；免疫熒光試驗(yàn)表明水牛GCs表達(dá)其特異性蛋白FSHR(圖1C)。 由此說明，本研究所分離獲得細(xì)胞為高純度水牛GCs，可作為后續(xù)研究的試驗(yàn)材料。

A.直徑2～6 mm竇狀健康卵泡用于分離水牛GCs；B.原代水牛GCs以及第1～3代水牛GCs貼壁后細(xì)胞生長狀態(tài)；C.細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)顯示水牛GCs表達(dá)其特異性蛋白FSHR

2.2 睪酮處理濃度對(duì)水牛GCs雌激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響水牛GCs分別在添加不同濃度睪酮(0，10-9，10-7，10-5mol/L)的培養(yǎng)液中處理48 h后，qRT-PCR檢測水牛GCs雌激素合成相關(guān)基因(CYP11A1、CYP19A1、3β-HSD和17β-HSD)表達(dá)情況。結(jié)果顯示(圖2)：相比對(duì)照組(0 mol/L睪酮)，10-7mol/L睪酮處理組水牛GCs顯著上調(diào)雌激素合成相關(guān)基因CYP11A1、CYP19A1、3β-HSD和17β-HSD表達(dá)(P<0.05)，但10-5mol/L睪酮處理組水牛GCs顯著下調(diào)雌激素合成相關(guān)基因CYP19A1、3β-HSD和17β-HSD表達(dá)(P<0.05)。由此初步說明，水牛GCs培養(yǎng)液中睪酮處理濃度以10-7mol/L最佳。

圖2 qRT-PCR檢測睪酮不同處理濃度對(duì)水牛GCs雌激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3 睪酮處理濃度對(duì)水牛GCs雌激素分泌水平的影響水牛GCs分別在添加不同濃度睪酮(0，10-9，10-7，10-5mol/L)的培養(yǎng)液中處理48 h后，ELISA檢測水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇分泌水平情況。結(jié)果顯示(圖3)：相比對(duì)照組(0 mol/L睪酮)，10-7mol/L睪酮處理組顯著提高水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇的分泌水平(P<0.05)，但10-5mol/L睪酮處理組顯著降低水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇的分泌水平(P<0.05)。由此進(jìn)一步說明，水牛GCs培養(yǎng)液中睪酮最佳處理濃度為10-7mol/L。

圖3 ELISA檢測睪酮不同處理濃度對(duì)水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇分泌水平的影響

2.4 睪酮處理時(shí)間對(duì)水牛GCs雌激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響水牛GCs在添加睪酮濃度為10-7mol/L的培養(yǎng)液中處理不同時(shí)間(0，24，48，72 h)后，qRT-PCR檢測水牛GCs雌激素合成相關(guān)基因(CYP11A1、CYP19A1、3β-HSD和17β-HSD)表達(dá)情況。結(jié)果顯示(圖4)：相比對(duì)照組(睪酮處理時(shí)間0 h)，睪酮處理48和72 h組水牛GCs顯著上調(diào)雌激素合成相關(guān)基因CYP11A1、CYP19A1和3β-HSD表達(dá)(P<0.05)。由此初步說明，水牛GCs培養(yǎng)液中睪酮處理時(shí)間以48或72 h 最佳。

圖4 qRT-PCR檢測睪酮不同處理時(shí)間對(duì)水牛GCs雌激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5 睪酮處理時(shí)間對(duì)水牛GCs雌激素分泌水平的影響水牛GCs在添加睪酮濃度為10-7mol/L 的培養(yǎng)液中處理不同時(shí)間(0，24，48，72 h)后，ELISA檢測水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇分泌水平情況。結(jié)果顯示(圖5)：相比對(duì)照組(睪酮處理時(shí)間0 h)，睪酮處理48或72 h組顯著提高水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇的分泌水平(P<0.05)。由此進(jìn)一步說明，水牛GCs培養(yǎng)液中睪酮最佳處理時(shí)間是48 或72 h。

圖5 ELISA檢測睪酮不同處理時(shí)間對(duì)水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇分泌水平的影響

綜合上述：10-7mol/L睪酮處理水牛GCs 48或72 h有利于提高水牛GCs雌激素的合成能力。

3 討論

水牛是我國南方主要大家畜之一，因其具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐高溫耐高濕、抗病力強(qiáng)、耐粗飼易飼養(yǎng)、乳品價(jià)值高和使用年限長等生物學(xué)特性，而具有巨大經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[18-23]。然而目前水牛存在繁殖率低、種群生產(chǎn)性能低下等問題，因此，開展水牛卵泡發(fā)育激素分泌機(jī)制相關(guān)研究可為提高水牛繁殖力以及加快水牛遺傳改良步伐等提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。根據(jù)雙細(xì)胞-雙促性腺激素理論，卵巢內(nèi)雌激素主要由GCs分泌，卵泡在促黃體素的作用下，卵泡內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生睪酮進(jìn)入GCs，促卵泡素刺激GCs芳香化酶活性，在該酶催化下睪酮轉(zhuǎn)化為雌二醇。GCs合成雌激素是在促卵泡素調(diào)控下，細(xì)胞表達(dá)雌激素合成相關(guān)基因CYP11A1、CYP19-A1、3β-HSD和17β-HSD，其中CYP19A1編碼雌激素合成關(guān)鍵限速酶[13,24-28]。本研究結(jié)果表明，10-7mol/L睪酮處理水牛GCs 48或72 h，不但提高水牛GCs雌激素合成相關(guān)基因CYP11A1、CYP19A1和3β-HSD表達(dá)，而且促進(jìn)水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇分泌水平。該結(jié)果說明睪酮能提高水牛GCs雌激素的合成能力，這與內(nèi)膜細(xì)胞條件液影響水牛GCs雌激素合成能力的結(jié)果類似[29]。

水牛GCs和內(nèi)膜細(xì)胞互作的最新研究表明，水牛內(nèi)膜細(xì)胞條件液能促進(jìn)水牛GCs雌激素的合成能力，且水牛內(nèi)膜細(xì)胞主要分泌雄激素睪酮到內(nèi)膜細(xì)胞條件液中[30]。而本研究結(jié)果也顯示，睪酮能提高水牛GCs雌激素的合成能力，這更進(jìn)一步證實(shí)了水牛GCs和內(nèi)膜細(xì)胞互作的研究結(jié)果。但睪酮促進(jìn)水牛GCs雌激素合成的調(diào)控機(jī)理仍有待進(jìn)一步探討，特別是睪酮添加到水牛GCs培養(yǎng)液中，究竟是通過直接作用即增加了GCs雌激素合成芳香化酶作用的底物進(jìn)而促進(jìn)雌激素合成，還是通過間接作用即激活了GCs雌激素合成調(diào)控的相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)雌激素合成，這將是我們下一步重點(diǎn)研究的內(nèi)容。

同時(shí)，本研究指出睪酮能提高水牛GCs雌激素的合成，那么睪酮在水牛卵泡發(fā)育過程中，對(duì)水牛原始卵泡的體外激活、腔前卵泡的體外培養(yǎng)、卵母細(xì)胞的體外成熟甚至早期胚胎的體外發(fā)育是否會(huì)有影響，以及產(chǎn)生這些影響的調(diào)控機(jī)制，這些課題是我們更希望探究的。相信隨著研究的逐漸深入和系統(tǒng)，雄激素調(diào)控卵泡發(fā)育的相關(guān)研究結(jié)果，將為更進(jìn)一步研究水牛卵泡發(fā)育的激素調(diào)控規(guī)律奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。