丁英杰，諸寅，沈玲金，蔡佳玲

（浙江清華長三角研究院，浙江 嘉興 314006）

在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)日益發(fā)展的同時，農(nóng)藥大量使用和重金屬排放對生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的影響。2014 年發(fā)布的全國污染狀況調(diào)查公報顯示，銅、鋅污染物點位超標(biāo)率分別為2.1%和0.9%。雖然銅和鋅是生物體不可缺少的微量元素，但土壤中過量的銅和鋅會對植物生長造成影響，并產(chǎn)生毒害作用[1]。且銅和鋅等重金屬一旦進入生態(tài)環(huán)境則難以被生物降解[2]。我國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥使用量居世界第一，每年進入環(huán)境的農(nóng)藥高達使用量的80%～90%[3]。我國有機磷農(nóng)藥產(chǎn)量占全球產(chǎn)量的1/3，有機磷農(nóng)藥占國內(nèi)農(nóng)藥的1/2以上。據(jù)丁浩東等[4]對環(huán)境中有機磷污染情況進行的統(tǒng)計，全國水體中農(nóng)藥平均濃度最高的是樂果（187.37 ng·L?1），其在杭嘉湖被檢出的最大濃度達到30 180 ng·L?1。

方貴楨等[5]的研究表明，發(fā)光菌在重金屬離子毒性測試方面具有較高的靈敏度。賈玉玲等[6]的研究表明，發(fā)光菌檢測已經(jīng)充分應(yīng)用于有機磷農(nóng)藥檢測。宋明霞等[7]和岳東等[8]的研究表明，重金屬和有機磷農(nóng)藥都具有一定的胚胎發(fā)育毒性。此外，在環(huán)境廢水生物毒性檢測中發(fā)現(xiàn)，重金屬和農(nóng)藥混合后普遍存在聯(lián)合毒性效應(yīng)[9]。在生態(tài)環(huán)境中會遇到有機磷農(nóng)藥與重金屬的混合污染情況，其中樂果與重金屬的混合污染也會存在，現(xiàn)已有學(xué)者對兩者的單一毒性效應(yīng)和機理進行了研究，但對這兩類物質(zhì)聯(lián)合毒性的研究還很少。

本試驗采用明亮發(fā)光桿菌和斑馬魚胚胎作為受試模式生物，研究銅、鋅與樂果的單一毒性以及構(gòu)成的二元混合體的聯(lián)合毒性。通過混合毒性指數(shù)法（MTI法）評價其聯(lián)合毒性效應(yīng)，為有機磷農(nóng)藥與重金屬復(fù)合污染的生態(tài)風(fēng)險評估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

倒置顯微鏡，日本Nikon MFA33402；細胞培養(yǎng)板，美國Corning Costar；微孔板型多功能檢測儀，美國Promega公司GloMax?Multi2011ZSIR0369US。

主要試劑七水硫酸銅、醋酸鋅、氯化鈉和氯化汞均為分析純；樂果為市售常規(guī)乳油劑型農(nóng)藥，有效成分含量40%（以下均用樂果簡稱）。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)光菌生物毒性試驗

從?20 ℃儲藏室取出明亮發(fā)光細菌凍干粉，用移液槍吸取1 mL 2.5%氯化鈉注入凍干粉西林瓶，冰水浴復(fù)蘇備用。取復(fù)蘇后的發(fā)光菌液0.1 mL，用2.5%氯化鈉溶液稀釋到10 mL，使用微孔多功能檢測儀測定初始發(fā)光強度。

（1）單一毒性試驗

按對數(shù)將樣品液稀釋成5 個濃度，分別為100%、10%、1%、0.1%和0.01%，每個濃度設(shè)置3 個平行，同時將96 孔板第一行設(shè)置為陰性質(zhì)控，第二行為陽性質(zhì)控。各孔中加入樣品液1 μL，3%氯化鈉溶液179μL 和菌液20μL，總體積為200μL，放入儀器進行測試。在預(yù)試驗得到的抑制率范圍0～100%之間設(shè)計5濃度，進行毒性測試。暴露時間分別為15 min 和30 min，并計算EC50。

（2）聯(lián)合毒性試驗

根據(jù)銅、鋅和樂果對明亮發(fā)光桿菌的單一毒性試驗結(jié)果，配制相應(yīng)濃度的樂果?銅和樂果?鋅溶液。混合物中各組分的濃度為各自暴露15 min 時EC50的濃度，將混合物進行毒性測試，并計算15 min 和30 min時的EC50。

1.2.2 斑馬魚胚胎發(fā)育毒性試驗

取用實驗室純化培養(yǎng)的斑馬魚成魚孵化胚胎，并用倒置顯微鏡篩選出正常分裂的斑馬魚胚胎備用。

（1）單一毒性試驗

設(shè)定預(yù)試驗的濃度為100%、50%、25%、12.5%、6.25%，每個濃度設(shè)置3個平行。選用透明24 孔細胞培養(yǎng)板進行測試，每塊板均設(shè)置4 個空白對照組，將培養(yǎng)板置于（26±0.5）℃的培養(yǎng)箱中進行測試。每隔24 h 用顯微鏡觀察斑馬魚胚胎死亡情況并記錄，最終結(jié)果以72 h 半致死率LC50表示，并根據(jù)此結(jié)果得到正式試驗的染毒濃度。在預(yù)試驗得到的抑制率范圍0～100%之間設(shè)計5 濃度，再進行毒性測試。

（2）聯(lián)合毒性試驗

根據(jù)銅、鋅和樂果對斑馬魚胚胎的單一毒性試驗結(jié)果，配制相應(yīng)濃度的樂果?銅和樂果?鋅溶液。混合物中各組分濃度為各自72 h半致死率LC50的濃度，將混合物進行毒性測試，測得72 h致死率LC50濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 試驗數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Origin 軟件對各稀釋濃度的抑制率、致死率進行數(shù)據(jù)擬合，根據(jù)擬合后的曲線計算獲得明亮發(fā)光桿菌暴露15 min 和30 min 的EC50以及斑馬魚胚胎的半致死率LC50。

1.3.2 混合毒性指數(shù)法計算聯(lián)合毒性

式中：Ui為混合物中各組分的毒性單位；Ui，max為混合物中所有組分毒性單位的最大值。IMT為混合毒性指數(shù)[10]。

根據(jù)IMT值對聯(lián)合毒性的類型進行判斷：當(dāng)IMT=1時，為簡單相加作用；當(dāng)IMT＜0 時，為拮抗作用；當(dāng)IMT＞1 時，為協(xié)同作用；當(dāng)IMT=0 時，為獨立作用；當(dāng)0＜IMT＜I時，為部分相加作用。

2 結(jié)果與討論

2.1 明亮發(fā)光桿菌

2.1.1 單一毒性

樂果和重金屬銅、鋅對明亮發(fā)光桿菌的單一毒性結(jié)果見表1，從表中可知，樂果、銅和鋅對明亮發(fā)光桿菌的急性毒性不同。在一定濃度范圍內(nèi)明亮發(fā)光桿菌的抑制率與樣本濃度呈正比，且對明亮發(fā)光桿菌的急性毒性順序為銅＞鋅＞樂果，銅和鋅的毒性順序與其他學(xué)者的研究結(jié)果[11]一致。單一毒性試驗結(jié)果顯示，明亮發(fā)光桿菌對銅和鋅更敏感，可能原因是重金屬會引起水生細菌細胞內(nèi)產(chǎn)生破壞細胞結(jié)構(gòu)和功能的活性氧，從而直接導(dǎo)致細菌死亡。此外試驗中發(fā)現(xiàn)菌液的初始濃度對于試驗結(jié)果也有較大影響，所以試驗中需要將發(fā)光菌菌液的濃度控制在一定的范圍。從表1 可知，暴露30 min 的毒性相較于15 min 增加不明顯，故不再延長暴露時間。

表1 樂果、銅和鋅對明亮發(fā)光桿菌的EC50（mg·L?1）Table 1 The EC50 of dimethoate，copper and zinc to photobacterium phoshoreum（mg·L?1）

2.1.2 聯(lián)合毒性

樂果和重金屬銅、鋅對明亮發(fā)光桿菌的聯(lián)合毒性測試結(jié)果列于表2。通過IMT進行評價，從表3 可知兩類物質(zhì)同時存在對明亮發(fā)光菌的毒性增強，其部分相加毒性作用機制可能是由于兩類物質(zhì)形成了親脂性絡(luò)合物，從而促進了細胞對金屬離子的吸收和累積。

表2 混合物中對生物產(chǎn)生半抑制影響的各組分濃度（mg·L?1）Table 2 Concentrations of components in a mixture with half inhibitory effects on organisms（mg·L?1）

表3 樂果與銅、鋅混合物聯(lián)合毒性評價Table 3 The joint toxicity evaluation of dimethoate?copper and dimethoate?zinc

2.2 斑馬魚胚胎法

2.2.1 單一毒性

樂果、重金屬銅和鋅對斑馬魚胚胎暴露72 h后的LC50分別是0.31、1.67 mg·L?1和369 mg·L?1。從測試結(jié)果可知，在一定濃度范圍內(nèi)斑馬魚胚胎的致死率與樣本濃度呈正比，且對斑馬魚胚胎的急性毒性順序為樂果＞銅＞鋅。從結(jié)果中可以看出銅的毒性遠大于鋅，這可能是因為銅會引起細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致線粒體數(shù)量減少進而造成細胞凋亡。而樂果具有抗膽堿酯酶的作用，可降低斑馬魚鰓和肝臟的活性，因此可能導(dǎo)致比重金屬對斑馬魚胚胎更大的影響。

2.2.2 聯(lián)合毒性

樂果和重金屬銅、鋅對斑馬魚胚胎的聯(lián)合毒性測試結(jié)果列于表4。從聯(lián)合毒性測試結(jié)果可知，樂果?重金屬二元混合物的濃度與其對斑馬魚胚胎的致死率相關(guān)。通過IMT進行評價，從表5可知兩類物質(zhì)同時存在時對斑馬魚胚胎的聯(lián)合毒性有明顯的增強。樂果在杭嘉湖地區(qū)污染嚴(yán)重，且土壤環(huán)境中銅和鋅含量普遍較高，因此兩者的混合污染不可避免地對生物造成危害。同時長時間暴露導(dǎo)致的兩類物質(zhì)的聯(lián)合毒性不容忽視，其中樂果與銅的聯(lián)合毒性風(fēng)險更大。

表4 混合物中對斑馬魚胚胎產(chǎn)生半致死影響的各組分濃度（mg·L?1）Table 4 The concentration of each component in the mixture with half lethal effect on zebrafish（Danio rerio）eggs（mg·L?1）

表5 樂果與銅、鋅混合物聯(lián)合毒性評價Table 5 The joint toxicity evaluation of copper?dimethoate and zinc?dimethoate

3 結(jié)論

（1）在單一物質(zhì)情況下，重金屬銅和鋅比有機磷農(nóng)藥樂果對水生細菌的急性毒性更強，而有機磷農(nóng)藥樂果對斑馬魚胚胎的影響比重金屬更大。

（2）在混合物充分暴露的條件下，樂果?銅和樂果?鋅的混合物對明亮發(fā)光桿菌和斑馬魚胚胎的聯(lián)合毒性均得到增強，表明兩類物質(zhì)同時存在時會促進雙方的急性毒性。

（3）聯(lián)合毒性測試結(jié)果表明，樂果?銅和樂果?鋅的斑馬魚胚胎混合毒性指數(shù)高于明亮發(fā)光桿菌，表明樂果與重金屬的聯(lián)合毒性對斑馬魚胚胎的影響更大。兩類物質(zhì)在環(huán)境中的殘留會對水生生物及其他生物造成潛在危害。