劉子瑤,黃玥,王超,李濤,王晶哲,藺博涵,王子璇,孫曉春,陳華標(biāo)

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.上海市東方醫(yī)院馬歇爾消化道疾病國(guó)際診療中心實(shí)驗(yàn)室,上海 200120；3.哈佛醫(yī)學(xué)院麻省總醫(yī)院疫苗和免疫治療中心,馬薩諸塞州 波士頓 02114)

吸煙不僅對(duì)肺部損傷嚴(yán)重,對(duì)于男性精液的危害更為嚴(yán)重,長(zhǎng)期吸煙者精子的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)都會(huì)降低[1]。尼古丁是煙草中主要的活性成分,又名煙堿,吸入并沉積于機(jī)體內(nèi)會(huì)使機(jī)體生理功能紊亂,導(dǎo)致多組織、器官慢性損傷,引發(fā)肺癌、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等多種疾病發(fā)生[2]。

當(dāng)前我國(guó)不孕不育人數(shù)約占人口比例15%,其中,約50%由男性不育引起[3],已證實(shí)吸煙可致精子氧化損傷、DNA加合物、DNA鏈斷裂、染色體畸變和遺傳突變[4]。尼古丁可通過(guò)多種途徑影響生殖細(xì)胞功能,最終致使機(jī)體出現(xiàn)生精障礙[5]、不育[6-7]。間質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)釋放胞外囊泡和其他介質(zhì)發(fā)揮旁分泌作用,經(jīng)證實(shí)小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的胞外囊泡(mBMMSCs-EVs)和介質(zhì)攜帶有細(xì)胞保護(hù)的相關(guān)信號(hào)[8]。此外,mBMMSCs-EVs包含的DNA、mRNA和蛋白質(zhì)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[9]。mBMMSCs-EVs在小鼠DBA/1模型中具有抗炎作用[10]；同時(shí),其對(duì)組織損傷具有修復(fù)作用[11],但mBMMSCs-EVs對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的生精細(xì)胞損傷的影響尚不清楚。因此,本研究擬以生精細(xì)胞GC-1為研究對(duì)象,探討mBMMSCs-EVs對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的生精細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑及儀器

4～6周齡雄性BALB/c小鼠12只,購(gòu)于江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):No.201926222；小鼠GC-1生精細(xì)胞株(廣州吉妮歐生物科技有限公司)；L-DMEM、RPMI-1640、胰酶、胎牛血清均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；MTT試劑(美國(guó)Amrgsco公司)；二甲基亞砜溶液(上海生工公司)；Transwell小室(美國(guó)Corning公司)；雙抗、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天公司；Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京福麥斯公司)；成骨成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒(美國(guó)Cyagen公司)；CD9兔抗小鼠單克隆抗體、CD63兔抗小鼠單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(上海愛(ài)必信公司)。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10 %胎牛血清、100 U/mL 鏈霉素和100 U/mL青霉素的L-DMEM,于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)原代小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(mBMMSCs),用于收集培養(yǎng)上清液及提取mBMMSCs-EVs。

用含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI-1640,于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)GC-1生精細(xì)胞。

1.3 mBMMSCs提取及鑒定

1.3.1 mBMMSCs提取 脫頸處理BALB/c小鼠,快速放至75%乙醇的燒杯內(nèi)浸泡備用,取股骨和脛骨,沖出骨髓,將沖洗出來(lái)的細(xì)胞懸液收集于離心管中；在20 ℃條件下，600 r/min離心5 min；棄上清液,重懸細(xì)胞懸液并接種于培養(yǎng)瓶；置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中按“1.2”方法培養(yǎng)。

1.3.2 mBMMSCs鑒定 利用流式細(xì)胞儀對(duì)mBMMSCs表面的CD29、CD44、Sca-1和CD117蛋白進(jìn)行鑒定。使用成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)成骨分化3周；PBS沖洗；4%中性甲醛溶液固定30 min；PBS沖洗；茜素紅染色5 min。使用成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和維持培養(yǎng)基交替培養(yǎng)誘導(dǎo)成脂分化2周；PBS沖洗；4%中性甲醛溶液固定30 min；PBS沖洗；油紅O染料工作液染色30 min(工作液配制方法:油紅O貯存液∶蒸餾水=3∶2)。

1.4 mBMMSCs-EVs提取及鑒定

1.4.1 mBMMSCs-EVs提取 待mBMMSCs生長(zhǎng)至80%～90%融合度時(shí),用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,收集上清液；于4 ℃行2 000×g離心20 min；4 ℃行100 000×g超速離心1 h；棄上清液；用PBS重懸沉淀,100 000×g再次超速離心1 h。

1.4.2 mBMMSCs-EVs形態(tài)觀察及粒徑檢測(cè) 取10 μL mBMMSCs-EVs,充分混懸后滴加至銅網(wǎng)上,室溫靜置1 min,用濾紙吸去邊緣液體；取醋酸雙氧鈾10 μL滴加于銅網(wǎng)上,室溫靜置1 min,用濾紙吸去邊緣液體；干燥后置于透射電鏡下觀察mBMMSCs-EVs形態(tài)。取10 μL mBMMSCs-EVs用雙蒸水稀釋至30 μL；用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行粒徑分析儀器性能檢測(cè),合格后行mBMMSCs-EVs上樣,進(jìn)行梯度稀釋避免樣本堵塞進(jìn)樣針；對(duì)合適濃度的處于布朗運(yùn)動(dòng)中的mBMMSCs-EVs 進(jìn)行捕捉和分析,即可獲得mBMMSCs-EVs的粒徑和濃度信息。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)mBMMSCs-EVs分子標(biāo)志物CD9和CD63表達(dá) 取100 μL純化后的mBMMSCs-EVs,與RIPA 裂解液等體積混勻,放置冰上10 min,振蕩 1 min,重復(fù)操作3次；完全裂解后4 ℃、15 000×g離心15 min,取上清液,用 BCA 法測(cè)定其蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液,煮沸 8 min；緩慢加樣行SDS-PAGE(150 V,45 min)；350 A恒流2 h,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；脫脂奶粉封閉 2 h；分別加入CD9和CD63(1∶500)一抗孵育過(guò)夜；TBST 洗膜；加入HPR標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h；TBST洗膜3次；ECL 曝光顯影。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GC-1生精細(xì)胞增殖能力

生精細(xì)胞GC-1分別用含0、8、16、32 μg/mL尼古丁的RPMI-1640處理24 h；收集細(xì)胞,以2×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔板,設(shè)置4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、24、48和72 h),每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔；分別按照所設(shè)時(shí)間點(diǎn),每孔加入20 μL MTT試劑(5 mg/mL)；4 h后加入150 μL二甲基亞砜溶液,置于搖床上低速振蕩10 min,以確保結(jié)晶充分溶解；酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處各孔光密度(D)值,并計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組D值-空白組D值)/(對(duì)照孔D值-空白組D值)×100%。另外,生精細(xì)胞GC-1用32 μg/mL 尼古丁預(yù)處理24、48、72 h后,分別用0、50、100、200 μg/mL 胞外囊泡處理24 h,步驟同上。篩選最適濃度的尼古丁和胞外囊泡進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 GC-1生精細(xì)胞遷移及凋亡實(shí)驗(yàn)

1.6.1 細(xì)胞分組 將GC-1生精細(xì)胞分為對(duì)照組、尼古丁組和尼古丁+胞外囊泡組。對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng)；尼古丁組:32 μg/mL尼古丁預(yù)處理24 h后常規(guī)培養(yǎng)24 h；尼古丁+胞外囊泡組:32 μg/mL尼古丁預(yù)處理24 h后加入200 μg/mL 的mBMMSCs-EVs處理細(xì)胞24 h。

1.6.2 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GC-1生精細(xì)胞遷移能力 收集各組細(xì)胞,計(jì)數(shù),先于下室中加入600 μL含10%胎牛血清的營(yíng)養(yǎng)液,再以1×105/孔細(xì)胞重懸于200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中；將細(xì)胞懸液滴加于Transwell小室上室中,于37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)8 h；吸干上室內(nèi)液體,用棉簽除去上室中未遷移細(xì)胞；PBS洗3～4遍；將小室于4%多聚甲醛中固定30 min；PBS洗3～4遍；結(jié)晶紫染色30 min；PBS洗3～4遍；隨機(jī)選擇3個(gè)視野,計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞遷移數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)GC-1生精細(xì)胞凋亡情況 收集各組細(xì)胞,用PBS洗滌2次,避光條件下用AnnexinV-FITC和PI染色30 min。用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 mBMMSCs的鑒定

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mBMMSCs(圖1A),此時(shí)標(biāo)志物CD29、CD44和Sca-1呈陽(yáng)性(>95%),CD117則呈陰性(<5%)。

經(jīng)成骨誘導(dǎo)3周后,細(xì)胞慢慢由長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變成不規(guī)則的多邊形,茜素紅染色后可以在鏡下觀察到胞質(zhì)呈紅色(圖1B)。成脂誘導(dǎo)2周后,細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變成橢圓形,通過(guò)油紅O染色可以觀察到細(xì)胞胞質(zhì)中布滿橘紅色的脂滴,脂滴具有較強(qiáng)的折光性(圖1C)。由此說(shuō)明,提取的細(xì)胞即為mBMMSCs。

2.2 mBMMSCs-EVs的觀察和鑒定

由圖2可見(jiàn),通過(guò)透射電鏡觀察顯示,mBMMSCs-EVs形態(tài)呈典型的“杯盤(pán)”狀,粒徑分布在30～200 nm,主要集中在110 nm附近。蛋白印跡法檢測(cè)顯示mBMMSCs-EVs表達(dá)CD9和CD63,由此提示成功分離mBMMSCs-EVs。

A:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)志物；B:成骨誘導(dǎo)分化(100×)；C:成脂誘導(dǎo)分化(200×)圖1 小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

A:透射電子顯微鏡觀察mBMMSCs-EVs形態(tài)；B:納米顆粒跟蹤分析mBMMSCs-EVs粒徑分布；C:蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)mBMMSCs-EVs表面標(biāo)志圖2 小鼠間質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的胞外囊泡的鑒定

2.3 mBMMSCs-EVs對(duì)尼古丁誘導(dǎo)損傷GC-1生精細(xì)胞增殖能力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3),與0 μg/mL尼古丁相比,32 μg/mL尼古丁作用24、48、72 h時(shí)GC-1生精細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.05或<0.01),8、16 μg/mL尼古丁作用24、48、72 h時(shí)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。由此確定24 h,32 μg/mL尼古丁作為最適作用時(shí)間和濃度。

由圖3可見(jiàn),與0 μg/mL胞外囊泡組相比,24、48、72 h時(shí),200 μg/mL胞外囊泡組細(xì)胞增殖能力明顯增加(P<0.05或<0.01)；48、72 h時(shí),100 μg/mL胞外囊泡組細(xì)胞增殖能力增加,50、100 μg/mL胞外囊泡作用24 h及50 μg/mL胞外囊泡作用48、72 h時(shí)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此說(shuō)明,mBMMSCs-EVs可以逆轉(zhuǎn)尼古丁對(duì)GC-1生精細(xì)胞增殖能力的抑制。因此,選擇24 h,200 μg/mL mBMMSCs-EVs作為胞外囊泡修復(fù)尼古丁損傷GC-1生精細(xì)胞最適作用時(shí)間和濃度。

a:P<0.05,b:P<0.01,與同時(shí)間點(diǎn)0 μg/mL尼古丁組比較；c:P<0.05,d:P<0.01,與同時(shí)間點(diǎn)0 μg/mL胞外囊泡組比較圖3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組處理不同時(shí)間后GC-1生精細(xì)胞的增殖能力

2.4 mBMMSCs-EVs對(duì)尼古丁誘導(dǎo)損傷GC-1細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell遷移結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,尼古丁組GC-1生精細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少(t=3.405,P<0.01)；尼古丁+胞外囊泡組的生精細(xì)胞遷移數(shù)量較尼古丁組明顯增多(t=3.625,P<0.05),見(jiàn)圖4。由此說(shuō)明mBMMSCs-EVs可以部分逆轉(zhuǎn)尼古丁對(duì)生精細(xì)胞遷移的抑制。

a:P<0.01,與對(duì)照組相比；b:P<0.05,與尼古丁組相比圖4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同組GC-1生精細(xì)胞遷移能力(×100)

2.5 mBMMSCs-EVs對(duì)尼古丁誘導(dǎo)損傷GC-1細(xì)胞凋亡能力的影響

結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,尼古丁組GC-1生精細(xì)胞凋亡率明顯增高(t=13.010,P<0.01)；與尼古丁組相比,尼古丁+胞外囊泡組細(xì)胞凋亡率明顯降低(t=5.889,P<0.01)。見(jiàn)圖5。由此表明,mBMMSCs-EVs可以逆轉(zhuǎn)尼古丁引起的GC-1生精細(xì)胞凋亡。

a:P<0.01,與對(duì)照組相比；b:P<0.01,與尼古丁組相比圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組GC-1生精細(xì)胞凋亡率

3 討論

本研究采用生精細(xì)胞GC-1作為尼古丁誘導(dǎo)損傷生精模型；32 μg/mL尼古丁作用24 h時(shí),GC-1細(xì)胞增殖率明顯降低,200 μg/mL胞外囊泡作用尼古丁誘導(dǎo)損傷細(xì)胞24 h時(shí),細(xì)胞增殖率明顯增高。由此表明,mBMMSCs-EVs可以逆轉(zhuǎn)尼古丁對(duì)GC-1生精細(xì)胞增殖能力的抑制。

本研究中,與尼古丁組相比,尼古丁+胞外囊泡組的細(xì)胞遷移數(shù)量明顯增加、細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少,說(shuō)明mBMMSCs-EVs可逆轉(zhuǎn)尼古丁對(duì)GC-1生精細(xì)胞的遷移抑制和凋亡促進(jìn),可一定程度修復(fù)尼古丁對(duì)GC-1生精細(xì)胞的損傷。有研究表明,間充質(zhì)干細(xì)胞可以促使心臟修復(fù)[12],促進(jìn)燒傷創(chuàng)面再生[13]。mBMMSCs-EVs相較于間充質(zhì)干細(xì)胞更利于制造儲(chǔ)存,更具有生物活性[14],在受損的組織或細(xì)胞中,mBMMSCs-EVs可以替代間充質(zhì)干細(xì)胞用于治療并且更加優(yōu)化[15]。例如,mBMMSCs-EVs治療可修復(fù)受損的腎上腺組織,并使其功能得到較大程度的恢復(fù)[16],治療人角膜內(nèi)皮細(xì)胞可促使傷口愈合速度加快[17],本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相一致。此外,有研究表明,人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的胞外囊泡可促進(jìn)施萬(wàn)細(xì)胞增殖和遷移，有助于受損的周圍神經(jīng)修復(fù)[18],這表明除mBMMSCs-EVs之外,其他來(lái)源的胞外囊泡也具有修復(fù)能力。

綜上所述,本研究分離的mBMMSCs-EVs對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的GC-1生精細(xì)胞損傷有一定的修復(fù)作用。目前關(guān)于mBMMSCs-EVs修復(fù)尼古丁誘導(dǎo)的生精細(xì)胞損傷的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和潛在機(jī)制研究并不完善,有待后續(xù)進(jìn)一步研究。