朱國(guó)繁, 應(yīng)蓉蓉，鄧紹坡，孔令雅，錢家忠 *，孫明明，朱 瑜，葉 茂

土著菌群與蚯蚓腸道菌群共享核心物種協(xié)同抵御滅蟻靈脅迫研究①

朱國(guó)繁1, 應(yīng)蓉蓉2，鄧紹坡2，孔令雅2，錢家忠1 *，孫明明3，朱 瑜4，葉 茂5 *

(1合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，合肥 230009；2生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042；3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095；4海南大學(xué)政治與公共管理學(xué)院，?？?570208；5中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008)

采集實(shí)際場(chǎng)地中不同濃度梯度(0 ～ 27.7 mg/kg)滅蟻靈污染土壤，設(shè)置蚯蚓土培試驗(yàn)，采用高通量測(cè)序技術(shù)，分析蚯蚓腸道菌群和土著菌群的結(jié)構(gòu)和功能；通過MetagenomeSeq分析、LEfSe(linear discriminant analysis effect size)分析和隨機(jī)森林(random forests)分析以及網(wǎng)絡(luò)分析，識(shí)別其核心類群。發(fā)現(xiàn)：①滅蟻靈脅迫下蚯蚓腸道菌群相較土著菌群的結(jié)構(gòu)、組成受到的擾動(dòng)更顯著(<0.05)；②不同濃度梯度滅蟻靈脅迫下，蚯蚓腸道菌群和土著菌群組合存在穩(wěn)定的核心物種，主要為氣單胞菌屬()、黃桿菌屬()、蓋勒氏菌屬()、微枝形桿菌屬()、地桿菌屬()、亨氏菌()、；③這些核心種群在互作網(wǎng)絡(luò)的平均度中心性、緊密中心性、特征向量中心性分別為136.72、0.44、0.52，均高于非核心種群的對(duì)應(yīng)指標(biāo)(91.52、0.42、0.33)，表明核心種群具有更高的網(wǎng)絡(luò)連通性，且此類核心種群具有碳氮轉(zhuǎn)化和農(nóng)藥降解能力，說明蚯蚓腸道菌群和土著菌群可以通過共享核心物種與其他微生物聯(lián)系緊密，具備發(fā)揮農(nóng)藥降解代謝的潛在功能，實(shí)現(xiàn)協(xié)同抵御土壤中滅蟻靈脅迫。

滅蟻靈；土著菌群；蚯蚓腸道菌群；核心物種

滅蟻靈是典型的有機(jī)氯農(nóng)藥，在2004年被納入國(guó)際公約《斯德哥爾摩公約》(Stockholm Convention)作為管控對(duì)象。我國(guó)在履行斯德哥爾摩國(guó)際公約以及“退二進(jìn)三”“退城進(jìn)園”等政策深入實(shí)施的過程中[1]，遺留大量滅蟻靈污染場(chǎng)地，造成部分表層土壤中滅蟻靈濃度甚至可達(dá)61.9 mg/kg[2-3]，存在較大的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅人類健康和生態(tài)安全。

針對(duì)此類農(nóng)藥污染場(chǎng)地，我國(guó)已陸續(xù)開展大量修復(fù)工作，其中微生物修復(fù)技術(shù)因其環(huán)境友好、高效等特點(diǎn)而被廣泛運(yùn)用[4]。土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)過程中的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，包括土壤養(yǎng)分循環(huán)、植物生長(zhǎng)和生物地球化學(xué)過程[5]。蚯蚓作為土壤環(huán)境中生物量最大的土壤動(dòng)物之一，參與土壤環(huán)境各種代謝過程，對(duì)維持土壤內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境具有重要意義[6]。目前，針對(duì)土著菌群和蚯蚓腸道菌群在污染土壤環(huán)境體系中的研究，主要為土著菌群或蚯蚓腸道菌群對(duì)土壤污染物的降解作用，以及在該環(huán)境中單獨(dú)發(fā)揮的生物功能，很少涉及土著菌群和蚯蚓腸道菌群組合的功能分析。微生物群落的功能分析較為常見的方法是構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)來識(shí)別核心種群，剖析核心種群特征揭示整個(gè)微生物群落的生態(tài)功能[7]。目前一些包括差異分析在內(nèi)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法常被用于分析土壤和腸道微生物群落樣本組，因此，此類方法是識(shí)別核心種群的有效方法[8]。

本研究以土著菌群和蚯蚓腸道菌群為研究對(duì)象，使用高通量測(cè)序技術(shù)，測(cè)定不同濃度滅蟻靈脅迫下土壤和蚯蚓腸道中微生物群落，探究不同濃度滅蟻靈脅迫下，土著菌群和蚯蚓腸道菌群的演變過程；通過3種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：MetagenomeSeq分析、LefSe (linear discriminant analysis effect size) 分析和隨機(jī)森林(random forests)分析，獲知樣本可操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)的具體分類位置和顯著程度，篩選具有分類學(xué)特征或規(guī)律的差異物種，作為本試驗(yàn)微生物群落的核心物種；通過網(wǎng)絡(luò)分析，剖析核心種群在滅蟻靈脅迫土壤環(huán)境中的生態(tài)功能。本研究結(jié)果可為探明土著菌群與蚯蚓腸道菌群共享核心物種在抵御土壤中有機(jī)氯農(nóng)藥毒害脅迫的協(xié)同機(jī)制，提供新的科學(xué)認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 供試生物和污染土壤

供試威廉腔環(huán)毛蚓()購(gòu)自江陰市郊區(qū)附近農(nóng)場(chǎng)，選擇生長(zhǎng)良好，表皮無損傷，有明顯環(huán)帶，體重在3 g ± 0.5 g的成年蚯蚓。

采集江蘇省江陰市青陽鎮(zhèn)某滅蟻靈污染場(chǎng)地表層土(0 ～ 20 cm)，自然風(fēng)干、混合均勻后，使用氣相色譜儀測(cè)定獲取農(nóng)藥濃度信息[9]。選取土壤樣本中不同濃度梯度(T0，0 mg/kg；T1，1.2 mg/kg；T2，5.4 mg/kg；T3，27.7 mg/kg)滅蟻靈污染土壤作為試驗(yàn)土壤。

1.2 蚯蚓土培試驗(yàn)

采購(gòu)的成年蚯蚓使用清水清洗后，清腸24 h，無菌水洗凈。稱量T0、T1、T2、T3土壤各500 g(每組3個(gè)平行)，每份土壤投放10條清腸的威廉腔環(huán)毛蚓，置于透氣黑色花盆(直徑15 cm，高20 cm)中培養(yǎng)，稱重，進(jìn)行為期14 d的土培試驗(yàn)。試驗(yàn)期間每天添水至初始質(zhì)量，直至試驗(yàn)周期結(jié)束。培養(yǎng)結(jié)束后，不同處理組中均無蚯蚓死亡，收集不同處理中的土壤和存活的蚯蚓，取腸道內(nèi)容物充分混勻，–80 ℃冷藏。T0、T1、T2、T3處理組中蚯蚓腸道內(nèi)容物和土壤樣本分別記為E_T0、E_T1、E_T2、E_T3和S_T0、S_T1、S_T2、S_T3(T0為對(duì)照組)。根據(jù)Ye等[9]的檢測(cè)方法，測(cè)定培育周期前后不同處理組土壤基本理化性質(zhì)、農(nóng)藥濃度變化以及蚯蚓腸道對(duì)農(nóng)藥的富集系數(shù)，結(jié)果如表1所示。

1.3 高通量測(cè)序

①DNA的提?。河肈Neasy PowerSoil試劑盒(QIAGEN)提取土壤和蚯蚓腸道內(nèi)容物中微生物細(xì)胞的DNA，–80 ℃下冷藏；②引物設(shè)計(jì)：根據(jù)微生物核糖體RNA和特定基因片段序列中的保守區(qū)域，合成帶有Barcode的特異引物對(duì)樣本的16S rRNA V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，前端引物為515F (5′-GTGCCAGCM GCCGCGGTAA-3′)，反向引物為806R (5′-CCG TCAATTCMTTTRAGTTT-3′)；③雙端測(cè)序：采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫，使用MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行雙端測(cè)序；④DADA2序列去噪：調(diào)用qiime cutadapt trim-paired切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列，通過qiime dada2 denoise-paired調(diào)用DADA2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體，得到50 943 ～ 81 094條序列；⑤進(jìn)行物種分類學(xué)注釋：選用Greengenes數(shù)據(jù)庫采用QIIME2的classify-sklearn算法[10]，即對(duì)于每個(gè)OTU的代表序列，在QIIME2軟件中使用默認(rèn)參數(shù)，使用預(yù)先訓(xùn)練好的Naive Bayes分類器進(jìn)物種注釋；⑥OTU抽平：采用稀疏(Rarefaction)的方法，通過從每個(gè)樣本中分別隨機(jī)抽取最低樣本序列量的95%，計(jì)算物種多樣性和組成[11]。

表1 土壤基本理化性質(zhì)、農(nóng)藥濃度變化及蚯蚓腸道對(duì)農(nóng)藥的富集系數(shù)

1.4 功能潛能預(yù)測(cè)

①將已知微生物基因組的16S rRNA基因序列進(jìn)行對(duì)齊，構(gòu)建進(jìn)化樹，并推斷它們共同祖先的基因功能譜；②將16S rRNA特征序列與參考序列對(duì)齊，從而構(gòu)建新的進(jìn)化樹；③使用Castor隱藏狀態(tài)預(yù)測(cè)算法，依據(jù)進(jìn)化樹中參考序列所對(duì)應(yīng)的基因家族拷貝數(shù)，推測(cè)特征序列的最近序列物種，進(jìn)而獲得其基因家族拷貝數(shù)；④結(jié)合各樣本的特征序列豐度，計(jì)算各樣本的基因家族拷貝數(shù)；⑤將基因家族“映射”到MetaCyc和KEGG數(shù)據(jù)庫中，使用MinPath推斷代謝通路的存在，獲得各樣本中代謝通路的豐度數(shù)據(jù)。

1.5 MetagenomeSeq分析

使用獲取的OTU數(shù)據(jù)，依據(jù)分組情況，每?jī)山M配對(duì)，調(diào)用fitFeatureModel函數(shù)使用zero-inflated log-normal model對(duì)每個(gè)OTU的分布進(jìn)行擬合，并使用該模型的擬合結(jié)果判別土著菌群和蚯蚓腸道菌群中不同物種的差異顯著性。該分析在R程序中進(jìn)行(metagenomeSeq包)。

1.6 LEfSe分析

使用獲取的OTU數(shù)據(jù)，將非參數(shù)的Kruskal- Wallis以及Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，與線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)效應(yīng)量(effect size)相結(jié)合對(duì)所有物種分類水平豐度同時(shí)進(jìn)行差異分析，尋找土著菌群和蚯蚓腸道菌群之間穩(wěn)健的差異物種。該分析在R程序中進(jìn)行(ggplot2包)。

1.7 隨機(jī)森林分析

使用獲取的OTU數(shù)據(jù)，以及分類水平在屬的分類單元豐度表，調(diào)用“qiime sample-classifier classify- samples-ncv”命令進(jìn)行巢式分層交叉檢驗(yàn)分析(10倍交叉檢驗(yàn))。該分析在QIIME2 (2019.4)中進(jìn)行。

1.8 網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)物種豐度特征(屬水平)在R程序(psych包)中生成Pearson相關(guān)性矩陣，在軟件Gephi-0.9.2中繪制T0-T1、T0-T2、T0-T3處理組蚯蚓腸道菌群和土著菌群共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.9 雙因素方差分析

采用SPSS(IBM SPSS statistics 24)和R程序(Version 3.5.0)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度滅蟻靈脅迫下土著菌群和蚯蚓腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成

不同濃度梯度滅蟻靈處理組培育14 d前后，土壤中農(nóng)藥濃度、有機(jī)質(zhì)、pH等理化性質(zhì)未發(fā)生顯著變化(表1)。通過高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在土著菌群和蚯蚓腸道菌群中，均檢測(cè)出古菌和細(xì)菌群落，但土著菌群和蚯蚓腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成差異顯著(圖1)。土著菌群以黃桿菌屬(，22.3%)、氣單胞菌屬(，7.1%)、希瓦氏菌屬(，2.3%) 為優(yōu)勢(shì)屬；蚯蚓腸道菌群以貪銅菌屬(，8.0%)、微枝形桿菌屬(，3.9%)、伯克霍爾德菌屬(，2.4%)為優(yōu)勢(shì)屬(圖1)。樣本中土著菌群包含9 314個(gè)OTU，蚯蚓腸道菌群包含6 134個(gè)OTU，其中1 554個(gè)為共有OTU。土著菌群的OTU種類多于蚯蚓腸道菌群，而且其豐富度指數(shù)(Chao1、Observed_species)、多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson、Faith’s PD)和均勻度指數(shù)(Pielou’s evenness)也均高于蚯蚓腸道菌群(表2)。此外，不同濃度梯度滅蟻靈脅迫下，蚯蚓腸道菌群相比較土著菌群，其結(jié)構(gòu)組成變化更顯著(<0.05)，尤其是T3處理組中微生物群落變動(dòng)幅度更為明顯。

2.2 土著菌群和蚯蚓腸道菌群的功能路徑預(yù)測(cè)

土著菌群和蚯蚓腸道菌群在MetaCyc第一層次通路均以“生物合成(biosynthesis)”通路豐度最高,分別為60.9% 和61.1%；第二層次通路以“氨基酸生物合成(amino acid biosynthesis)”通路豐度最高，分別為14.3% 和15.6%(圖2)。土著菌群和蚯蚓腸道菌群在KEGG第一層次通路均以“代謝(metabolism)”通路豐度最高，分別為81.7% 和81.5%；第二層次通路以“碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)”通路豐度最高，分別為13.0% 和13.5%(圖3)。因此，不同濃度梯度滅蟻靈脅迫下，蚯蚓腸道菌群和土著菌群具有相似的功能通路豐度分布特性。

(圖A為樣本組的PCA分析。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本(取平行組均值)，不同顏色的點(diǎn)指示不同樣本組。兩點(diǎn)在坐標(biāo)軸上的投影距離越近，表明這兩個(gè)樣本間的物種豐度組成在相應(yīng)維度中越相似，橢圓形虛線圈為95% 置信橢圓(即該樣本組100個(gè)樣本中會(huì)有95個(gè)落在其中)；圖B為蚯蚓腸道菌群和土著菌群相對(duì)豐度前20位的屬。橫坐標(biāo)為不同的樣本組，縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)的相對(duì)豐度值)

表2 土著菌群和蚯蚓腸道菌群的多樣性指數(shù)

(橫坐標(biāo)為功能通路的豐度(平均相對(duì)豐度)；縱坐標(biāo)左側(cè)為MetaCyc第二分類層次的功能通路，右側(cè)為該通路所屬的第一層次通路)

2.3 核心物種的識(shí)別

MetagenomeSeq分析基于不同樣本組物種(相對(duì)豐度)在統(tǒng)計(jì)上的顯著差異，篩選不同分類水平中具有富集趨勢(shì)的物種；LEfSe分析強(qiáng)調(diào)尋找分組之間穩(wěn)健的差異物種，不局限于對(duì)不同樣本分組中的群落組成差異進(jìn)行分析，還可以深入到不同的子分組中，挑取在不同子分組中表現(xiàn)一致的微生物類群；隨機(jī)森林分析能夠深入挖掘微生物之間復(fù)雜的非線性相互依賴關(guān)系，篩選對(duì)樣本分析具重要性的微生物。本研究根據(jù)這3種分析方法，共篩選出51種核心物種(屬)，主要屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Acfinobacteria)。其中7種為共同篩選物種，分別為：氣單胞菌屬()、黃桿菌屬()、蓋勒氏菌屬()、微枝形桿菌屬()、地桿菌屬()、亨氏菌()、。土著菌群中核心物種以黃桿菌屬(，22.3%)、氣單胞菌屬(，7.1%)、溶桿菌屬(，1.5%)為優(yōu)勢(shì)屬；蚯蚓腸道菌群中核心物種以貪銅菌屬(，8.0%)、微枝形桿菌屬(，3.9%)、普氏菌屬(，12.3%)、蓋勒氏菌屬(，2.3%)為優(yōu)勢(shì)屬(圖4)。此類土著菌群和蚯蚓腸道菌群核心微生物同樣存在于有機(jī)氯農(nóng)藥污染土壤環(huán)境中，雖然其相對(duì)豐度有所變化，但均具有發(fā)揮農(nóng)藥降解和有機(jī)質(zhì)代謝潛能，是土壤微生物群落重要的成員[12-15]。不同濃度梯度滅蟻靈處理組中，土著菌群和蚯蚓腸道菌群的核心物種變化趨勢(shì)略有差異(圖5)。整體上，土著菌群核心種群隨農(nóng)藥濃度的升高其相對(duì)豐度呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，蚯蚓腸道菌群核心種群隨滅蟻靈濃度升高其相對(duì)豐度逐漸升高。

(橫坐標(biāo)為功能通路的豐度(平均相對(duì)豐度)；縱坐標(biāo)左側(cè)為KEGG第二分類層次的功能通路，右側(cè)為該通路所屬的第一層次通路)

2.4 核心物種的網(wǎng)絡(luò)特性及功能

統(tǒng)計(jì)T0-T1、T0-T2、T0-T3處理組蚯蚓腸道菌群和土著菌群共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖中核心物種的度中心性(degree centrality)、緊密中心性(closeness centrality)、特征向量中心性(eigenvector centrality)，發(fā)現(xiàn)核心物種的平均度中心性、緊密中心性和特征向量中心性系數(shù)為136.72、0.44、0.52，均高于非核心種群的91.52、0.42、0.33(表3)。

2.5 土著菌群和蚯蚓腸道菌群的交互作用

對(duì)土著菌群和蚯蚓腸道菌群進(jìn)行可重復(fù)雙因素方差分析(表4)，單獨(dú)考慮蚯蚓腸道菌群的作用，其>0.05，對(duì)不同處理組中微生物群落的多樣性高低影響較??；單獨(dú)考慮土著菌群的作用，其<0.05，對(duì)不同處理組中微生物群落的多樣性高低影響較大；土著菌群和蚯蚓腸道菌群之間的交互作用對(duì)不同處理組中微生物群落的多樣性高低影響顯著(<0.05，交互作用下的值遠(yuǎn)大于crit)。

(圖A為基于MetagenomeSeq分析的差異OTU的曼哈頓圖。其中，上圖，土著菌群樣本組上調(diào)；下圖，蚯蚓腸道菌群樣本組上調(diào)。以上兩圖分別采用OTU在分組A或B出現(xiàn)頻次大于等于0.5作為條件，對(duì)MetagenomeSeq分析結(jié)果進(jìn)行過濾?？v坐標(biāo)為–log10(adj-P value)值，差異越顯著，Y軸位置越高。坐標(biāo)系內(nèi)每個(gè)圓點(diǎn)或圈代表1個(gè)OTU，大小代表其相對(duì)豐度，以log2(CPM/n)為單位(CPM: 每百萬拷貝數(shù)；n：樣本數(shù)量)。虛線分隔了顯著差異與不顯著的OTU，顯著差異的點(diǎn)用彩色圓點(diǎn)或圓環(huán)標(biāo)志，不顯著的用灰色圓環(huán)表示，該分組內(nèi)顯著上調(diào)的用彩色實(shí)心圓點(diǎn)顯示。圖中，圓點(diǎn)的顏色標(biāo)識(shí)其門水平名稱并標(biāo)注于圖底部(顯著上調(diào)的點(diǎn)數(shù)前10位的門)；對(duì)顯著上調(diào)的點(diǎn)數(shù)排在前15位的目，添加灰度背景，且該目的名稱標(biāo)注于圖頂部。圖B為基于LEfSe分析的線性判別分析效應(yīng)值核心物種柱狀圖。橫坐標(biāo)為組間具有顯著差異的分類單元(屬)，縱坐標(biāo)則以條形圖直觀地展示各分類單元的線性判別分析對(duì)數(shù)得分值。分類單元按照得分值大小進(jìn)行排序，以此描述它們?cè)跇颖痉纸M中的特異性。長(zhǎng)度越長(zhǎng)表明該分類單元的差異越顯著，條形圖的顏色指示了該分類單元所對(duì)應(yīng)的豐度最高的樣本分組。圖C為隨機(jī)森林分析篩選核心物種熱圖。篩選隨機(jī)森林分析中重要性大于0.01的物種(屬))

3 討論

3.1 土著菌群和蚯蚓腸道菌群之間存在物種和功能的傳遞

滅蟻靈處理前后，土壤的理化性質(zhì)、農(nóng)藥濃度和蚯蚓腸道的農(nóng)藥富集系數(shù)變化并不顯著，可能與滅蟻靈難降解特性、半衰期長(zhǎng)以及培養(yǎng)周期較短有關(guān)[16-17]。但不同處理組中土著菌群和蚯蚓腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成有明顯差異(圖1)，主要與土壤和蚯蚓腸道環(huán)境差異相關(guān)[18]。土著菌群和蚯蚓腸道菌群在T0組中共享物種種類(屬水平)占總物種類別的23.6%，在滅蟻靈處理組中(T1、T2、T3)上升為73.1%。其中土著菌群增加60.2% 的新物種，主要為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Acfinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)；蚯蚓腸道菌群增加61.5% 的新物種，主要為變形菌門、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)(圖6)。這些微生物通過蚯蚓的進(jìn)食活動(dòng)進(jìn)入蚯蚓腸道，又以蚓糞的形式進(jìn)入土壤中，加強(qiáng)土著菌群和蚯蚓腸道菌群物種層面的溝通交流，攜帶有不同功能基因的微生物在土壤和蚯蚓腸道中傳播，從而實(shí)現(xiàn)兩種微生物群落之間功能的傳遞，尤其是較低濃度(T1、T2組)滅蟻靈脅迫土壤環(huán)境中這種功能傳遞作用更加活躍。土著菌群和蚯蚓腸道菌群在土培過程中(T1、T2和T3處理組)，出芽菌屬()、膨脹芽胞桿菌屬()、氣單胞菌屬()、等相對(duì)豐度升高(圖1)，而這些微生物被證實(shí)與土壤碳氮代謝和農(nóng)藥降解有關(guān)[19-21]。土著菌群和蚯蚓腸道菌群均能夠降解有機(jī)農(nóng)藥、石油烴、多氯聯(lián)苯等污染物，主要通過共代謝作用或產(chǎn)生相關(guān)酶(如漆酶、細(xì)胞色素P450單加氧酶、脫氫酶、脫鹵酶等)增強(qiáng)土壤中污染物的生物降解[15,22]。此外，具有抵御有機(jī)氯農(nóng)藥的功能微生物在蚯蚓腸道定殖參與污染物的降解，并通過蚓糞的形式進(jìn)入土壤環(huán)境中，刺激土著菌群中有益微生物的繁殖[18, 20]，驅(qū)動(dòng)土著菌群和蚯蚓腸道菌群功能演變(圖2、圖3)，進(jìn)而加速消減土壤污染物。土著菌群和蚯蚓腸道菌群在代謝有機(jī)氯農(nóng)藥、改善土壤環(huán)境質(zhì)量的過程中形成良性循環(huán)體系，提高了土壤生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)職能，加快土壤生態(tài)功能多樣性和穩(wěn)定性的自恢復(fù)。

(篩選的核心微生物(門)在不同處理組中的相對(duì)豐度分布，內(nèi)徑為不同微生物的相對(duì)豐度(擴(kuò)大1 000倍)，外徑為不同微生物在對(duì)應(yīng)處理組中的比例；不同微生物的名稱和處理組代碼標(biāo)記于最外圈)

表3 土著菌群和蚯蚓腸道菌群互作網(wǎng)絡(luò)的中心性

表4 可重復(fù)雙因素方差分析

注: SS，離均差平方和；df，自由度；MS，均方；，統(tǒng)計(jì)量(處理均方/誤差均方)；crit，的臨界值。

(圖A：不同處理組土著菌群物種類別及新增物種分布；圖B：不同處理組蚯蚓腸道菌群物種類別及新增物種分布。韋恩圖表示土著菌群或蚯蚓腸道菌群在不同處理組中共有和特有物種的數(shù)目，S_T0、S_T1、S_T2、S_T3和E_T0、E_T1、E_T2、E_T3依次為T0、T1、T2、T3處理組中的土著菌群和蚯蚓腸道菌群樣本組；柱狀圖表示T1、T2、T3實(shí)驗(yàn)組中新增物種的平均相對(duì)豐度，橫坐標(biāo)為物種名稱(門分類水平)，縱坐標(biāo)為相對(duì)豐度值)

3.2 核心種群是土著菌群和蚯蚓腸道菌群應(yīng)對(duì)農(nóng)藥脅迫的關(guān)鍵分類單元

土壤環(huán)境中不同微生物群落的演變趨勢(shì)與土壤環(huán)境質(zhì)量息息相關(guān)。研究人員常通過對(duì)土著菌群或蚯蚓腸道菌群的多樣性、生物量、呼吸速率、特征微生物的豐度變化等指標(biāo)進(jìn)行分析，來評(píng)估土壤環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[23]。然而，土壤微生物群落及其驅(qū)動(dòng)的過程很大程度取決于微生物之間的相互作用[24]。本研究中，不同濃度滅蟻靈脅迫(T0-T1、T0-T2、T0-T3)下，蚯蚓腸道菌群和土著菌群互作網(wǎng)絡(luò)中存在穩(wěn)定的高度連接節(jié)點(diǎn)(屬水平物種)，具有較高的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣?度中心性、緊密中心性、特征向量中心性)，而且這些類群的結(jié)構(gòu)和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩圆浑S農(nóng)藥濃度升高而發(fā)生明顯變化。較高的拓?fù)涮卣?，表示微生物之間緊密的互作關(guān)系，豐富的降解路徑和較強(qiáng)的生態(tài)位過濾特性(niche filtering)[25]。因此，蚯蚓腸道菌群和土著菌群互作網(wǎng)絡(luò)中存在穩(wěn)定的高度連接物種，可能具有較寬的生態(tài)位，還被證實(shí)與土壤中養(yǎng)分循環(huán)和農(nóng)藥代謝過程有關(guān)[19-21, 26]。如核心微生物黃桿菌屬具有抵御有機(jī)氯農(nóng)藥，降解土壤中低濃度五氯苯酚(濃度為30和50 mg/L)，參與有機(jī)質(zhì)代謝的能力，還具有固氮功能[19]；不動(dòng)桿菌可使用殺蟲劑作為唯一碳源進(jìn)行共代謝[21]；氣單胞菌能夠降解土壤中的有機(jī)氯農(nóng)藥[18]。此外，微生物互作網(wǎng)絡(luò)具有無標(biāo)度(scale-free)性質(zhì)[27]，表明蚯蚓腸道菌群和土著菌群中高度連接物種與其連接的大量物種共存形成小型微生物網(wǎng)絡(luò)，通過影響高度連接物種將信息傳遞給微生物群落中其他成員，進(jìn)而影響微生物群落的裝配過程[24]。

本研究通過3種方法篩選出的核心物種(圖4)，在不同濃度滅蟻靈脅迫下微生物群落互作網(wǎng)絡(luò)中具有較高的網(wǎng)絡(luò)特性(表3)，表明MetagenomeSeq分析、LEfSe分析和隨機(jī)森林分析可作為識(shí)別微生物群落核心物種的方法。本研究中蚯蚓腸道菌群和土著菌群中核心物種在農(nóng)藥刺激作用下(T1、T2、T3)，其相對(duì)豐度均有所上升，尤其是T3組，核心物種平均相對(duì)豐度相較之T0組顯著升高，提高了9.8%(< 0.05)(圖5)。不同微生物群落互作網(wǎng)絡(luò)的核心物種通常具有能夠適應(yīng)該生境的生物功能，這種功能通常是在與群落中物種相互作用過程中發(fā)生[28]。因此，不同濃度滅蟻靈脅迫下，蚯蚓腸道菌群和土著菌群能夠抵御滅蟻靈的毒害，正是由于這些穩(wěn)定存在的核心物種，作為農(nóng)藥脅迫下蚯蚓腸道菌群和土著菌群之間傳遞信息的橋梁，聯(lián)系微生物群落中大量其他物種，在微生物群落間運(yùn)輸碳氮代謝和有機(jī)氯農(nóng)藥代謝功能(可能是酶和代謝產(chǎn)物)[29]來抵御農(nóng)藥脅迫。根據(jù)雙因素方差分析(表4)，蚯蚓腸道菌群對(duì)不同處理組中微生物群落多樣性影響較小，而土著菌群和蚯蚓腸道菌群之間的交互作用對(duì)不同處理組中微生物群落多樣性影響顯著，表明蚯蚓腸道菌群和土著菌群之間存在協(xié)同效應(yīng)，可影響微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的演變，進(jìn)而發(fā)揮抵御農(nóng)藥毒害功能，協(xié)助維護(hù)土壤環(huán)境微生物群落內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

土著菌群和蚯蚓腸道菌群在土壤生物化學(xué)過程中存在物種的傳遞以及功能的轉(zhuǎn)換，這種緊密的群落互作關(guān)系增強(qiáng)微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，提高微生物群落抵御逆環(huán)境的能力。其中核心種群，尤其是具有抵御農(nóng)藥脅迫(滅蟻靈)功能的核心種群，是連接土著菌群和蚯蚓腸道菌群的關(guān)鍵樞紐。因此，探明蚯蚓腸道菌群和土著菌群的菌群特性、協(xié)同演變趨勢(shì)和互作模式對(duì)于維護(hù)土壤環(huán)境系統(tǒng)安全具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究基于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和網(wǎng)絡(luò)分析識(shí)別蚯蚓腸道菌群和土著菌群的核心種群，主要為氣單胞菌屬()、黃桿菌屬()、蓋勒氏菌屬()、微枝形桿菌屬()、地桿菌屬()、亨氏菌()、，發(fā)現(xiàn)這些微生物不僅具有農(nóng)藥降解和碳氮代謝功能，也是維系蚯蚓腸道菌群和土著菌群緊密互作、協(xié)同抵御滅蟻靈脅迫的關(guān)鍵因素。本研究可以為深入闡釋土著菌群和蚯蚓腸道菌群協(xié)同抵御農(nóng)藥污染脅迫過程和機(jī)制提供新的科學(xué)認(rèn)知。

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Keystone Species of Soil Indigenous Flora and Earthworm Intestinal Flora Help to Resist Mirex Stress

ZHU Guofan1, YING Rongrong2, DENG Shaopo2, KONG Lingya2, QIAN Jiazhong1*, SUN Mingming3, ZHU Yu4, YE Mao5*

(1School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2 Nanjing Institute of Environmental Science, Ministry of Ecology and Environment, Nanjing 210042, China; 3College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 4School of Politics & Public Administration, Hainan University, Haikou 570208, China; 5 Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China)

In this study, soils with different mirex concentrations (0–27mg/kg) were collected to set up earthworm inoculation trials. High-throughput sequencing was used to analyze the structure and function of earthworm intestinal and soil indigenous microbial communities. Meanwhile, the keystone microbial taxa were identified through network analysis. The results obtained here found that 1) The structure and composition of the earthworm intestinal bacteria varied more significantly than those of the soil indigenous bacteria (<0.05); 2) The keystone bacteria remained stable in the worm gut and the soil despite varying mirex concentration, which was mainly consisted of,,,,,,; 3) The keystone bacteria had higher network connectivity than the rest bacteria, whose mean degree centrality, closeness centrality, eigenvector centrality values were 136.7, 0.44 and 0.52, respectively, clearly higher than those in the rest bacteria (91.52, 0.42 and 0.33, respectively). In addition, the keystone bacteria were closely involved in the carbon/nitrogen transformation and pesticide degradation, which not only protect the keystone bacteria from mirex toxicity, but might also assist other bacteria in relieving pesticide toxicity.

Mirex;Soil indigenous flora; Earthworm intestinal flora; Keystone taxa

X53

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.06.020

朱國(guó)繁, 應(yīng)蓉蓉, 鄧紹坡, 等. 土著菌群與蚯蚓腸道菌群共享核心物種協(xié)同抵御滅蟻靈脅迫研究. 土壤, 2021, 53(6): 1250–1260.

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018FYC1803100)、國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(42077106)和中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)項(xiàng)目(2018350)資助。

通訊作者(qianjiazhong@hfut.edu.cn; yemao@issas.ac.cn)

朱國(guó)繁(1995—)，女，安徽安慶人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)檗r(nóng)藥污染土壤微生物修復(fù)。E-mail: zhuguofan@issas.ac.cn