李維納，林超群，陽 昇△，陳光勝

(1.柳州愛爾眼科醫(yī)院青白科，廣西 柳州 545005；2.中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院西院區(qū)神經(jīng)外科，廣東 深圳 518107)

角膜新生血管(CNV)，可由感染、化學(xué)傷及退行性病變等引起的炎癥和缺氧形成，其降低角膜透明性，還常導(dǎo)致角膜瘢痕化和持續(xù)性炎癥，嚴(yán)重影響視力，是嚴(yán)重威脅視力的致盲性眼病[1-3]。已有大量實(shí)驗研究證實(shí)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在角膜堿燒傷后新生血管的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4-5]。VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子[6]，導(dǎo)致角膜緣血管擴(kuò)張、滲透性增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移至細(xì)胞外基質(zhì)，形成新生血管，VEGF家族包含VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE、VEGFF及胎盤生長因子(PLGF)，因此抑制VEGF表達(dá)是抑制新生血管生成的關(guān)鍵所在。阿柏西普(aflibercept)為全人源化融合蛋白類抗VEGF藥物，可緊密結(jié)合VEGFA、VEGFB和PLGF，已有大量文獻(xiàn)報道，阿柏西普在治療眼底病理性新生血管相關(guān)疾病有明顯療效，也能明顯減輕視網(wǎng)膜靜脈阻塞繼發(fā)的黃斑水腫，且已在臨床推廣[7]，而其對CNV的作用，鮮少報道。本實(shí)驗通過觀察結(jié)膜下注射阿柏西普對小鼠CNV、VEGF的表達(dá)及角膜炎癥的作用，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑 阿柏西普眼內(nèi)注射溶液(艾力雅)購自德國拜耳公司；兔多克隆VEGFA(ab46154)和VEGFB(ab110649)抗體，ELISA試劑盒購自美國abcam公司；β-actin 抗體(#4970)購自美國Cell Signaling Technology公司；Goat anti-rabbit IgG-HRP(abs20002)購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立及分組 36只健康昆明小鼠(雌雄不限，體重25～35 g，購自廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心)，于裂隙燈顯微鏡觀察眼部情況，排除眼部疾?。粚?shí)驗過程遵循 ARVO制定的相關(guān)規(guī)定；堿燒傷及結(jié)膜下注射過程，采用0.6%戊巴比妥鈉，腹腔注射，誘導(dǎo)全身麻醉，0.5%丙美卡因滴眼液表面麻醉，每次取12只小鼠，隨機(jī)分為A、B 兩組，每組6只。用打孔器制作直徑為2 mm的單層濾紙片，A、B兩組用移液器滴2 μL濃度為1 mol/L的NaOH溶液于濾紙片上，浸泡1 min后貼敷于小鼠右眼角膜中央，30 s后棄掉，立即用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊1 min；用移液器滴2 μL生理鹽水于濾紙片，置于兩組小鼠的左眼，其余步驟同前，作為堿燒傷對照[8]。模型建立模完畢后按造模順序立即在A、B兩組球結(jié)膜下分別注射阿柏西普注射液和生理鹽水各20 μL(用Hamilton微量進(jìn)樣針注射)；術(shù)閉涂左氧氟沙星眼膏預(yù)防感染。

1.2.2角膜的形態(tài)學(xué)觀察 觀察 A、B兩組小鼠，于堿燒傷后1、3、7、14、21、28 d觀察小鼠角膜新生血管情況，計算CNV面積并拍照記錄。CNV面積[9]：分別測量小鼠角膜4個象限內(nèi)最長的血管長度，計算CNV面積(A)，A=C/12×3.1416[r2-(r-1)2]，C為CNV累積角膜的圓周鐘點(diǎn)數(shù)，l為血管長度，r=1.4 mm為小鼠角膜半徑，CNV總面積為4個象限面積之和。

1.2.3角膜炎癥指數(shù)評分(IF) 根據(jù)睫狀充血程度、中央角膜及外周角膜水腫程度評分[10]：(1)睫狀充血:無充血為0分，充血血管小于1 mm計為1分，充血血管1～<2 mm計為2分，充血血管大于2 mm計為3分；(2)中央角膜水腫：無水腫計為0分，有水腫、虹膜紋理可辨計為1分，有水腫、但虹膜紋理不清計為2分，有水腫、看不清瞳孔計為3分；(3)外周角膜水腫:無水腫計為0分，有水腫、虹膜紋理可辨計為1分，有水腫、但虹膜紋理不清計為2分，有水腫、看不清虹膜計為3分。IF為3項得分總和除以9，評分過程由同一人完成，重復(fù)3次。

1.2.4Western blot檢測 采用Western blot檢測 VEGFA、VEGFB的表達(dá) A、B兩組小鼠(每組隨機(jī)取3只)，于堿燒傷后第14天處死，取角膜組織，置于預(yù)冷的裝有蛋白裂解液(RIPA)(按 1∶100 加入蛋白酶抑制劑)的EP管中，用電動研磨儀勻漿后，再用組織超聲破碎儀進(jìn)行超聲破碎(冰上操作)，離心，取上清，提取蛋白樣品，采用Western blot[11]檢測VEGFA、VEGFB的表達(dá),使用ChemiDocTM Touch化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影、照相，圖片用Image J軟件定量分析。

1.2.5組織病理檢測 組織病理檢測A、B兩組小鼠(每組隨機(jī)取3只)，于堿燒傷后第14天處死，沿角膜緣剪取角膜組織，放入福爾馬林溶液固定24 h后，石蠟包埋，冷卻后切片(厚約5 μm)，石蠟切片HE染色，透明樹脂封片后鏡檢。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測 應(yīng)用ELISA檢測炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和IL-10的表達(dá) A、B兩組小鼠，于堿燒傷后第14天處死，取角膜組織，置于預(yù)冷的裝有勻漿液的EP管中，用電動研磨儀勻漿，然后用組織超聲破碎儀處理(冰上操作)。對樣本加樣孔對應(yīng)的標(biāo)本做好編號，ELISA步驟按試劑盒說明書操作。終止反應(yīng)后，15 min內(nèi)，用酶聯(lián)免疫測定儀測定OD450值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度(pg/mL)。

2 結(jié) 果

2.1堿燒傷后小鼠CNV面積和IF評分 A、B兩組小鼠敷貼生理鹽水濾紙片處理后角膜無改變(圖1)。堿燒傷后第1天時A、B兩組角膜均有新生血管芽長入，角膜上皮出現(xiàn)缺損，基質(zhì)水腫，兩組的CNV面積和IF差異均無顯著性(P=0.072、0.140)；從第3天開始，角膜緣血管明顯擴(kuò)張，角膜水腫加重，兩組的CNV面積和IF均表現(xiàn)出差異，A組CNV和IF明顯小于B組(P=0.022、0.037)；第14天時，B組新生血管生長最為旺盛，呈樹枝狀，已長入角膜中央?yún)^(qū)，面積最大，角膜透明性最差，A組新生血管明顯較B組細(xì)小、稀疏，新生血管未長入角膜中央?yún)^(qū)；2周后，角膜水腫明顯減輕，IF逐漸降低；第14、21、28天時A組面積明顯小于B組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=<0.001、0.002、<0.001)，且第14天時兩組間差異最大(圖1，表1、2)。

表1 堿燒傷后CNV面積

圖1 A、B兩組分別于1、3、7、14、21、28 d時，角膜新生血管情況

2.2角膜堿燒傷后14 d VEGF表達(dá)情況 由于第14天時，A、B兩組CNV面積差異最大，因此取第14天的角膜組織行VEGFA和VEGFB蛋白的表達(dá)，A組VEGFA和VEGFB的蛋白表達(dá)水平明顯低于B組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003、0.028)(圖2)。

表2 角膜堿燒傷后IF評分分)

注：a:P<0.05,b:P<0.01；n=3。

2.3蘇木精-伊紅(HE)染色 角膜堿燒傷第14天，B組角膜基質(zhì)層明顯增厚，結(jié)構(gòu)疏松，纖維排列欠規(guī)則，膠原纖維腫脹彎曲，可見新生血管管腔，管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞，炎癥細(xì)胞浸潤明顯；A組角膜各層組織結(jié)構(gòu)較整齊，上皮層未見明顯空泡，新生血管管腔較B組少，基質(zhì)層可見少量炎性細(xì)胞浸潤(圖3)。

圖3 堿燒傷后14 d時角膜HE染色(200×)

2.4角膜堿燒傷第14天炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-10的表達(dá) 由于第14天時，A、B兩組CNV面積差異最大，因此取第14天的角膜組織檢測炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-10的表達(dá)，A組角膜TNF-α、IL-6和IL-10的表達(dá)量均明顯低于B組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016、<0.001、0.002)。見表3、圖4。

表3 炎癥因子表達(dá)量

aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001；n=6。

3 討 論

角膜堿燒傷后CNV形成機(jī)制尚不十分明確，其過程可能為：堿燒傷后角膜組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，釋放大量炎癥細(xì)胞，中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)活性氧溶解角膜各層組織，而且組織局部缺氧，使缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)產(chǎn)生，并調(diào)控 VEGF 作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其大量增殖[12-14]；角膜堿燒傷后，免疫機(jī)制的參與，促進(jìn)多種免疫細(xì)胞因子IL-6、IL-10等表達(dá)增加，SAKAMOTO等[15]發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞因子與堿燒傷后角膜組織的炎性反應(yīng)程度呈正相關(guān)；炎癥細(xì)胞還可以釋放大量的自由基，激活膠原酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，使血管內(nèi)皮細(xì)胞向刺激源移行，形成成熟穩(wěn)定的新生血管[16]。

針對新生血管發(fā)生機(jī)制的藥物種類繁多，但很多藥物的不良反應(yīng)在治療過程中逐步證實(shí)，比如糖皮質(zhì)激素。阿柏西普是通過DNA技術(shù)由人血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)胞外結(jié)構(gòu)域(即VEGFR1Ig2區(qū)和VEGFR2Ig3區(qū))與人IgG1的Fc結(jié)構(gòu)域融合后形成的同源二聚體糖蛋白，生物活性更持久，具有較好的抗新生血管作用。其作為抗腫瘤藥物,作用于靶點(diǎn)VEGF A、VEGF B和PLGF，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，抑制腫瘤血管的生成[17-19]。研究證明，阿柏西普較雷珠單抗、貝伐單抗等同類抗新生血管藥物作用強(qiáng)[20-21]。已有大量臨床研究報道，玻璃體腔注射阿柏西普，對濕性老年性黃斑變性[22]、病理性近視[23]、視網(wǎng)膜靜脈阻塞黃斑水腫[24]和糖尿病視網(wǎng)膜病變黃斑水腫[25]均有良好的治療效果，抑制視網(wǎng)膜新生血管生成，減緩眼底病變的發(fā)展，阿柏西普減輕黃斑水腫效果更好，提高患者的視力，且安全性也得到廣泛證實(shí)，但其對小鼠角膜新生血管的抑制作用、治療效果、并發(fā)癥等方面缺乏實(shí)驗室及臨床證據(jù)。

眼部給藥的方式包括結(jié)膜囊滴眼、結(jié)膜下注射，角膜基質(zhì)注射等。滴眼液的配制涉及濃度、給藥頻次，需要大樣本動物實(shí)驗摸索；臨床上阿柏西普治療眼底疾病通過注射的方式到達(dá)眼內(nèi)，需要一定的時間才發(fā)揮作用，小鼠滴眼后會立即出現(xiàn)眨眼、流淚，藥物在結(jié)膜囊存留時間短，恐難發(fā)揮作用；堿燒傷后，角膜炎性水腫，角膜基質(zhì)注射會加重角膜組織損傷。因此本研究采取結(jié)膜下注射的給藥方式觀察阿柏西普抑制CNV的療效。堿燒傷后第1天時阿柏西普對新生血管的抑制作用無顯著差異，但從治療后第3天開始出現(xiàn)對新生血管的抑制作用，第14天時治療組對角膜新生血管的抑制作用最為明顯。隨后作者對第14天的角膜組織VEGFA和VEGFB的蛋白表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，在阿柏西普治療組二者表達(dá)水平均顯著下降。堿燒傷后，細(xì)胞發(fā)生皂化反應(yīng)，導(dǎo)致角膜上皮缺損，基質(zhì)層膠原纖維間隙變大、排列紊亂，角膜水腫、混濁，甚至溶解、壞死。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠角膜水腫和混濁程度較重，阿柏西普治療后，角膜組織各層水腫和混濁程度減輕，炎癥指數(shù)降低。有研究表明,TNF-α、IL-6、IL-10及基質(zhì)金屬蛋白酶參與角膜堿燒傷后的炎性反應(yīng)，與新生血管的生成呈正相關(guān)，TNF-α、IL-6和IL-10是公認(rèn)的檢測的較多的炎性細(xì)胞因子，抑制新生血管，其表現(xiàn)出下降趨勢[26-27]。本研究也檢測到炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-10的表達(dá)量表現(xiàn)出明顯降低。因此，本研究認(rèn)為結(jié)膜下注射阿柏西普通過抑制VEGFA和VEGFB的表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)，從而減小堿燒傷后角膜CNV面積、縮小血管管徑，提高大部分患眼角膜透明性，且注射2周時治療效果教對照組最為明顯，之后CNV面積逐漸較少，新生血管萎縮、退化，角膜水腫和混濁不同程度減輕。

臨床應(yīng)用前景：(1)結(jié)膜下注射阿柏西普對堿燒傷后角膜新生血管有明顯抑制作用；(2)結(jié)膜下注射阿柏西普短期安全性好，操作簡單、方便；(3)未發(fā)現(xiàn)眼局部及全身不良反應(yīng)。不足之處：由于觀察時間有限，阿博西普結(jié)膜下注射后，是否需像治療眼底新生血管一樣根據(jù)病情多次注射，新生血管是否會復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)的規(guī)律等仍需多中心、大樣本、長期的實(shí)驗研究或臨床觀察，以便更客觀評價其治療效果。