陳文儀，周玲娜，張 玢

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科，江蘇 常州 213000)

染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常是導(dǎo)致出生缺陷的主要原因之一，目前無有效的治療方法[1]。因此，通過產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷，及時(shí)干預(yù)這類患兒的出生是出生缺陷防治工作的重點(diǎn)。羊水細(xì)胞染色體核型檢測作為產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，已經(jīng)被廣泛且成熟運(yùn)用了幾十年。然而，隨著染色體微陣列分析(CMA)技術(shù)運(yùn)用的擴(kuò)大化，2013年12月，美國婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(ACOG)和母嬰醫(yī)學(xué)協(xié)會(SMFM)共同發(fā)布了《CMA技術(shù)在產(chǎn)前診斷方面的應(yīng)用》指南[2]，此后，CMA技術(shù)在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域中的運(yùn)用也越來越廣泛。通過揭示標(biāo)準(zhǔn)核型分析無法檢測到的亞微觀失衡或拷貝數(shù)變異(CNVs)，CMA技術(shù)能提高1.7%～9.1%的額外致病性檢出率[3-6]。本院于2016年11月開展了單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片(SNP-Array)檢測平臺，為孕周24周以上孕婦提供產(chǎn)前診斷服務(wù)。本研究旨在分析歷年來常州地區(qū)產(chǎn)前診斷的結(jié)果，探討染色體異常分布及染色體微陣列分析在產(chǎn)前診斷中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 2006年4月至2020年8月來常州市婦幼保健院行產(chǎn)前診斷的孕婦5 624例，年齡16～60歲，孕周18～29+6周，所有孕婦自愿接受羊水細(xì)胞染色體核型分析和(或)CMA檢測，均至少滿足以下一個(gè)產(chǎn)前診斷的適應(yīng)證：預(yù)產(chǎn)期年齡大于或等于35歲的孕婦；血清學(xué)篩查和(或)無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測(NIPT)高風(fēng)險(xiǎn)；胎兒超聲異常；夫婦一方染色體異常；不良孕產(chǎn)史；醫(yī)師認(rèn)為存在有必要進(jìn)行產(chǎn)前診斷其他情況的孕婦。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有孕婦及家屬均知情同意。

1.2方法

1.2.1羊水采集 簽署相關(guān)知情同意書，完善術(shù)前檢查后，所有孕婦接受B 超引導(dǎo)下經(jīng)腹羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水25～30 mL，其中20 mL用于染色體核型分析，另5～10 mL根據(jù)穿刺指征及患者的知情同意，選擇CMA-750k 檢測。

1.2.2羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析 羊水細(xì)胞接種、培養(yǎng)、收獲、制片，上機(jī)進(jìn)行染色體核型分析，詳細(xì)過程已有報(bào)道[7-8]。

1.2.3CMA檢測 采用美國Affymetrix公司的CytoScan 750K array微陣列芯片進(jìn)行檢測。步驟嚴(yán)格按照操作手冊進(jìn)行，主要步驟：提取羊水中基因組DNA(QIAamp DNA提取試劑盒)、酶切、標(biāo)記、雜交、緩沖液清洗芯片、使用Alaser掃描儀掃描、使用染色體分析軟件包(ChAs)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果判讀參照DCV、ECIPHER、OMIM、ISCA 等國際基因組CNV數(shù)據(jù)庫。根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果判定分為3類(5級)[9]：良性CNV、致病性CNV、臨床意義不明性CNV(包括可能良性、可能致病性、不確定性)。

1.2.4隨訪 采用電話隨訪、住院病案查詢、產(chǎn)后1年內(nèi)新生兒體檢記錄查詢等方式，重點(diǎn)隨訪妊娠并發(fā)癥、新生兒身體發(fā)育情況等。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel2010版軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行排序篩查，結(jié)果計(jì)算為百分制。

2 結(jié) 果

2.1染色體異?？傮w情況 共有5 624位孕婦行羊水穿刺產(chǎn)前診斷，除去細(xì)胞生長不良和(或)羊水嚴(yán)重污染導(dǎo)致檢測失敗的57例，有效例數(shù)為5 567例。其中，主要產(chǎn)前診斷指征為血清學(xué)高風(fēng)險(xiǎn)和高齡，NIPT高風(fēng)險(xiǎn)和超聲異常次之。5 567例羊水共檢出異常結(jié)果515例，總異常率為9.25%。異常結(jié)果包括染色體核型數(shù)目異常、結(jié)構(gòu)異常和嵌合和(或)CMA非整倍體、致病性CNVs。僅單個(gè)指征時(shí)，NIPT高風(fēng)險(xiǎn)的檢出異常率最高，達(dá)49.19%。其次是單純夫婦染色體異常，異常率為36.79%。見表1。

表1 5 567例羊水指征分布與異常檢出結(jié)果[n(%)]

2.2羊水染色體核型分析結(jié)果 5 310例羊水核型分析中，45例生長不良，12例培養(yǎng)失敗，培養(yǎng)成功率為 98.93%。共檢出450例核型異常，總異常率為8.57%(450/5 253)。其中，染色體數(shù)目異常345例，結(jié)構(gòu)異常73例，嵌合31例。染色體數(shù)目異常包括:21-三體綜合征209例(60.76%)、18-三體綜合征60例(17.44%)、性染色體數(shù)目異常68例、13-三體綜合征4例、標(biāo)記染色體2例、9-三體綜合征1例、三倍體綜合征1例。染色體結(jié)構(gòu)異常包括平衡易位30例(41.10%)、羅氏易位18例(24.65%)、染色體增加10例(13.70%)等。見表2。

表2 5 253例羊水染色體核型分析

2.3羊水CMA分析結(jié)果 本研究中，僅1 773例羊水進(jìn)行CMA分析，其中有2例因母源性污染、培養(yǎng)失敗。1 771例CMA結(jié)果中，共檢出140例非整倍體，76例致病性CNV，總異常率為12.20%(216/1 771)。另檢出104例意義不明的CNV，4例可能良性CNV，6例可能致病性CNV，致病意義不明的拷貝數(shù)變異(VOUS)共113例，占比為6.37%。見表3。

表3 1 771例羊水CMA分析(n)

2.4核型分析和CMA分析結(jié)果比較 1 457例核型和CMA分析結(jié)果中，非整倍體共124例，均被檢出。核型分析檢測出11例嵌合，其中的2例嵌合(48,XN,+14,+18/46,XN、96,XXXX/69,XXY/46,XX)CMA未檢測出，1例45,X/46,X,+mar，CMA結(jié)果為Xp22.33del2Mb，其余9例CMA結(jié)果與之相對應(yīng)；另外核型分析檢出18例平衡性易位，2例衍生染色體，2例標(biāo)記染色體，但是CMA結(jié)果正常。與核型分析相比，CMA檢測出51例致病性CNV，包括50例微缺失微重復(fù)，1例單親二倍體，額外提高了致病性檢出率為3.50%(51/1 457)。見表4。

表4 1457例羊水染色體核型和CMA結(jié)果(n)

3 討 論

核型分析是診斷染色體異常的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其結(jié)果受分裂相數(shù)量、質(zhì)量、顯帶技術(shù)及操作人員技能的影響，且培養(yǎng)時(shí)間長，分辨率低，僅能檢測出10 Mb的片段；CMA可以檢測染色體非整倍體異常，包括微小拷貝數(shù)變異，但是不能檢測平衡性染色體重排及低比例的嵌合，價(jià)格昂貴，同時(shí)，臨床上如何解釋好VOUS仍是個(gè)難題。

本研究中值得注意的是，當(dāng)孕婦合并2種指征時(shí)，其異常檢出率明顯提高，尤其是高齡合并NIPT高風(fēng)險(xiǎn)的這類孕婦，異常檢出率高達(dá)81.44%。當(dāng)孕婦僅有一項(xiàng)產(chǎn)前診斷指征時(shí)，NIPT高風(fēng)險(xiǎn)的異常檢出率較高，達(dá)到49.19%。其次是單純夫婦染色體異常，異常率為36.79%。單純夫婦染色體異常的羊水結(jié)果大多數(shù)都是染色體結(jié)構(gòu)異常，并非嚴(yán)重致病或致命。因此，本研究希望臨床上針對滿足上述指征的孕婦，提供針對性的精細(xì)診療方案。

本研究團(tuán)隊(duì)對羊水核型分析的總異常核型檢出率有過持續(xù)報(bào)道，2012年異常核型檢出率為3.59%[7],2016年統(tǒng)計(jì)的總異常檢出率為5.49%[8]。本研究中，總異常檢出率上升至8.57%。分析主要原因可能是2012年本院引進(jìn)NIPT技術(shù)，NIPT的臨床運(yùn)用大大提高了產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常檢出率。目前國內(nèi)外的研究數(shù)據(jù)表明[1,10-12]，隨著NIPT在臨床上的廣泛使用，各中心的胎兒非整倍體檢出率也隨之大幅升高。

本研究對羊水CMA結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)，致病性CNV的總檢出率為12.20%，與國內(nèi)報(bào)道的研究結(jié)果相近[5,13]。VOUS的檢出率為6.37%，與夏明靜等[14]報(bào)道相近。就目前對人類基因組的認(rèn)識和數(shù)據(jù)庫的積累，仍然無法對全部結(jié)果給出確切的臨床性質(zhì)判讀。這種情況往往會導(dǎo)致孕婦及家屬的焦慮，甚至是錯(cuò)誤的終止妊娠[15]。在產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷中，B超等其他產(chǎn)檢無異常而數(shù)據(jù)庫提示CNV致病性不明或CNV為新發(fā)、CNV片段較小、數(shù)據(jù)庫中無類似案例可參照，以上情況都使得臨床醫(yī)生難以進(jìn)行判斷。在本次1 457例羊水核型與CMA分析結(jié)果比較中，CMA提高了額外檢出率3.50%，這與國內(nèi)外報(bào)道的數(shù)據(jù)相符[3-6]。CMA技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的引進(jìn)，一方面彌補(bǔ)了核型分析的缺點(diǎn)，提高了異常檢出率，提供更全面的產(chǎn)前診斷信息，另一方面也給臨床帶來了新的挑戰(zhàn)。

綜上所述，作者建議對具有產(chǎn)前診斷指征的孕婦，尤其是NIPT高風(fēng)險(xiǎn)或合并2項(xiàng)及以上指征的孕婦，進(jìn)行羊水染色體核型分析聯(lián)合CMA分析，能為臨床提供更為全面的診斷信息。同時(shí)呼吁各實(shí)驗(yàn)平臺共享與整合數(shù)據(jù)庫資源，進(jìn)一步探索VOUS，制定適合我國國情的CMA產(chǎn)前指南與準(zhǔn)則。