陳芹,徐子浚,林江,錢軍,錢煒

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院 1.中心實驗室,2.血液科,3.耳鼻咽喉頭頸外科,江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

異常的脂質(zhì)代謝是癌細胞的重要特征,并影響許多癌癥相關(guān)的行為,包括細胞生長、增殖、分化和運動[1]。磷脂酰膽堿是真核細胞膜的主要磷脂,在細胞結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能中起著重要作用。溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶1(lysophosphatidylcholine acyltransferase 1,LPCAT1)是細胞膜生物合成中最重要的酶,負責(zé)將溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化為磷脂酰膽堿。研究發(fā)現(xiàn)LPCAT1在各種實體瘤如前列腺癌[2-3]、口腔鱗狀細胞癌[4]、肝癌[5]、乳腺癌[6-7]和肺腺癌[8]中過表達,且其過表達促進了這些實體瘤的進展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。然而,很少有研究報道急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者中LPCAT1的表達態(tài)勢及其臨床意義。因此,本研究檢測AML患者骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells,BMNC)中LPCAT1mRNA的表達,并分析其表達與患者臨床特征的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 病例

本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會批準。60例AML患者均為我院門診和住院患者,男32例、女28例,中位年齡55歲(10～81歲),其中法-美-英(FAB)分型M2型25例,M3型13例,M4型15例,M5型7例。所有患者均簽署書面知情同意書。診斷和分型依據(jù)FAB和世界衛(wèi)生組織(WHO)標準(原始細胞≥20%)結(jié)合免疫表型和細胞遺傳學(xué)分析結(jié)果[9-10]。27名健康捐獻者作為對照組。

1.2 主要試劑和儀器

總RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑(美國MBI Fermentas公司)；PCR擴增試劑購自南京Vazyme公司。PCR引物均由北京華大基因科技有限公司合成。ABI7500 PCR儀(美國ABI公司)；Gene Genius凝膠成像儀(美國Syngene公司)。

1.3 qRT-PCR檢測AML患者骨髓LPCAT1基因表達

1.3.1 BMNC分離和RNA制備 所有患者和對照均抽取10 mL骨髓,肝素抗凝,Ficoll液分離BMNC,依據(jù)廠家說明書使用Trizol試劑提取總RNA,經(jīng)核酸定量儀定量后立即逆轉(zhuǎn)錄或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總RNA逆轉(zhuǎn)錄 將總RNA應(yīng)用六隨機引物逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA(cDNA),總體系40 μL,含2 μg總RNA、10 mmol/L六隨機引物、10 mmol/L dNTPs、80單位RNA酶抑制劑和200單位M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄運行程序為25 ℃ 10 min,42 ℃ 60 min。cDNA于-20℃保存。

1.3.3LPCAT1mRNA檢測 采用Primer 5.0軟件設(shè)計引物。LPCAT1基因上游引物:5′-CGTGA-CCGACCTATTCCGAG-3′,下游引物:5′-GTCTGAGT-TTTCCGGGCTGA-3′。反應(yīng)體系20 μL,包括0.8 μmol/L的特異性引物、20 ng cDNA、0.4 μmol/L的ROX染料和10 μmol/L的AceQTMqPCR SYBR Green Master Mix(Vazyme)。PCR運行條件為95 ℃ 5 min預(yù)變性,95 ℃ 10 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 32 s和80 ℃ 32 s(收集數(shù)據(jù)),共35個循環(huán)。在PCR循環(huán)結(jié)束時,進行熔解曲線分析程序,以驗證PCR產(chǎn)物的特異性。隨機選取PCR擴增產(chǎn)物送北京華大基因科技有限公司測序,測序結(jié)果核對正確。以管家基因ABL作為參照基因,計算LPCAT1mRNA的相對表達水平。LPCAT1相對表達水平通過2-ΔΔCT方法確定。擴增產(chǎn)物在20 g/L瓊脂糖凝膠上100 V電泳40 min,在凝膠成像儀下觀察并拍照。

1.4 細胞遺傳學(xué)檢查

將初診時采集的骨髓細胞采用直接法和24 h短期培養(yǎng)法制備染色體標本,然后進行R顯帶處理,其中2例患者染色體制備失敗。參照文獻[11]進行核型危險分級分類。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,LPCAT1mRNA低表達與患者性別、臨床分型、染色體異常之間的關(guān)系采用Fisher精確概率法或χ2檢驗,連續(xù)變量的差異采用Mann-WhitneyU檢驗進行比較。應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線和ROC曲線下面積(AUC)確定LPCAT1表達在區(qū)分AML患者與健康對照中的價值。所有分析均設(shè)定P值為雙側(cè)分布,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML患者LPCAT1 mRNA表達狀況

選取qRT-PCR結(jié)果中具有LPCAT1和ABL最小ΔCT的健康對照的骨髓標本作參照物,并認為其LPCAT1表達水平為1.000。結(jié)果顯示27例健康對照中LPCAT1mRNA表達水平為0.051～1.000(0.344±0.233)。與對照相比,AML患者LPCAT1mRNA的表達(0.001～0.274)顯著降低(Z=-5.881,P<0.001),見圖1。以LPCAT1mRNA表達水平等于或低于0.041(對照組平均值-1.3倍標準差)判定為LPCAT1mRNA低表達。結(jié)果顯示60例AML患者中27例(45%)存在LPCAT1mRNA低表達,而27例對照均未見LPCAT1mRNA低表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=17.618,P<0.001)。典型的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。

圖1 AML患者和對照組LPCAT1 mRNA相對表達水平

2.2 LPCAT1低表達與AML患者臨床特征的關(guān)系

以0.041為界將AML患者分為LPCAT1低表達組和LPCAT1高表達組,兩組臨床特征及實驗室參數(shù)見表1。LPCAT1低表達組與高表達組在年齡、性別、白細胞計數(shù)、血紅蛋白濃度、血小板計數(shù)等方面均無顯著差異(P>0.05)。所分析的AML亞型中均可見LPCAT1低表達。FAB亞型中,LPCAT1低表達頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同核型危險分級患者LPCAT1低表達頻率差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1-2:健康對照；3-7:AML；8:陽性對照；9:陰性對照圖2 AML患者和對照組LPCAT1基因表達的qRT-PCR電泳結(jié)果

表1 AML患者LPCAT1 mRNA表達與臨床特征的關(guān)系

2.3 LPCAT1 mRNA在AML中的診斷價值

應(yīng)用ROC曲線評估LPCAT1表達區(qū)分AML患者與健康對照的能力,AUC為0.896(95%CI:0.825～0.967,P<0.001),見圖3。當(dāng)LPCAT1mRNA表達的截斷值為0.173時,敏感性和特異性分別為88.3%和81.5%,表明LPCAT1表達水平可作為AML的潛在診斷標志物。

圖3 ROC曲線分析LPCAT1表達診斷AML

3 討論

目前為止,很少有研究報道LPCAT1基因在AML患者骨髓中的表達狀態(tài)。Wang等[12]研究了48例AML患者和20例健康對照外周血樣本中LPCAT1的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AML患者外周血標本中LPCAT1表達顯著增高。然而,外周血標本并不能很好地反映LPCAT1在AML中的表達狀態(tài),因為AML是一種源自骨髓中未成熟髓系祖細胞的惡性疾病,骨髓樣本更具有代表性。本研究結(jié)果表明,與健康對照的骨髓樣本相比,AML患者骨髓樣本中LPCAT1mRNA的表達顯著降低。

已有研究發(fā)現(xiàn)在部分實體瘤中LPCAT1表達上調(diào)且其上調(diào)與腫瘤進展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后不良相關(guān),表明LPCAT1可能在實體瘤中起到癌基因的作用。然而,與實體瘤中的高表達相反,本研究結(jié)果顯示LPCAT1的表達在AML這一非實體腫瘤中明顯下調(diào),說明LPCAT1可能在實體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤(如AML)中發(fā)揮不同的作用。兩者之間LPCAT1表達的差異可能歸因于不同的組織來源和腫瘤病理。實際上,已有研究證實AML中某些基因如特異AT序列結(jié)合蛋白1(SATB1)、RAS相關(guān)區(qū)域家族1A(RASSF1A)和基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1),其表達或功能與實體瘤不同[13-15]。

進一步進行ROC曲線分析顯示,LPCAT1mRNA表達可用于區(qū)分AML與健康對照,AUC為0.896(95%CI:0.825～0.967,P<0.001),截斷值為0.173時具有較高的敏感性和特異性,表明LPCAT1mRNA表達可作為診斷AML的潛在生物標志物,或可用于AML的輔助診斷。

綜上,本研究結(jié)果顯示,LPCAT1低表達是AML發(fā)生過程中的一個常見分子事件,但LPCAT1在AML發(fā)生發(fā)展中的作用機制還有待于進一步研究。