林萍萍, 張 慧, 徐良年, 鄧祖湖, 王勤南, 趙新旺,3

(1.福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家甘蔗工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.廣東省科學(xué)院南繁種業(yè)研究所,廣東 廣州 510310；3.廣西大學(xué)廣西甘蔗生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004)

甘蔗是熱帶、亞熱帶重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]。由于甘蔗是非整倍的多倍體作物，遺傳方式復(fù)雜且遺傳多樣性豐富，可為“高貴化”育種提供優(yōu)良的親本材料[2]。甘蔗倍性復(fù)雜且不易開花，主要以無性繁殖為主，使育種進(jìn)展緩慢[3]。目前應(yīng)用于遺傳育種的分子標(biāo)記有很多，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)標(biāo)記由于具有數(shù)量多、方便基因分型、覆蓋范圍廣、效率高及可以大規(guī)模篩查的優(yōu)勢(shì)[4-6]，得以普遍應(yīng)用于探究遺傳多樣性。簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)(specific-locus amplified fragment sequencing, SLAF-seq)是一種高通量的測(cè)序技術(shù)，可簡(jiǎn)便、快速獲得覆蓋全基因組的SNP標(biāo)記以及基因型。SLAF-seq技術(shù)具有構(gòu)建文庫簡(jiǎn)單快速、成本較低、準(zhǔn)確性高、有效標(biāo)記多等特點(diǎn)，已應(yīng)用于甘薯[7]、大豆[8]、水稻[9]等作物遺傳多樣性分析和性狀的QTL定位等研究。

研究甘蔗種質(zhì)資源的遺傳多樣性可以挖掘控制優(yōu)良性狀的等位基因，通過人工選擇使有利等位基因的基因頻率不斷提高，甚至固定下來。由于連鎖，有利基因周圍的基因組區(qū)域也隨之穩(wěn)定遺傳。甘蔗細(xì)莖野生種(SaccharumspontaneumL.)俗稱割手密，具有抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等優(yōu)良性狀。推廣種植的甘蔗栽培品種大多含有割手密血緣。在全基因組范圍檢測(cè)選擇性清除信號(hào)，能掃描到與遺傳進(jìn)化有關(guān)的受選擇基因或基因組區(qū)域[10-11]。目前利用SNP標(biāo)記對(duì)甘蔗遺傳多樣性及選擇性清除進(jìn)行分析的相關(guān)研究相對(duì)較少。本研究以甘蔗近緣屬割手密為參考基因組，對(duì)107份甘蔗材料進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，分析不同群體的遺傳多樣性，并利用遺傳分化指標(biāo)(Fst)和核苷酸多態(tài)性(π)對(duì)不同群體進(jìn)行選擇性清除分析，進(jìn)一步分析甘蔗基因組中受人工選擇的區(qū)域及優(yōu)良基因，以期為甘蔗分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用107份甘蔗材料進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，包括83份栽培種及24份細(xì)莖野生種。其中，粵甘49在兩次引種過程中表型有所差異，但性狀都優(yōu)良，分別編號(hào)為粵甘49-1、粵甘49-2。甘蔗葉片主要采自福建、海南、廣西等地。取新鮮幼嫩無病害的葉片放于錫箔紙中，置-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取 采用2×CTAB法[12]提取甘蔗葉片DNA，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的純度和濃度，選擇單一、無拖帶的DNA樣品置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶切建庫及SNP標(biāo)記的開發(fā) 以甘蔗近緣屬割手密基因組(S.spontaneumAP85-441 genome, http://sugarcane.zhangjisenlab.cn/sgd/html/index.html)為參考，利用北京百邁客生物科技有限公司的酶切預(yù)測(cè)軟件對(duì)割手密基因組進(jìn)行最佳酶切方案預(yù)測(cè)，并對(duì)107份甘蔗DNA樣品進(jìn)行酶切。對(duì)得到的SLAF標(biāo)簽進(jìn)行3′端加A處理，連接Dual-index測(cè)序接頭，通過PCR目的片段的擴(kuò)增、純化、混樣，選取目的片段，構(gòu)建合格的測(cè)序文庫。以水稻品種‘日本晴’作為對(duì)照進(jìn)行測(cè)序，評(píng)估酶切的準(zhǔn)確性。利用BWA軟件[13]將測(cè)序后的數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組上，并使用GATK和SAMtools[13]兩種軟件檢測(cè)SNP。兩種方法取交集以確認(rèn)最終的SNP位點(diǎn)，并且以最小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)大于0.05以及位點(diǎn)完整度大于0.5為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，獲得高質(zhì)量的SNP。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建與群體結(jié)構(gòu)分析 采用MEGA 6軟件[14]，基于鄰接法、Kimura 2-parameter模型和自展值重復(fù)1 000次，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹?；诤Y選出的SNP分別對(duì)材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)和主成分(PCA)分析。(1)通過Admixture軟件[15]分析群體結(jié)構(gòu)。預(yù)先設(shè)定亞群數(shù)目(K值)為1～10進(jìn)行聚類，并對(duì)聚類結(jié)果進(jìn)行交叉驗(yàn)證。根據(jù)交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率的谷值確定最優(yōu)分群數(shù)。(2)通過EIGENSOFT軟件進(jìn)行PCA分析，對(duì)所有材料進(jìn)行聚類。

1.2.4 Fst和π的計(jì)算及選擇性清除分析 基于高質(zhì)量的SNP，按照100 kb的窗口、10 kb的步長(zhǎng)對(duì)染色體進(jìn)行選擇性清除區(qū)域檢測(cè)。使用R語言的PopGenome軟件包，計(jì)算Fst、π和多樣性變化倍數(shù)(θπratio)等，并利用Fst值繪制曼哈頓圖。在篩選選擇性清除區(qū)域時(shí)，分別以Fst和π前5%分位數(shù)對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)作為閾值，取該區(qū)域的交集為選擇性清除區(qū)域。

1.2.5 候選基因的檢測(cè)與注釋功能富集分析 將鑒定的選擇性清除區(qū)域通過Interproscan軟件[16]進(jìn)行GO注釋分析。在網(wǎng)站(http://plantregmap.cbi.pku.edu.cn/go.php)上進(jìn)行GO富集分析，并與Swiss-Prot[17]、GO[18]和KEGG[19]等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比得到注釋信息。參考NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以及割手密基因組數(shù)據(jù)庫，對(duì)受選擇區(qū)域的基因進(jìn)行功能注釋，對(duì)候選基因進(jìn)行GO功能富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與評(píng)估

通過對(duì)107份甘蔗基因組DNA進(jìn)行SLAF酶切及建庫，總共獲得223.63 Mb序列數(shù)據(jù)。其中，云南82-29獲得的數(shù)據(jù)量(4.66 Mb)最大，湛蔗80-101等樣品的數(shù)據(jù)量(0.27 Mb)最小(表1)。107份材料測(cè)序結(jié)果顯示，GC含量在42.08%～45.69%之間，平均44.11%；測(cè)序堿基質(zhì)量值Q30在89.41%～93.08%之間，平均90.93%，說明堿基測(cè)序錯(cuò)誤率較低，獲得的數(shù)據(jù)可靠。本研究中第42個(gè)樣品即新臺(tái)糖26號(hào)的堿基含量分布和質(zhì)量分布見圖1。通過序列分析，從107份甘蔗材料中共獲得7 869 726個(gè)高質(zhì)量的SNP。根據(jù)SNP在染色體上的分布，繪制SNP在染色體上的分布圖(圖2)。由圖2可知，開發(fā)的SNP標(biāo)記在染色體上分布比較均勻，Chr7D的SNP位點(diǎn)相對(duì)較多，Chr8C的SNP位點(diǎn)相對(duì)較少。

表1 SLAF-seq基因組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Table 1 Summary of genomic sequences generated by SLAF-seq

續(xù)表1

圖1 新臺(tái)糖26號(hào)的堿基含量及測(cè)序質(zhì)量分布Figure 1 Base distribution and quality distribution of Xintaitang 26 reads

每個(gè)條帶代表一條染色體，橫坐標(biāo)為染色體長(zhǎng)度，顏色越深代表SNP標(biāo)記數(shù)越多。圖2 SNP標(biāo)簽在甘蔗染色體上的分布Figure 2 Distribution of SNPs on the chromosomes of sugarcane

2.2 甘蔗系統(tǒng)發(fā)育分析及群體結(jié)構(gòu)劃分

為了從基因水平上分析栽培種群體與細(xì)莖野生種群體的遺傳結(jié)構(gòu)，利用篩選出的7 869 726個(gè)高質(zhì)量的SNP，通過Admixture軟件進(jìn)行107份甘蔗材料群體結(jié)構(gòu)分析(圖3)。根據(jù)交叉錯(cuò)誤率確定最優(yōu)分群。當(dāng)K從1到2時(shí)，交叉錯(cuò)誤率逐漸減小；從2到10時(shí)，交叉錯(cuò)誤率逐漸增大(圖3C)。說明K=2時(shí)，交叉錯(cuò)誤率最小。因此，107份甘蔗群體可分為2個(gè)亞群，一個(gè)為栽培種群體，另一個(gè)為細(xì)莖野生種群體(圖3D)。

利用SNP信息，構(gòu)建107份甘蔗材料的進(jìn)化樹(圖3A)。從進(jìn)化樹可見，細(xì)莖野生種群體、栽培種群體分別聚在一起，說明栽培品種間的序列相似性較高，與細(xì)莖野生種存在一定的差異。利用R軟件繪制主成分分析圖(圖3B)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)亞群在PC1軸上的分布存在差異。該結(jié)果與聚類分析結(jié)果相一致。周珊等[20]研究表明，甘蔗不同亞群間存在遺傳滲透，尤其是栽培種群體中混有細(xì)莖野生種的遺傳成分。細(xì)莖野生種將優(yōu)良的抗性基因滲入栽培品種中，通過品種間不斷地雜交、人工選擇及自然選擇，豐富了甘蔗遺傳背景，培育出抗逆性強(qiáng)和產(chǎn)量高的優(yōu)良品種[21]，與本研究遺傳多樣性的分析結(jié)果相類似。

A.進(jìn)化樹分析，Ⅰ為栽培種群體、Ⅱ?yàn)榧?xì)莖野生種群體；B.群體主成分分析；C.群體結(jié)構(gòu)交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤分析；D.群體結(jié)構(gòu)。圖3 107份甘蔗材料遺傳結(jié)構(gòu)的分析Figure 3 Genetic structure analysis of 107 sugarcane varieties

2.3 甘蔗群體遺傳分化分析

為了探究甘蔗群體的分化，本研究分析了栽培種群體和細(xì)莖野生種群體的Fst值，并利用100 kb滑動(dòng)窗口對(duì)基因組區(qū)域Fst值進(jìn)行分析(圖4)。從圖4可見，栽培種群體與細(xì)莖野生種群體之間Fst=0.216，栽培種群體的核苷酸多樣性(π=8.93×10-6)高于細(xì)莖野生種群體(π=6.11×10-6)?？赡苁且?yàn)樵耘喾N遺傳背景較為復(fù)雜，除了割手密血緣外，還有熱帶種血緣或者大莖野生種血緣[22]，導(dǎo)致栽培種群體遺傳多樣性可能高于細(xì)莖野生種群體，深層次原因需進(jìn)一步研究。

2.4 差異化的候選區(qū)域及候選基因

利用群體間的群體分化系數(shù)以及核苷酸多樣性比率進(jìn)行選擇性清除分析。使用100 kb的滑動(dòng)窗口以及10 kb步長(zhǎng)分別計(jì)算群體分化系數(shù)和核苷酸多樣性比率，并取基因組前5%的交集區(qū)域作為選擇清除區(qū)域(圖5)。以割手密基因組為參考，分析107份甘蔗差異基因組區(qū)域中的基因。從圖5可見，在栽培種群體和細(xì)莖野生種群體中共檢測(cè)到72個(gè)受選擇區(qū)域，其中439個(gè)基因具有強(qiáng)烈選擇信號(hào)。進(jìn)一步對(duì)選擇性掃描的區(qū)域進(jìn)行基因功能注釋，發(fā)現(xiàn)富集的基因組區(qū)域中包含UBA3、CBP2、GSTU8等與抗性相關(guān)的基因(表2、圖5)。

紅點(diǎn)和藍(lán)點(diǎn)分別表示Fst和多樣性變化倍數(shù)大于95%群體間篩選出的基因組區(qū)域。圖4 甘蔗栽培種與細(xì)莖野生種群體間的差異基因組區(qū)域Figure 4 Different genomic regions between cultivated sugarcane population and wild S.spontaneum population

紅色、藍(lán)色線分別表示基因組前1%、前5%水平的閾值線；對(duì)受選擇區(qū)域的基因進(jìn)行功能注釋分析獲得箭頭所示基因。圖5 甘蔗栽培種與細(xì)莖野生種群體分化系數(shù)在染色體上的整體分布Figure 5 Global Fst distribution between cultivated sugarcane population and wild S.spontaneum population

表2 甘蔗栽培種與細(xì)莖野生種群體間高差異基因組區(qū)域前5% SNP的部分基因Table 2 Partial candidate genes from highly different genomic regions between cultivated sugarcane population and wildS.spontaneum population (top 5% of SNPs in each region)

通過富集的基因進(jìn)行GO注釋和富集分析發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)群體受選擇基因主要富集在泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性過程、核苷酸結(jié)合過程、對(duì)熱的反應(yīng)過程、磷酸蛋白酶活性過程、復(fù)制后修復(fù)過程、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性過程、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性過程、鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程和絲氨酸型羧肽酶活性過程等通路。其中，位于2號(hào)染色體的候選區(qū)域錨定在10.63～10.64 Mb之間，基因Sspon.02G0053560-1C與野生土豆抗病蛋白R(shí)GA2同源[23]，說明抗性基因在選擇性清除中受到選擇。

3 討論

3.1 野生種質(zhì)是拓寬甘蔗遺傳基礎(chǔ)的有效途徑

本研究通過簡(jiǎn)化基因組測(cè)序?qū)?07份甘蔗材料進(jìn)行全基因組SNP標(biāo)記的開發(fā)，獲得7 869 726個(gè)高質(zhì)量的SNP，并進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。利用Admixture軟件對(duì)甘蔗自然群體的群體結(jié)構(gòu)分析表明，K=2時(shí)交叉錯(cuò)誤率最小。因此，107份甘蔗材料劃分成2個(gè)亞群，分別為栽培種群體和細(xì)莖野生種群體。該結(jié)果與進(jìn)化樹和主成分分析結(jié)果一致，說明甘蔗群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果較可靠。值得注意的是，栽培種群體結(jié)構(gòu)存在細(xì)莖野生種血緣的滲透現(xiàn)象。郎榮斌等[24]研究顯示，甘蔗是多倍體植物且為非整倍體，遺傳背景復(fù)雜，經(jīng)過多年人工雜交，有較為明顯的血緣滲透，大多數(shù)推廣的栽培種中混有細(xì)莖野生種的遺傳成分。本研究選用了83份栽培種和24份細(xì)莖野生種，之中的栽培品種是我國(guó)近50年育成及推廣應(yīng)用的品種，細(xì)莖野生種是我國(guó)甘蔗育種中應(yīng)用最多的野生資源[25]。因此，該107份材料在一定程度上能反映我國(guó)甘蔗育成品種的遺傳多樣性。同時(shí)也說明利用甘蔗野生種質(zhì)資源可以拓寬甘蔗遺傳基礎(chǔ)，是提高遺傳多樣性的有效途徑[26]。

3.2 我國(guó)甘蔗栽培品種遺傳多樣性良好

本研究表明，栽培種群體的核苷酸多樣性(π=8.93×10-6)高于細(xì)莖野生種群體(π=6.11×10-6)，可能是因?yàn)樵耘喾N遺傳背景較為復(fù)雜[27]。田春艷等[28]研究統(tǒng)計(jì)，我國(guó)現(xiàn)有甘蔗栽培品種中超過90%的甘蔗含有POJ2878的血緣，栽培品種中大多數(shù)的血緣來自于熱帶種、細(xì)莖野生種和印度種。通過甘蔗的“高貴化”育種[29]，將細(xì)莖野生種作為父本，與熱帶種進(jìn)行雜交并回交以選育出優(yōu)良的品種，說明大多數(shù)甘蔗栽培材料含有細(xì)莖野生種血緣，提高了栽培群體的核苷酸多樣性。

3.3 抗性基因在甘蔗育種中受到選擇

甘蔗栽培品種在選育和生產(chǎn)過程中，經(jīng)常受干旱[30]、寒害[31]、黑穗病[32]和花葉病[33]等脅迫，一定程度上制約了甘蔗的生產(chǎn)。在甘蔗抗性性狀的遺傳改良方面，細(xì)莖野生種使甘蔗種質(zhì)的開發(fā)取得突破性的進(jìn)展。利用分子標(biāo)記挖掘細(xì)莖野生種優(yōu)良的抗性基因有利于提升甘蔗抗逆水平。通過對(duì)107份材料進(jìn)行選擇性清除分析發(fā)現(xiàn)，抗性基因在育種過程中持續(xù)受到選擇。如沈懌丹[34]研究表明，GST家族在作物抗旱、耐鹽、耐高溫等環(huán)境脅迫上起重要作用，并且朱丹等[35]發(fā)現(xiàn)在干旱、高溫脅迫中薄荷GSTU8基因上調(diào)表達(dá)； 殷龍飛等[36]研究發(fā)現(xiàn)，GRAS家族在調(diào)控植物信號(hào)傳導(dǎo)的過程中具有重要作用，在干旱脅迫下作物莖葉部和根部調(diào)控SCL9基因的表達(dá)，SCL9基因是GRAS家族的成員之一。本研究中抗性基因在甘蔗育種過程中得到了強(qiáng)烈的選擇，這能夠?yàn)楦收峥鼓娣肿佑N提供候選基因，并為后續(xù)關(guān)聯(lián)分析挖掘優(yōu)良基因提供參考。