陳 瑤，裴光德，李 娟，王 芳，冉華麗，李 蓉，肖文科，湯榮睿

(重慶市沙坪壩區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，重慶 400030)

金黃色葡萄球菌是一種革蘭陽性球菌，分布廣泛、致病性強、耐藥率高，可導(dǎo)致院內(nèi)感染流行，是醫(yī)院內(nèi)感染常見的病原體之一，也是引起人類化膿性感染的常見病原菌[1]。近年來，金黃色葡萄球菌暴發(fā)流行，當(dāng)患者機體免疫功能低下或皮膚黏膜出現(xiàn)破損時，可突破皮膚及黏膜屏障，導(dǎo)致皮膚、肺等部位出現(xiàn)感染，從而引起敗血癥、膿毒癥等，造成極其嚴(yán)重的臨床后果[2]。細菌生物膜可將細菌包裹其中保護細菌不受抗菌藥物的作用，并能降低機體免疫功能和細胞的吞噬作用，是發(fā)生持續(xù)性感染及感染難以治愈的主要原因[3]。研究表明，生物膜能阻礙抗生素的釋放并參與抗生素耐藥[1]。金黃色葡萄球菌極易形成生物膜以逃避機體的免疫系統(tǒng)和抗菌藥物的殺滅作用，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌致病性和耐藥性明顯增強。

金黃色葡萄球菌的傳統(tǒng)治療方法仍以抗生素為主，臨床上常使用大環(huán)內(nèi)酯類(MLSB類)即(如紅霉素)、林可酰胺類(如克林霉素)、B類鏈陽霉素類抗菌藥物治療金黃色葡萄球菌引起的感染?？肆置顾匾蚱浒胨テ陂L、不良反應(yīng)少被廣泛使用。然而，隨著廣譜抗生素的大量使用，多重耐藥菌的發(fā)生呈上升趨勢[4-5]。金黃色葡萄球菌對克林霉素的耐藥率逐年上升，僅次于青霉素和紅霉素。然而，我國住院患者分離的金黃色葡萄球菌體外生物膜形成能力及其與耐藥性的關(guān)系研究甚少。本研究擬通過對本院2019年9月至2020年9月分離的克林霉素耐藥型金黃色葡萄球菌耐藥基因及生物膜形成能力的研究，以期更深入地了解克林霉素耐藥型金黃色葡萄球菌發(fā)生的分子機制，為臨床上控制耐藥菌的產(chǎn)生提供可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 收集沙坪壩區(qū)人民醫(yī)院在2019年9月至2020年9月臨床分離的金黃色葡萄球菌，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果和D試驗，選取結(jié)構(gòu)型和誘導(dǎo)型克林霉素耐藥金黃色葡萄球菌作為研究菌株。同一患者、同一時期相同部位分離的菌株只取1次作為研究。菌株均來自本院住院和門診患者送檢的樣本，包括痰液、尿液、膿液、分泌物等。

1.1.2儀器與試劑 全自動細菌鑒定及藥敏試驗分析儀(湖南天地人生物科技有限公司)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(上海三騰儀器有限公司)；基因擴增儀(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；凝膠電泳成像儀(美國BIO RAD公司)；酶標(biāo)儀(上海科華實驗系統(tǒng)有限公司)；DNA抽提試劑盒及PCR試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)；erm耐藥基因引物(上海生工生物工程股份有限公司)；Star Marker D2000 Plus(廣州市康潤生物科技有限公司)；1%結(jié)晶紫染色液(上海心語生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細菌鑒定及藥敏試驗 常規(guī)培養(yǎng)分離細菌，操作按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版進行[6]，利用全自動細菌分析儀鑒定菌種。藥敏試驗采用全自動細菌分析儀測試最低抑菌濃度(MIC)，結(jié)果判讀參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)M100標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2生物膜形成試驗 采用96孔板結(jié)晶紫染色法，挑取單個菌落接種于含1%葡萄糖的TSB溶液中，置于37 ℃、60 r/min的恒溫空氣搖床中培養(yǎng)[7]，24 h后用比濁儀將菌液調(diào)至1.0麥?zhǔn)蠞岫?。在無菌96孔板中加入100 μL調(diào)制好的菌液，置于37 ℃、60 r/min的恒溫空氣搖床中培養(yǎng)72 h，PBS緩沖液緩慢沖洗3遍，加入100 μL甲醇固定15 min，加入100 μL 1%結(jié)晶紫溶液，37 ℃染色15 min，PBS緩沖液洗滌3次，干燥，最后加入95%乙醇溶解結(jié)晶紫染料，于波長570 nm處測定A值，以A(570)值代表各組金黃色葡萄球菌生物膜形成量。每種菌株重復(fù)3次實驗，每次實驗重復(fù)3個孔，每種菌株OD值取3次實驗平均值(OD值)，空白組只加入含1%葡萄糖TSB溶液，空白組OD值的2倍作為界限值(ODc)，根據(jù)每組細菌OD值與ODc值大小的關(guān)系，細菌被分為以下4類[8]：(1)強生物被膜形成株(OD>4*ODc)；(2)中等強度生物被膜形成株(2*ODc

1.2.3耐藥基因的檢測

1.2.3.1金黃色葡萄球菌DNA的提取 將收集的待測菌株接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。用取菌環(huán)挑取數(shù)個單菌落接種于1 mL雙蒸水制成混懸菌液，之后方法嚴(yán)格按照細菌DNA提取試劑盒說明書進行操作。

1.2.3.2耐藥基因檢測 根據(jù)GenBanK中己發(fā)布的金黃色葡萄球菌erm耐藥基因序列，參考文獻[8]設(shè)計各型別引物(委托上海生工生物工程股份有限公司合成)，擴增條件見表1。取5 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進行電泳30 min，后將凝膠置于紫外凝膠成像儀下拍照并記錄保存結(jié)果。

表1 erm基因各分型PCR擴增引物序列及其產(chǎn)物長度

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。不同表型克林霉素耐藥型金黃色葡萄球菌、erm耐藥基因與生物膜形成能力的比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)本來源情況 本院2019年9月至2020年9月共分離得到金黃色葡萄球菌114株，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果和D試驗，將克林霉素耐藥型金黃色葡萄球菌分為結(jié)構(gòu)型耐藥(cMLSB)和誘導(dǎo)型耐藥(iMLSB)，共分離得到36株，其中cMLSB型15株，占41.7%；iMLSB 21株，占58.3%。絕大多數(shù)標(biāo)本來自于痰液，占55.6%(20/36)，其余來源于分泌物33.2%(12/36)、導(dǎo)管2.8%(1/36)、穿刺液2.8%(1/36)、血液2.8%(1/36)、組織2.8%(1/36)。檢出率位于前3位的科室分別是兒科41.6%(15/36)、呼吸科27.8%(10/36)、外科19.4%(7/36)。見表2。

表2 36株克林霉素耐藥型金黃色葡萄球菌標(biāo)本來源及分布特點

2.2生物膜形成能力的判斷 依據(jù)生物膜形成能力判斷標(biāo)準(zhǔn)，36株克林霉素耐藥型金黃色葡萄球菌均有生物膜的形成能力，其中有8株生物膜形成能力較弱，占22.2%；有17株形成生物膜的能力較中等，占47.2%；有11株具有較強的生物膜形成能力，占30.6%。經(jīng)統(tǒng)計分析，cMLSB型和iMLSB型在生物膜形成能力方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同MLSB表型與生物膜形成能力檢出情況

2.3耐藥基因型檢測結(jié)果

2.3.1erm基因在不同類型菌株中的分布 目前，在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了3種erm基因，即ermA、ermB和ermC，ermA和ermC比較常見。檢測發(fā)現(xiàn)，在36株克林霉素耐藥型金黃色葡萄球菌中，檢出ermA基因12株，占33.3%；ermB基因2株，占5.6%；ermC基因18株，占50.0%；同時表達ermA+ermC基因4株，占11.1%。其中，iMLSB型主要表達ermC(P=0.012)，cMLSB型主要表達ermA(P=0.004)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳見圖1。

表4 erm耐藥基因在不同MLSB表型中檢出情況

M表示Marker(2 000 plus)；1.陰性對照；2.ermA基因；3.ermB基因；4.ermC基因。

2.3.2erm耐藥基因在不同生物膜形成重的分布 對耐藥基因ermA、ermB、ermC進行PCR檢測，ermA陽性菌株有50.0%具有強生物膜形成能力，43.7%具有中等生物膜形成能力；ermA陰性菌株僅有15.0%具有強生物膜形成能力，85.0%的菌株只有中等和低等生物膜形成能力，存在ermA耐藥基因的菌株中生物膜陽性數(shù)量顯著高于無ermA耐藥基因攜帶組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.024)。而ermB、ermC在生物膜形成能力上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 erm耐藥基因在不同生物膜形成能力中檢出情況[n(%)]

3 討 論

金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生多種毒力因子，如α毒素、腸毒素、殺白細胞素、表皮剝脫毒素、休克綜合征毒素、酚溶解蛋白、血漿凝固酶等，并能降低宿主免疫反應(yīng)和細胞吞噬作用[2]。金黃色葡萄球菌生物膜對抗生素具有高度耐藥性，并能抵抗宿主防御機制的攻擊，使抗感染治療日益困難。近年來，越來越多的研究者為了降低抗生素的使用頻率，減少多重耐藥菌的產(chǎn)生，試圖通過尋找生物膜抑制劑來控制感染的發(fā)生，這將是后抗生素時代控制細菌感染最有前途的治療手段。由此可見，臨床醫(yī)生迫切需要充分認識金黃色葡萄球菌的耐藥機制，結(jié)合其生物膜特性，發(fā)現(xiàn)其相關(guān)性，以求探索治療金黃色葡萄球菌感染新方法的思路，建立金黃色葡萄球菌的感染管理新策略。

金黃色葡萄球菌對克林霉素的耐藥機制主要有2種：一種是特異性耐藥，由erm基因編碼，主要包括ermA、ermB和ermC。erm基因編碼產(chǎn)生的甲基轉(zhuǎn)移酶導(dǎo)致23S rRNA的甲基化作用，降低了MLSB類抗生素對rRNA靶位的結(jié)合，使藥物失效，引起大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類和B型鏈陽霉素耐藥(即MLSB耐藥)。MLSB耐藥又分為cMLSB和iMLSB[10]：cMLSB是由于erm基因上游啟動子發(fā)生突變而使其erm基因持續(xù)表達產(chǎn)生耐藥，其表型為紅霉素和克林霉素同時耐藥。iMLSB是指紅霉素作為誘導(dǎo)劑通過衰減機制誘導(dǎo)erm基因表達而產(chǎn)生耐藥，其表型為對紅霉素耐藥對克林霉素敏感。另一種耐藥為非特異性耐藥，金黃色葡萄球菌作為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，也是容易形成細菌生物膜的常見細菌之一[10]。各種證據(jù)表明，金黃色葡萄球菌感染過程中生物膜的形成除了導(dǎo)致住院時間延長外，還與許多重要的疾病密切相關(guān)，如肺炎、壞死性筋膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、敗血癥和心內(nèi)膜炎。生物膜的概念最先由微生物學(xué)家COSTERTON在1987年提出，其是細菌黏附于固體或機體腔道表面形成的微菌落與分泌的細胞外多糖蛋白復(fù)合物形成的膜狀物[11]。生物膜可將細菌包裹在其里面，保護細菌不受抗菌藥物的作用，并能降低機體免疫功能和細胞的吞噬作用，加之細菌的大量繁殖和毒性因子的分泌使感染長期停留在炎癥階段，難以治愈[12]。對于生物膜感染的傷口，最常用的方式為外科清創(chuàng)法，然而由于清創(chuàng)面積及深度有限，生物膜容易殘留，進而形成新的生物膜。隨著生物膜研究的進展，負壓創(chuàng)面療法、干擾細胞群體感應(yīng)系統(tǒng)、胞外多聚糖降解酶、DNA酶、抗菌肽的運用已投入到生物膜的治療中來[13-14]。

耐藥菌的克隆傳播造成大面積患者感染更使治療情況日益嚴(yán)峻，為臨床感染的控制帶來了極大的挑戰(zhàn)。然而，多重耐藥細菌的監(jiān)測與預(yù)防仍然面臨諸多問題，如耐藥菌監(jiān)測技術(shù)落后、耐藥性監(jiān)測手段匱乏、預(yù)防技術(shù)停滯不前等。目前，尚無一種可靠的多重耐藥菌感染預(yù)防方法。

本研究顯示，本院2019年9月至2020年9月共分離得到金黃色葡萄球菌114株，根據(jù)根據(jù)藥敏試驗結(jié)果和D試驗，共收集到克林霉素耐藥型金黃色葡萄球菌36株，其中cMLSB型15株，占41.7%；iMLSB 21株，占58.3%，這表明本院誘導(dǎo)型克林霉素耐藥金黃色葡萄球菌發(fā)生率已很高，臨床應(yīng)引起高度重視，謹慎使用克林霉素。從標(biāo)本來源看，克林霉素耐藥型金黃色葡萄球菌絕大多數(shù)標(biāo)本來自于痰液(55.6%)和分泌物(33.2%)，送檢科室主要是兒科(41.6%)、呼吸科(27.8%)和外科(19.4%)，說明克林霉素耐藥型金黃色葡萄球菌是呼吸道和外傷等感染性疾病的主要致病菌，而兒童由于免疫系統(tǒng)尚未成熟對病原體抵抗能力不足，因此檢出率也較高。從耐藥表型來分析，克林霉素耐藥型金黃色葡萄球菌耐藥基因以ermA和ermC為主，分別占33.3%和50.0%，ermB基因較少見。其中，iMLSB型主要表達ermC，cMLSB型主要表達ermA，與相關(guān)文獻報道一致[15]。從耐藥基因分析，生物膜在ermA基因陽性菌株中形成能力較強，ermA陽性菌株有50.0%具有強生物膜形成能力，ermA陰性菌株僅有15.0%具有強生物膜形成能力，ermA耐藥基因與生物膜表達顯著相關(guān)，與研究結(jié)果一致[14]。這表明cMLSB型金黃色葡萄球菌具有較強的生物膜形成能力，且耐藥機制與ermA高度相關(guān)，在臨床檢驗工作中應(yīng)重點關(guān)注此類菌株對疾病感染的影響。因此，后續(xù)研究將加大樣本量進一步研究其相關(guān)性，并開展生物膜抑制劑對ermA耐藥型菌株的干預(yù)性研究，比較使用抑制劑前后菌株藥物敏感性的差異，以降低抗生素的使用頻率，從而減少耐藥菌的產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上進一步研究抗生素耐藥性與生物膜形成之間的關(guān)系可能有助于制定金黃色葡萄球菌治療新思路，延緩耐藥菌的發(fā)展。