陳友蓮，劉雪燕，陳懷生，洪澄英，張華東

(深圳市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518020)

由細(xì)菌、真菌或病毒引起的肺部感染在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率均逐步上升，是導(dǎo)致總壽命下降的第三大原因[1]。因此需要進(jìn)行機(jī)械通氣的重癥肺炎死亡率為30%～70%，病原體通常為革蘭陰性菌，如不動(dòng)桿菌屬、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌、革蘭陽性菌，如金黃色葡萄球菌和腸球菌及一些病毒等[2]。傳統(tǒng)的病原體檢測(cè)方法陽性率低且耗時(shí)，不能滿足當(dāng)前對(duì)快速和精準(zhǔn)感染性疾病診斷的需求[3]。宏基因組二代測(cè)序技術(shù)(mNGS)是一種高通量測(cè)序方法，可以檢測(cè)病原微生物和標(biāo)記基因，例如抗生素抗性基因等，檢測(cè)效率高且周轉(zhuǎn)時(shí)間短，從而有可能快速、準(zhǔn)確診斷感染性疾病病原體[4]。關(guān)于mNGS在重癥肺炎患者病原學(xué)診斷中的應(yīng)用報(bào)道仍然很少，特別是使用肺泡灌洗液(BALF)樣本進(jìn)行檢測(cè)的研究。本研究對(duì)收治的58例重癥肺炎患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，以探討肺泡灌洗液mNGS 在重癥肺炎患者病原檢測(cè)及指導(dǎo)治療方面的臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析 2019 年 1 月至 2021 年 1 月深圳市人民醫(yī)院收治的 58 例行支氣管鏡肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)及傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)的重癥肺炎患者的臨床資料。重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)按照2007年美國感染病學(xué)會(huì)(IDSA)/美國胸科學(xué)會(huì)(ATS)制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷[5]。其中男30 例，女28 例；年齡 25～78歲，平均(62.5±12.0)歲。本研究為回顧性研究，肺泡灌洗液標(biāo)本采集及mNGS檢測(cè)已得到患者授權(quán)家屬同意，并簽署知情同意書，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則，并獲得深圳市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集[6]充分做好術(shù)前準(zhǔn)備，簽署知情同意書。根據(jù)臨床體征及影像學(xué)檢查確定目標(biāo)灌洗肺段，2%利多卡因行表面麻醉，根據(jù)鏡下所見將纖維支氣管鏡插入至病變最為嚴(yán)重的肺段,分次快速注入 37 ℃ 滅菌生理鹽水，每次 25～50 mL灌洗病變肺段支氣管,灌洗后負(fù)壓吸引回收灌洗液(一般回收率為 30%～50%),裝入無菌容器中。肺泡灌洗液收集后將其分成2個(gè)相等的部分,瓶身標(biāo)記患者信息，1份樣本送至本院的微生物室進(jìn)行涂片,培養(yǎng)，另1份樣本即刻于-20 ℃冰箱保存后立即聯(lián)系專業(yè)人員送往華大基因醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室行mNGS檢測(cè)。

1.2.2mNGS病原學(xué)檢測(cè)[7]按上述步驟收集合格樣本，提取核酸進(jìn)行高通量測(cè)序，對(duì)樣本中微生物 DNA 序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析得出檢測(cè)結(jié)果，最后臨床醫(yī)生綜合檢測(cè)結(jié)果及臨床特征進(jìn)行綜合判斷，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床診療。

1.2.3觀察指標(biāo) 觀察患者的基線資料，包括年齡、性別、合并基礎(chǔ)性疾病、疾病嚴(yán)重程度、器官支持治療措施、肺泡灌洗液常規(guī)培養(yǎng)及mNGS檢測(cè)病原學(xué)分布、抗生素調(diào)整、重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)住院時(shí)間、治療轉(zhuǎn)歸等。比較肺泡灌洗液常規(guī)培養(yǎng)及mNGS病原體各自檢測(cè)情況(病原體陽性比例、種類分布、二者吻合程度及多重感染比例等)。

2 結(jié) 果

2.1患者基線資料 本研究共計(jì)納入58例患者，其中男性患者為 30 例(51.7%)，患者總體的平均年齡(62.5±12.0)歲，研究對(duì)象中有42例患者合并一種甚至多種基礎(chǔ)疾病，其中胃腸腫瘤圍手術(shù)期25例(43.1%)?；颊呒毙陨砉δ芎吐越】禒顩r評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ)和序貫器官衰竭評(píng)分(SOFA)分別為22、10分，說明患者病情危重。其中納入有所有患者均為有創(chuàng)機(jī)械通氣，16例(27.6%)患者進(jìn)行了俯臥位通氣，38例(65.5%)患者出現(xiàn)休克，30例(51.7%)患者需要腎臟替代治療，8例(13.8%)患者甚至進(jìn)行了體外膜氧合支持治療。經(jīng)mNGS檢測(cè)后抗生素調(diào)整患者有25例(48.1%)。所有患者ICU平均住院時(shí)間20.8(7，38)d，死亡率為31.0%(18例)。

2.2肺泡灌洗液 mNGS與傳統(tǒng)培養(yǎng)的病原體分布 53例肺泡灌洗液 mNGS 檢測(cè)陽性患者中，共檢測(cè)到病原體 209 株，其中細(xì)菌有155 株(鮑曼不動(dòng)桿菌 30株，嗜麥芽窄食單胞菌23株，銅綠假單胞菌 18 株，肺炎克雷伯菌17株，皮特不動(dòng)桿菌8株，屎腸球菌9株，肺炎鏈球菌6株，大腸埃希菌6株，糞腸球菌4株，流感嗜血桿菌 3 株，紋帶棒狀桿菌3株，以及其他包括嗜肺軍團(tuán)菌2株，解甘露醇羅爾斯菌2株，金黃色葡萄球菌2株)，病毒 29株(人類皰疹病毒 1 型 11 株，巨細(xì)胞病毒 7 株，細(xì)環(huán)病毒4株，EB病毒3株)，真菌19株(光滑念珠菌5株，近平滑念珠菌5株，白色念珠菌5株，熱帶念珠菌 3 株，煙曲霉 1 株)，特殊病原體 11 株(鸚鵡熱衣原體2 株，解脲支原體2株耶氏肺孢子菌4株，隱球菌2株，結(jié)核分枝桿菌 1 株)。19例培養(yǎng)陽性患者中，共檢測(cè)到病原體 65株，其中細(xì)菌57株(鮑曼不動(dòng)桿菌 10株，嗜麥芽窄食單胞菌12株，銅綠假單胞菌6株，肺炎克雷伯菌 8株，大腸埃希菌3株等)，真菌15株(光滑念珠菌3株，近平滑念珠菌4株，白色念珠菌5株，熱帶念珠菌 1 株，煙曲霉1株)。特殊病原體和病毒未檢測(cè)出。由此可以看出，肺泡灌洗液mNGS對(duì)細(xì)菌、病毒及特殊病原體的檢測(cè)陽性率明顯高于常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)方法。見圖1。

圖1 肺泡灌洗液mNGS和常規(guī)培養(yǎng)病原學(xué)分布

2.3mNGS 陽性率與傳統(tǒng)培養(yǎng)靈敏度、特異度、吻合程度比較 肺泡灌洗液mNGS較常規(guī)培養(yǎng)的靈敏度提高了約59.0%(92.0%vs.32.3%；P<0.05)，特異度降低了23.7%(58.8%vs.82.5%；P=0.38)。與常規(guī)培養(yǎng)相比，mNGS提高了靈敏度(P<0.05)，而二者之間特異度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.38)。肺泡灌洗液mNGS和常規(guī)檢測(cè)病原體均為陽性17例(29.3%)，3例(5.7%)均陰性；僅mNGS檢出病原體陽性36例(62.0%)，僅肺泡灌洗液培養(yǎng)病原體陽性2例(3.4%)。在17例雙陽性病例中，肺泡灌洗液mNGS和常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果完全匹配13例，完全不匹配2例，部分不匹配2例。

2.4肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)混合感染的作用 在58例患者中，肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)病原體有2例(3.4%)，發(fā)現(xiàn)僅1種細(xì)菌感染有7例(12.0%)，僅1種真菌感染有1例(1.7%)，細(xì)菌真菌混合感染13例(22.4%)，細(xì)菌病毒混合感染12例(20.7%)，多細(xì)菌混合感染14例(24.1%)，真菌病毒混合感染1例(1.7%)。其中細(xì)菌真菌病毒混合感染6例(10.3%)，細(xì)菌真菌病毒及支原體混合感染2例(3.4%)。結(jié)合患者病情及免疫功能指標(biāo)，作者發(fā)現(xiàn)免疫功能正?；颊咧饕獮橐环N病原體感染或細(xì)菌合并真菌感染或多細(xì)菌合并感染，而在免疫功能抑制的患者中，細(xì)菌-真菌-病毒混合性感染比較常見。

3 討 論

早期病因診斷對(duì)于重癥肺炎患者合理使用抗生素非常重要。傳統(tǒng)的診斷技術(shù)主要包括涂片顯微鏡檢查，微生物培養(yǎng)，抗原抗體檢測(cè)和PCR等這些評(píng)估方法耗時(shí)、檢測(cè)范圍窄且陽性率低，不能滿足重癥肺炎患者的診斷需求[8]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，mNGS檢測(cè)的價(jià)值已逐漸得到認(rèn)可，特別是對(duì)于一些稀有、非典型或生長(zhǎng)緩慢的微生物的檢測(cè)[9]、現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)無法識(shí)別的病原體以及對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化抗菌治療無效的患者[10]。有研究表明，重癥肺炎患者氣道菌群組成受機(jī)械通氣時(shí)間的影響，隨著發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌菌群的類型可能會(huì)發(fā)生變化，這可能是細(xì)菌菌群遷移的結(jié)果[11]。而且mNGS可以識(shí)別不同條件下的氣道菌群分布，有助于迅速和準(zhǔn)確的治療肺部感染[12]。常規(guī)檢測(cè)方法顯示，革蘭陰性桿菌是最常見的病原體(41%～92%)，如鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、克雷伯菌、大腸桿菌、變形桿菌等。其次是革蘭陽性球菌，如金黃色葡萄球菌、鏈球菌、凝固酶陰性葡萄球菌(CoNS)、萬古霉素耐藥金葡菌(VRSA)和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)等。其他的還包括念珠菌等真菌[13]。本研究表明，常規(guī)培養(yǎng)與肺泡灌洗液mNGS的檢測(cè)病菌體分布基本一致，但后者檢測(cè)靈敏度高于常規(guī)培養(yǎng)(91.3%vs.32.3%，P<0.05)，而特異度低于常規(guī)培養(yǎng)(58.8%vs.82.5%,P=0.25),且受先前抗生素暴露的影響較小[14]。而且在一些少見病原體(如嗜肺軍團(tuán)菌、紋帶棒狀桿菌、李斯特菌、耶氏肺孢子菌、隱球菌、鸚鵡熱衣原體等)檢測(cè)方面則更具有優(yōu)勢(shì)，可以迅速確診并進(jìn)行靶向抗感染治療。此外，肺泡灌洗液mNGS在檢測(cè)病毒方面優(yōu)勢(shì)非常明顯。本研究中，共檢測(cè)到29株病毒，最常檢測(cè)到的病毒為單純皰疹病毒1型11株、巨細(xì)胞病毒7株、細(xì)環(huán)病毒4株，EB病毒3株。既往有研究表明，合并病毒感染重癥肺炎患者的預(yù)后更差[15]。本研究中，因發(fā)現(xiàn)病毒而調(diào)整治療方案約占45%。因此，通過肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)及早識(shí)別一些少見、致病性病毒具有非常重要意義，可以幫助我們盡早做出合理的醫(yī)療決策。

mNGS的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其可以在一次檢測(cè)中同時(shí)檢測(cè)多種病原體。病程遷延、免疫抑制的患者更有可能成為mNGS的最大受益者，因?yàn)檫@一類患者通常為混合感染[16]。本研究中，多細(xì)菌混合感染占24.1%，細(xì)菌真菌混合感染占22.4%，細(xì)菌病毒混合感染占20.7%，真菌病毒混合感染占1.7%，細(xì)菌真菌病毒混合感染占10.3%，細(xì)菌真菌病毒及支原體混合感染占3.4%，合計(jì)有82.8%病例為混合感染。對(duì)于混合感染，聯(lián)合治療是常見策略，因此應(yīng)盡早、動(dòng)態(tài)使用mNGS檢測(cè)細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原微生物，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療，從而減少不必要和不適當(dāng)?shù)目股厥褂?，避免抗生素濫用和耐藥發(fā)生[17]。

本研究表明，肺泡灌洗液mNGS在重癥肺炎治療中具有非常重要的作用，但仍然存在一些局限性。(1)除了人類基因組干擾和其他常見問題之外，mNGS結(jié)果的解釋(即區(qū)分定植與感染)仍然存在問題，也是今后需要研究的方向；(2)本研究中未進(jìn)行肺泡灌洗液RNA病毒檢測(cè)，有可能漏診一部分RNA病毒感染患者，降低診斷靈敏度。這可能與目前mNGS檢測(cè)費(fèi)用較高有關(guān)，隨著技術(shù)的進(jìn)步及檢測(cè)成本降低，這一問題有望解決；(3)目前的肺泡灌洗液mNGS雖然可提供耐藥基因檢測(cè)，但仍無法提供耐藥細(xì)菌藥敏檢測(cè)等重要信息；(4)本研究為回顧性研究，病例數(shù)有限，仍需要更多前瞻性和多中心數(shù)據(jù)才能得出關(guān)于肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)在臨床應(yīng)用確實(shí)有效的證據(jù)。

綜上所述，肺泡灌洗液mNGS能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)和鑒定病原體，為精準(zhǔn)診斷和個(gè)性化治療奠定了基礎(chǔ)；此外，在診斷重癥肺炎患者混合感染方面也具有明顯優(yōu)勢(shì)，是一種有前途的臨床感染性疾病診斷技術(shù)。