趙晨曦,王 楊,錢秋慧,閆 瑾,肖 傲,王學(xué)東,王慧利

三氯卡班環(huán)境暴露對(duì)斑馬魚神經(jīng)行為的影響

趙晨曦,王 楊,錢秋慧,閆 瑾,肖 傲,王學(xué)東,王慧利*

(蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 蘇州 215009)

為了探究三氯卡班(TCC)對(duì)脊椎生物神經(jīng)行為的干擾及機(jī)制,以脊椎模式生物斑馬魚為研究對(duì)象,分別評(píng)判了TCC亞致死劑量急性暴露對(duì)幼魚的神經(jīng)發(fā)育毒性及慢性暴露對(duì)成魚神經(jīng)行為的影響.結(jié)果表明:TCC亞致死劑量急性暴露造成斑馬魚胚胎及幼魚自主運(yùn)動(dòng)活力減少,對(duì)聲光刺激的敏感程度下降.吖啶橙凋亡染色表明,TCC誘導(dǎo)幼魚頭腎、腦部和眼睛等多部位發(fā)生細(xì)胞過度凋亡.通過掃描電鏡觀察,側(cè)線神經(jīng)丘形態(tài)畸形,發(fā)育受到抑制,毛細(xì)胞團(tuán)數(shù)量減少且排列紊亂.成魚行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示,TCC長(zhǎng)期暴露的成魚過度焦慮及恐慌,避險(xiǎn)和警惕能力下降,并表現(xiàn)出自閉,不愿社交,顯著影響斑馬魚的記憶力、學(xué)習(xí)能力和辨別認(rèn)知功能.

三氯卡班；斑馬魚；環(huán)境污染；行為學(xué)；神經(jīng)行為

三氯卡班(Triclocarban, TCC)化學(xué)名稱為3,4,4-三氯均二苯脲(C13H9Cl3N2O),是一種高效、廣譜的抗菌劑[1],其活性高、脂溶性強(qiáng),對(duì)光和熱穩(wěn)定,一旦附著于皮膚,不易沖洗,可以持續(xù)發(fā)揮殺菌效果[2].TCC在歐美國(guó)家使用歷史已長(zhǎng)達(dá)45a,目前美國(guó)TCC年產(chǎn)量約為4.54×105t,估計(jì)世界范圍TCC的年使用量大概在7.5×105t[3].TCC被大量而頻繁的使用,并隨污水排放匯入環(huán)境中,無疑給環(huán)境和人類健康造成威脅.TCC作為一種藥物和個(gè)人護(hù)理品(PPCPs),已被列入最常見的十大水污染物之一[4-5],世界各國(guó)都在限用.

TCC由于其有較強(qiáng)的親脂性,容易通過生物膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[12-13],對(duì)靶標(biāo)和非靶標(biāo)生物均具有潛在生物毒性[14].研究發(fā)現(xiàn),TCC通過影響細(xì)胞周期進(jìn)程等破壞小鼠卵母細(xì)胞的成熟,產(chǎn)生生殖毒性[15];長(zhǎng)時(shí)間接觸大量的TCC可能引起動(dòng)物肝腎功能的損傷[16],改變氧化應(yīng)激水平[17],誘發(fā)免疫毒性;TCC也可以破壞雌激素受體的信號(hào)傳導(dǎo)[18],增加細(xì)胞中控制睪酮的基因表達(dá)[19],產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾作用;此外,TCC會(huì)造成DNA的斷裂損傷,產(chǎn)生遺傳毒性[20-21].但是,三氯卡班對(duì)脊椎生物神經(jīng)行為的干擾及其機(jī)制還不清楚.Xu等[17]用梯度濃度的TCC急性暴露斑馬魚(6～120hpf)可造成幼魚體節(jié)變短?間腦和眼睛變小,皮下靜脈和節(jié)間動(dòng)脈發(fā)育畸形(血管和神經(jīng)相伴而生),凋亡細(xì)胞數(shù)隨TCC濃度梯度依賴關(guān)系增多.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),促凋亡基因上調(diào),抑凋亡基因下調(diào).基于TCC誘導(dǎo)的上述表型畸形特征和凋亡發(fā)生,推測(cè)TCC對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)元發(fā)育和凋亡具有一定影響.因此,為進(jìn)一步評(píng)價(jià)和確證TCC環(huán)境暴露誘發(fā)神經(jīng)功能性疾病的健康風(fēng)險(xiǎn)及致毒機(jī)制,本文以脊椎模式生物斑馬魚為對(duì)象,分別研究了TCC亞致死劑量急性暴露下幼魚的神經(jīng)發(fā)育毒性,以及長(zhǎng)期慢性暴露對(duì)成魚神經(jīng)行為的影響.初步探索了對(duì)斑馬魚幼魚神經(jīng)致毒效應(yīng)的機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)用野生型AB品系斑馬魚購(gòu)買于中科院武漢水生資源中心,根據(jù)斑馬魚養(yǎng)殖指南,雌雄成魚分開飼養(yǎng)在斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中,水溫為(28.5±0.5) ℃;pH值為6.8～7.5;光周期為14h光照:10h黑暗,每天早晚喂食2次新鮮孵化的豐年蝦.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

試劑:TCC、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、吖啶橙(AO)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);戊二醛(上海麥克林生物化學(xué)有限公司);乙醇(江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司);丙酮(無錫市展望化工試劑有限公司).

儀器:離心機(jī)(Gentrifuge5424R,德國(guó)Eppenderf);體視顯微鏡(Cover-015,日本OLYMPUS);制冰機(jī)(IMS-20,寧波特朗普儀器有限公司);斑馬魚行為分析系統(tǒng)(Danio Vision,荷蘭Noldus);斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);冷凍干燥機(jī)(北京博康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 斑馬魚胚胎收集與暴毒處理 實(shí)驗(yàn)前1d晚上將斑馬魚按雌雄比1:1放入產(chǎn)卵器中,第2d早上開燈刺激產(chǎn)卵,0.5h后收集胚胎.挑選優(yōu)質(zhì)胚胎從6hpf開始TCC暴毒實(shí)驗(yàn), 將胚胎移動(dòng)至梯度濃度TCC胚胎培養(yǎng)液中(0,25,125,225μg/L),每24h換液一次,以保持暴毒濃度.慢性暴露(0,225μg/L)從45dpf開始持續(xù)暴露至4個(gè)月性成熟期,每周換水一次,以保持暴露濃度.每處理設(shè)置3次生物重復(fù),以備后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.3.2 TCC急性暴露斑馬魚胚胎及幼魚行為學(xué)分析 (i)胚胎自主抽動(dòng)(24hpf)與幼魚自主運(yùn)動(dòng)(120hpf)活力測(cè)試:將暴毒至24hpf的測(cè)試胚胎放入96孔無菌培養(yǎng)板中.顯微鏡下記錄5min內(nèi)胚胎尾部卷曲次數(shù),統(tǒng)計(jì)每組胚胎的自主抽動(dòng)頻率(每處理20枚胚胎).將TCC暴露至120hpf的幼魚,移至96孔無菌培養(yǎng)板并在Noldus(荷蘭)行為分析儀中進(jìn)行測(cè)試.設(shè)置5min黑暗環(huán)境適應(yīng)期(數(shù)據(jù)不計(jì)入實(shí)驗(yàn)結(jié)果,下同).使用EthoVision XT軟件進(jìn)行5min的運(yùn)動(dòng)軌跡視頻采集(每處理樣本量為36尾幼魚),統(tǒng)計(jì)5min內(nèi)幼魚的移動(dòng)距離及速率作為自主運(yùn)動(dòng)活力的評(píng)價(jià)指標(biāo).

(ii)幼魚聲刺激敏感度測(cè)試(120hpf):將TCC濃度梯度暴露6～120hpf幼魚轉(zhuǎn)入96孔無菌培養(yǎng)板并移入行為分析觀察箱,設(shè)置聲音刺激級(jí)別為8級(jí),設(shè)置3min環(huán)境適應(yīng)期后,用EthoVision XT 軟件進(jìn)行運(yùn)動(dòng)視頻采集并計(jì)算5min內(nèi)平均速率用于評(píng)價(jià)聲刺激反應(yīng)、敏感度和應(yīng)激能力.

(iii)幼魚光暗節(jié)律測(cè)試(120hpf):設(shè)置5min黑暗環(huán)境適應(yīng)期.設(shè)置光暗周期為光照:黑暗=10min:10min,并循環(huán)2次,光照黑暗均為100%.運(yùn)用EthoVision XT軟件進(jìn)行運(yùn)動(dòng)視頻采集并計(jì)算運(yùn)動(dòng)速率,檢測(cè)光暗刺激下幼魚的運(yùn)動(dòng)規(guī)律.

按國(guó)家GB5497-85標(biāo)準(zhǔn)，將稱重后的物料樣品放置于托盤中，置于在烘箱中恒溫(105℃)加熱，直到物料樣品達(dá)到恒定質(zhì)量。含水率計(jì)算公式為[3]

1.3.3 幼魚體細(xì)胞吖啶橙(AO)凋亡染色 吖啶橙是能透過完整的細(xì)胞膜,嵌入細(xì)胞核雙鏈DNA并發(fā)出熒光的DNA染料,凋亡的細(xì)胞核呈圓狀或固縮狀、團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)凋亡小體,且熒光染色增強(qiáng).具體的染色方法參照文獻(xiàn)[22],每處理樣本量為36尾幼魚,染色前暴毒液里加入適量的N-苯基硫脲(PTU)黑色素抑制劑,便于觀察凋亡小體.

1.3.4 掃描電鏡觀察神經(jīng)丘和毛細(xì)胞發(fā)育 采用2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛固定—漂洗—梯度乙醇脫水—冷凍干燥等程序進(jìn)行樣品前處理,然后在掃描電鏡下進(jìn)行觀察、拍照處理.

1.3.5 長(zhǎng)期慢性暴露的斑馬魚成魚行為學(xué)分析 (i)棲底試驗(yàn)(BDT):將受試成年斑馬魚單獨(dú)放置在裝水至最高水位的梯形魚缸中(15cm×28cm×23cm× 7cm=高×上底長(zhǎng)×下底長(zhǎng)×寬),用MyTv軟件對(duì)斑馬魚活動(dòng)軌跡進(jìn)行10min的錄像,并用EthoVision XT軟件分析斑馬魚在魚缸中的運(yùn)動(dòng)軌跡,評(píng)估各處理成魚的棲底差異.(ii)條件性位置偏好試驗(yàn)(CPP):測(cè)試缸尺寸為28cm長(zhǎng)×19cm寬×16cm深.利用差別化視覺顏色控制將試驗(yàn)缸底部分成兩半:一半為棕黃色,另一半為白色(白色中間設(shè)置2個(gè)黑點(diǎn)示為危險(xiǎn)).為減輕水壓并減少斑馬魚的上下游動(dòng),將水深保持在2.5cm深.用MyTv軟件進(jìn)行10min的錄像,并用EthoVision XT軟件對(duì)其在魚缸中的位置進(jìn)行分析,記錄其在非偏好側(cè)的行為來評(píng)估斑馬魚的習(xí)性改變、辨別和逃避風(fēng)險(xiǎn)能力.(iii)社交試驗(yàn)(SI):社交試驗(yàn)SI槽(長(zhǎng)42.5cm×寬21.5cm×高25.6cm)分為2個(gè)區(qū),社交區(qū)和非社交區(qū),社交區(qū)與另外一個(gè)放有群魚的透明魚缸互視,而非社交區(qū)看不到透明缸內(nèi)的斑馬魚.測(cè)試缸中斑馬魚可以自由地從一個(gè)區(qū)域游到另一個(gè)區(qū)域.用MyTv軟件進(jìn)行10min的錄像,并用EthoVision XT軟件對(duì)其在社交區(qū)和非社交區(qū)的運(yùn)動(dòng)時(shí)間進(jìn)行分析,從而評(píng)判斑馬魚的社交意愿和能力.(iv)T迷宮試驗(yàn)(T-maze):T迷宮試驗(yàn)常用于斑馬魚學(xué)習(xí)、記憶、辨別或認(rèn)知功能的行為研究[23].在T型缸兩側(cè)分別設(shè)置誘餌區(qū)和刺激區(qū).試驗(yàn)前,對(duì)斑馬魚進(jìn)行7d的訓(xùn)練(每次10min,每天2次).經(jīng)訓(xùn)練后,斑馬魚放在起跑線區(qū)域,迅速取出起跑線區(qū)擋板,用MyTv軟件采集5min錄像,并用EthoVision XT軟件對(duì)其在T型缸中左右臂的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行分析.

1.3.6 數(shù)據(jù)分析方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,不同實(shí)驗(yàn)組間的比較在Tukey排序檢驗(yàn)之后進(jìn)行單向方差分析(ANOVA),所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 18.0軟件(芝加哥,美國(guó)),*<0.05,**<0.01,或***< 0.001表示顯著性差異水平.

2 結(jié)果與分析

2.1 TCC對(duì)不同生物的LC50預(yù)測(cè)與對(duì)斑馬魚幼魚的實(shí)驗(yàn)測(cè)定

經(jīng)過Ecosar Applcation軟件分析得出TCC對(duì)不同生物的半致死濃度(表1),參考魚類對(duì)應(yīng)LC50的預(yù)測(cè)值0.358mg/L上下設(shè)置TCC梯度濃度暴露幼魚至96hpf,模擬出TCC對(duì)斑馬魚幼魚(96hpf )LC50值為413.6μg/L, NOEL值(未觀察到作用的水平)為50μg/ L,LOEL值(觀察到作用的最低水平)為100μg/L,2值為0.9370 (圖1).因此,本實(shí)驗(yàn)選取半致死濃度的1/2～1/16作為亞致死TCC處理劑量(0,25,125, 225μg/L).

表1 TCC暴露對(duì)不同生物的LC50預(yù)測(cè)

圖1 TCC梯度濃度暴露對(duì)斑馬魚(96hpf)LC50測(cè)定

2.2 TCC亞致死劑量急性暴露抑制胚胎自主抽動(dòng)和幼魚自主運(yùn)動(dòng)活力

TCC顯著抑制胚胎自主抽動(dòng),與對(duì)照組胚胎7.25次/min相比,25,125和225μg/L TCC處理組24hpf胚胎運(yùn)動(dòng)頻率分別降低了24%(<0.01)、52%和66%(<0.001),表明TCC影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的正常發(fā)育和神經(jīng)傳導(dǎo)功能(圖2A).TCC暴露下幼魚自主運(yùn)動(dòng)軌跡稀疏雜亂(圖2B),且游泳的速率和距離隨著TCC濃度升高呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)(<0.001)(圖2C、D).在225μg/L濃度下幼魚基本喪失了運(yùn)動(dòng)的能力或意愿,這說明過高濃度的TCC暴露可能會(huì)導(dǎo)致幼魚的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)破壞或者運(yùn)動(dòng)器官的功能性喪失.

2.3 TCC亞致死劑量急性暴露影響幼魚對(duì)聲、光刺激感應(yīng)能力和光暗節(jié)律失調(diào)

由圖3A可知,對(duì)照組在聲音刺激下(4min)游泳速率迅速升高,TCC暴露120hpf時(shí)斑馬魚幼魚出現(xiàn)驚恐反應(yīng).隨著TCC暴露濃度的升高,幼魚的運(yùn)動(dòng)活力逐步降低,對(duì)聲音刺激的敏感度顯著下降,尤其是在225μg/L處理組基本沒有反應(yīng).此現(xiàn)象說明TCC暴毒影響了幼魚對(duì)聲音刺激的應(yīng)激反應(yīng),預(yù)示斑馬魚的聽覺神經(jīng)系統(tǒng)或感應(yīng)能力出現(xiàn)功能障礙.

圖2 TCC對(duì)胚胎自主抽動(dòng)和幼魚運(yùn)動(dòng)活力的抑制作用

*<0.05,**<0.01,***<0.001表示顯著性差異水平,下同;橫線上*,**,***表示橫線兩端點(diǎn)所在組的組間顯著性差異水平;圖B每列為3個(gè)平行樣品

圖3 TCC暴露對(duì)幼魚聲?光感應(yīng)的影響

如圖3B所示,對(duì)照組斑馬魚在光暗交替下表現(xiàn)出正常的運(yùn)動(dòng)節(jié)律和周期性變化,即在光亮條件下低速運(yùn)動(dòng),在黑暗環(huán)境下高速運(yùn)動(dòng).在25μg/L TCC暴露下,幼魚在黑暗期的整體速度慢于對(duì)照組,但基本符合運(yùn)動(dòng)節(jié)律;然而在125、225μg/L的TCC暴露下,斑馬魚在黑暗條件下的速度基本沒有提升,運(yùn)動(dòng)速率曲線基本沒有任何節(jié)律的谷峰變化,表現(xiàn)為無規(guī)則的雜亂運(yùn)動(dòng),說明當(dāng)TCC濃度大于25μg/L時(shí),斑馬魚的光暗感知能力已經(jīng)被嚴(yán)重破壞.

2.4 TCC急性暴露誘導(dǎo)幼魚體細(xì)胞的過度凋亡發(fā)生

為了探究TCC暴露對(duì)斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)影響的機(jī)制,通過AO凋亡染色研究幼魚發(fā)育過程中細(xì)胞凋亡現(xiàn)象.在對(duì)照組中,觀察到幼魚自身的頭腎部位有輕微的自然凋亡現(xiàn)象;而TCC暴露組頭腎、前腦、眼睛和卵黃囊等多部位發(fā)生細(xì)胞過度凋亡,而且凋亡程度呈TCC濃度梯度依賴關(guān)系增加,低濃度TCC(25μg/L)導(dǎo)致部分細(xì)胞非正常凋亡,高濃度TCC(225μg/L)可引起幼魚部分器官的大面積凋亡(圖4).這一結(jié)果表明斑馬魚的頭腎(即免疫系統(tǒng))對(duì)TCC暴露非常敏感.頭腎發(fā)育受損,免疫系統(tǒng)遭到破壞,其對(duì)外界TCC暴露不堪重負(fù),繼而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的異常.

圖4 TCC暴露對(duì)幼魚體細(xì)胞凋亡的影響

紅色箭頭指示自然凋亡現(xiàn)象

2.5 TCC急性暴露影響側(cè)線神經(jīng)丘和毛細(xì)胞發(fā)育形成

基于上述測(cè)定結(jié)果,進(jìn)一步利用掃描電鏡從超微結(jié)構(gòu)上證實(shí)側(cè)線神經(jīng)丘的形態(tài)發(fā)育變化.對(duì)照組神經(jīng)丘結(jié)構(gòu)正常,神經(jīng)丘周圍毛細(xì)胞豐富,形成中間隆起的凸丘,毛細(xì)胞纖毛長(zhǎng)而成簇生長(zhǎng).隨著TCC暴露濃度的不斷升高,神經(jīng)丘發(fā)育稀疏且畸形,神經(jīng)丘周圍的毛細(xì)胞隨TCC濃度梯度的增加而減少,并伴有毛細(xì)胞纖毛的發(fā)育缺陷和神經(jīng)丘結(jié)構(gòu)畸形(圖5).推測(cè)神經(jīng)丘的發(fā)育缺陷導(dǎo)致幼魚神經(jīng)行為的異常變化及對(duì)聲光刺激的感應(yīng)遲鈍.

圖5 TCC暴露下斑馬魚幼魚側(cè)線神經(jīng)丘電鏡圖像

2.6 TCC長(zhǎng)期慢性暴露對(duì)斑馬魚成魚神經(jīng)行為的影響分析

2.6.1 棲底試驗(yàn)(BDT) 成魚梯形缸的棲底試驗(yàn)評(píng)估了斑馬魚的焦慮和異常運(yùn)動(dòng)行為[24-25].對(duì)照組中斑馬魚對(duì)上層和下層沒有明顯的偏愛,均表現(xiàn)出較高的運(yùn)動(dòng)活力.225μg/L TCC暴露后,斑馬魚運(yùn)動(dòng)速度明顯高于對(duì)照組(<0.001),但總體運(yùn)動(dòng)距離低于對(duì)照組,表現(xiàn)出過度焦慮和局促不安,且在上層的停留時(shí)間,運(yùn)動(dòng)距離及頻率大幅度降低,更加喜歡在下層活動(dòng),或是長(zhǎng)時(shí)間的停留不動(dòng).因此,TCC暴露降低了成年斑馬魚的運(yùn)動(dòng)能力,影響了其運(yùn)動(dòng)行為和精神狀態(tài),表現(xiàn)為其對(duì)安靜和隔離條件的偏愛(圖6,圖7).

2.6.2 條件性位置偏好試驗(yàn)(CPP) 成年斑馬魚偏愛較暗或較軟的顏色區(qū)域,而不喜歡明亮的白色區(qū)域,并且它們具有較強(qiáng)的規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)能力[26].對(duì)照組成年斑馬魚在棕黃色區(qū)域停留時(shí)間較長(zhǎng),白色區(qū)域時(shí)間較短,有效避開黑色區(qū)域(危險(xiǎn)區(qū))進(jìn)行活動(dòng).而TCC暴露下的斑馬魚呈現(xiàn)出異常的位置偏好,其在白色區(qū)域以及黑色區(qū)域移動(dòng)的距離和停留的時(shí)間明顯升高.值得注意的是,TCC暴露下斑馬魚在白色和風(fēng)險(xiǎn)區(qū)的速度和距離都明顯高于對(duì)照組,過快的移動(dòng)速度和不正常的移動(dòng)軌跡和趨勢(shì)表明了斑馬魚所處的驚恐狀態(tài)與焦躁不安(圖6,圖7). CPP試驗(yàn)表明長(zhǎng)期暴露于TCC環(huán)境下,斑馬魚的驚恐反應(yīng),規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)能力,行為偏愛,視覺敏感性和顏色辨別能力均有所下降,為TCC暴露改變斑馬魚的游泳行為習(xí)慣和辨別能力提供了有力的證據(jù).

2.6.3 社交試驗(yàn)(SI) 斑馬魚是一種群居的水生生物,喜歡和同類聚集活動(dòng)[27].社交試驗(yàn)可以評(píng)估TCC暴露引起的孤僻、自閉癥風(fēng)險(xiǎn).對(duì)照組斑馬魚在社交區(qū)的游泳時(shí)間顯著高于非社交區(qū),表明對(duì)照組斑馬魚喜歡社交和群聚環(huán)境;其平均速度和運(yùn)動(dòng)距離與在BDT和CPP測(cè)試中觀察到的結(jié)果相似,表明斑馬魚運(yùn)動(dòng)活躍而有力.TCC暴露后的斑馬魚在社交區(qū)域的頻率和游泳時(shí)間均顯著減少,斑馬魚更偏愛安靜而孤立的生活區(qū)域,不愛社交和群集,嚴(yán)重的甚至無法交際,孤獨(dú)抑郁(圖6,圖8).

2.6.4 T迷宮試驗(yàn) T迷宮試驗(yàn)評(píng)估了斑馬魚的學(xué)習(xí)能力、記憶能力和認(rèn)知辨別功能.對(duì)照組中斑馬魚的平均速度和游泳距離是正常且活躍的,它們迅速游到誘餌側(cè)區(qū)域,并在那里停留.這表明斑馬魚具有很強(qiáng)的記憶能力,可以迅速區(qū)分誘餌臂.而TCC暴露后的斑馬魚平均速度和移動(dòng)距離顯著降低(圖8),停留在誘餌臂中的時(shí)間和魚頻率也顯著減少.值得注意的是,在TCC暴露處理后,斑馬魚游向危險(xiǎn)區(qū)域的可能性大幅增加(圖8).此結(jié)果表明,TCC暴露會(huì)影響斑馬魚的記憶力,判斷力,認(rèn)知功能和生存競(jìng)爭(zhēng)力.

圖6 斑馬魚成魚行為學(xué)運(yùn)動(dòng)軌跡熱圖

亮部表示斑馬魚運(yùn)動(dòng)頻率較高區(qū)域，暗部表示運(yùn)動(dòng)頻率較低區(qū)域

3 討論

斑馬魚行為評(píng)估是一種進(jìn)行神經(jīng)科學(xué)研究的強(qiáng)大、有效和簡(jiǎn)單的工具[28],行為反應(yīng)通常被用作神經(jīng)元內(nèi)毒理學(xué)影響的敏感指標(biāo)[29].盡管尚未報(bào)道TCC暴露對(duì)斑馬魚幼魚的影響,但先前的研究表明, 同類型藥物三氯生(TCS)暴露導(dǎo)致斑馬魚行為異常,運(yùn)動(dòng)活力下降,且斑馬魚腦部神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮,數(shù)量減少甚至凋亡,膠質(zhì)細(xì)胞增生形成膠質(zhì)瘢痕[27].

在本實(shí)驗(yàn)中,利用一系列行為學(xué)試驗(yàn)來評(píng)估TCC暴露下斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)及精神狀態(tài). 自主運(yùn)動(dòng)的減少表明幼魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能因TCC暴露而受到傷害或延遲發(fā)育進(jìn)程.值得注意的是,TCC暴露顯著抑制幼魚游泳活動(dòng)和對(duì)明暗刺激的反應(yīng),提示脊椎動(dòng)物OFF-視網(wǎng)膜和ON-視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞受到TCC暴露的影響.AO凋亡染色顯示TCC暴露下斑馬魚頭部及眼睛發(fā)生過度凋亡也可以證實(shí)這一設(shè)想.因此,斑馬魚作為神經(jīng)發(fā)育的模式生物,表現(xiàn)出早期的神經(jīng)損傷,可以作為人類風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的合適模型.

在TCC長(zhǎng)期慢性暴露中,斑馬魚表現(xiàn)出記憶力衰退和認(rèn)知能力下降等異常,這可能是神經(jīng)細(xì)胞功能異常導(dǎo)致的,可能會(huì)誘發(fā)阿爾茲海默病.它是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知和記憶障礙[30-31].阿爾茨海默癥的行為是反常,孤獨(dú)和沉默的,這與本文社交行為測(cè)試的結(jié)果一致.斑馬魚焦慮樣行為和明暗節(jié)奏的研究表明,晝夜節(jié)律時(shí)鐘的變化與焦慮密切相關(guān)[32].本文結(jié)果與這些研究相符,這些研究表明CPP,BDT和SI與焦慮癥或自閉癥樣疾病有關(guān),但需要?jiǎng)?chuàng)建基于多個(gè)因素和指標(biāo)的評(píng)價(jià)方法確證.

斑馬魚側(cè)線系統(tǒng)是源自皮膚的重要感覺器官,并通過將外部聲音信號(hào)轉(zhuǎn)換為大腦中的神經(jīng)電刺激來感知水流量,壓力和溫度以及聽覺等.因此,它通過提供對(duì)各種刺激的響應(yīng),在訓(xùn)練,掠食、危險(xiǎn)和方向辨別中起重要作用.側(cè)線神經(jīng)丘細(xì)胞中的毛細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上與人內(nèi)耳毛細(xì)胞相似,因此可用于評(píng)估藥物的耳毒性[27].根據(jù)掃描電鏡結(jié)果,TCC暴露下的斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞發(fā)育遲緩,數(shù)量減少并排列紊亂,表明TCC暴露會(huì)導(dǎo)致耳毒性,導(dǎo)致斑馬魚在高濃度TCC暴露下對(duì)聲刺激不敏感.

盡管TCC在環(huán)境介質(zhì)中無處不在,但有關(guān)其毒理學(xué)的數(shù)據(jù)卻很少.這項(xiàng)研究系統(tǒng)地評(píng)估了急性和慢性TCC暴露對(duì)斑馬魚神經(jīng)發(fā)育和運(yùn)動(dòng)行為的毒性作用,并推斷出一些潛在的毒性機(jī)制.本文為TCC暴露的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了基準(zhǔn),并進(jìn)一步建議了有助于預(yù)防和處理污染物誘發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的療法.

4 結(jié)論

4.1 TCC亞致死劑量急性暴露造成斑馬魚胚胎及幼魚自主運(yùn)動(dòng)活力呈濃度梯度依賴減少,對(duì)聲刺激的敏感程度下降,光暗節(jié)律失調(diào),幼魚頭腎和神經(jīng)多器官發(fā)生過度凋亡,影響側(cè)線神經(jīng)丘的發(fā)育和毛細(xì)胞的分化形成.

4.2 TCC慢性暴露下成魚出現(xiàn)類似焦慮行為和過度恐慌,逃避風(fēng)險(xiǎn)能力和警惕行為下降,并表現(xiàn)出自閉,沉默孤僻,不愿社交等行為,且顯著影響了其記憶力、學(xué)習(xí)能力和辨別認(rèn)知功能.

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Effects of environmental exposure to triclocarban on the neurobehavior of zebrafish ().

ZHAO Chen-xi, WANG Yang, QIAN Qiu-hui, YAN Jin, XIAO Ao, WANG Xue-dong, WANG Hui-li*

(The School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China)., 2022,42(1)：456～464

To evaluate adverse effects of triclocarban (TCC) on vertebrate neurobehavior and their mechanisms, we explored the larval neurodevelopmental toxicity under acute exposure and the adult nervous behavior under chronic exposure by employing zebrafish () as the model vertebrate. The results show that the TCC acute exposure at the sublethal dose resulted in a decrease in both the autonomous movement activity and the sensitivity to sound and light stimulation of embryonic and larval zebrafish. As indicated by Acridine orange apoptotic staining that TCC induced excessive cell apoptosis in the larval head, kidney, brain and eyes. A series of malformation symptoms were observed with scanning electron microscopy, such as deformed lateral line nerve muzzle, inhibited development, reduced number of hair cell clusters and disordered arrangement. The group of adult zebrafish under the long-term TCC-exposure were observed to suffer from excessive anxiety and panic, decreased risk aversion and vigilance, as well as autism and reluctance to social activity. Overall, TCC exposure can significantly affect zebrafish memory, learning ability and cognitive function.

triclocarban；zebrafish；environmental pollution；behavior；neurobehavior

X174

A

1000-6923(2022)01-0456-09

趙晨曦(1996-),男,山西大同人,蘇州科技大學(xué)碩士研究生,主要從事風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)與生態(tài)安全方面的研究.發(fā)表論文1篇.

2021-06-18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31770552);江蘇省創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃(2018-2017);江蘇省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃(SJCX20_1118)

* 責(zé)任作者, 教授, whuili@163.com