劉家峰，舒 慶，張 穎

(1.西安市第九醫(yī)院中醫(yī)康復科，陜西 西安 710054；2.西安市第九醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710054； 3.西安市第九醫(yī)院神經(jīng)內科，陜西 西安 710054)

有研究[1]顯示左歸丸能夠產(chǎn)生類雌激素作用，通過雌激素受體α(ERα)和雌激素受體β(ERβ)對腦缺血再灌注損傷起到保護作用。腦缺血再灌注損傷是由于腦組織長時間缺血、缺氧，再灌注后血氧水平恢復，活性氧短時間生成激增，誘導細胞產(chǎn)生一系列的損傷反應，進而誘導神經(jīng)細胞凋亡，產(chǎn)生神經(jīng)功能缺陷[2-4]。左歸丸對大鼠腦缺血的保護作用已經(jīng)有所報道[5]，但是目前尚無其直接針對離體細胞水平的研究。因此，本研究通過制備左歸丸含藥血清、原代培養(yǎng)神經(jīng)元膠質混合細胞以及細胞氧糖剝奪處理[6]，在細胞水平研究左歸丸含藥血清對細胞氧糖剝奪損傷的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：健康SPF級SD雄性大鼠，出生后1～3 d，體重200 g左右，購自西安交通大學動物實驗中心。動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(陜)2020-005。

1.1.2 主要試劑：左歸丸(Z11020735)，購自北京同仁堂股份有限公司；0.3 g/L戊巴比妥鈉(H31020240)，購自上海新亞藥業(yè)有限公司；相關一抗購自美國Abcam公司，二抗購自上海易利生物科技有限公司；ER非特異性拮抗劑ICI182780，購自美國Sigma公司；DMEM/F12培養(yǎng)基，購自賽默飛世爾科技中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清制備：按照成人臨床日用劑量與體重折算系數(shù)比計算出相當于中劑量的左歸丸大鼠用藥量為2.1 g/(kg·d)。左歸丸加雙蒸水(ddH2O)配制成含左歸丸0.2 g/ml的混懸液，每次灌胃時按灌服中藥量1 ml/200 g大鼠體重進行稀釋，每天藥量按固定時間分2次灌胃，每次間隔4 h，連續(xù)給藥3 d。第3天采血前大鼠禁食12 h，采血后分離血清，56 ℃滅活30 min，220 nm濾膜過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大鼠海馬神經(jīng)元膠質細胞混合細胞原代培養(yǎng)：健康新生SD大鼠用75%酒精消毒，迅速斷頭。取腦組織，分離組織并置于無菌培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿中含有預先冷卻的磷酸鹽緩沖液(PBS)用于細胞培養(yǎng)。對于獲得的大腦皮層，小心地去除腦膜和血管膜。將分離的大腦皮層移入含有胰蛋白酶(終濃度0.125%)消化液的小瓶中，在37 ℃下切割并消化10 min。當組織變成半透明時，加入等體積DMEM/F12培養(yǎng)基停止消化。然后用滴管輕輕吹過，并用200目尼龍濾網(wǎng)過濾。將過濾后獲得的細胞懸液以150 g離心8 min，丟棄上清液，將細胞重新懸浮在DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，并將細胞密度調節(jié)至5×105/cm2，然后將其接種到預涂有聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中。將細胞在37 ℃、5% CO2條件下中培養(yǎng)。24 h后更換完整培養(yǎng)基，然后每2～3 d更換1次液體。

1.2.3 細胞分組及氧糖剝奪處理：將原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元膠質混合細胞隨機分為對照組、模型組、含藥血清組和抑制劑組。對照組細胞不做特別處理。模型組細胞給予氧糖剝奪，方案為換用無糖DMEM培養(yǎng)基并將細胞置于缺氧箱中，通入含95%氮氣和5% CO2混合氣體，缺血、缺氧2 h后更換正常培養(yǎng)基。含藥血清組細胞除給予氧糖剝奪外，培養(yǎng)基中加入左歸丸含藥血清1 ml。抑制劑組細胞除給予氧糖剝奪、左歸丸含藥血清外，還另外給予ER非特異性拮抗劑ICI182780進行干預。

1.2.4 CCK-8實驗：將對數(shù)期的貼壁細胞通過胰酶進行消化，使細胞脫落。待大部分細胞脫落后，加入2倍體積的培養(yǎng)基終止消化。瓶中液體全部轉移至離心管，以1000 r/min離心5 min，棄上清，用1 ml含血清培養(yǎng)基重懸，用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結果稀釋細胞，使細胞濃度為1×106/ml。將稀釋好的細胞種于96孔板，每孔加100 μl稀釋好的細胞懸液。接種24 h、待細胞貼壁良好后，吸出培養(yǎng)基，對照組加入不含藥物培養(yǎng)基，其他三組加對應的含藥培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育12 h。再次吸出培養(yǎng)基，各孔加入含CCK-8的培養(yǎng)基，CCK-8占培養(yǎng)基體積約1/10。孵育1 h，待顏色變?yōu)槌壬笥妹笜藘x在450 nm波長下檢測。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗：收集細胞培養(yǎng)液樣本，采用ELISA法檢測氧化應激和炎癥因子谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)表達水平。首先，在實驗前確定酶標板孔數(shù)(包括空白對照孔，每個標準品和樣品重復3個孔)。向孔中加入100 μl預稀釋濃度梯度標準品或待測樣品。同時，在空白對照孔中加入100 μl樣品稀釋劑。加入樣品后蓋上酶標板，置于37 ℃恒溫箱中90 min，反應后除去酶標板中液體，依次加入預先制備的生物素化抗細胞因子抗體工作液，每孔100 μl，在37 ℃下孵育60 min。反應完成后用0.01 mmol/L PBS洗滌混合物3次，每次浸泡1 min。預先制備的ABC工作液(包括HRP-鏈霉親和素)按100 μl/孔依次加入，置于37 ℃恒溫箱中30 min，反應后用0.01 mmol/L PBS洗滌5次，每次浸泡1～2 min。加入TMB顯色液，置于37 °C培養(yǎng)箱中15 min。以每孔100 μl加入TMB終止液，并在450 nm處測定吸光度值。對照孔吸光度值減去各濃度標準樣品和待測樣品的吸光度值后，對標準樣品數(shù)據(jù)進行線性擬合，得到標準曲線，用標準曲線計算各樣品中細胞因子的濃度。

1.2.6 Western blot實驗：對TNF-α、IL-1β、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關x蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路相關蛋白表達水平進行檢測。收集細胞后轉入1.5 ml離心管中，加入1 ml裂解液，置于冰上裂解30 min。裂解后在4 ℃、12000 r/min條件下離心15 min，取上清置于另一個干凈的EP管中，紫外分光光度計測量蛋白濃度。5×蛋白上樣緩沖液與蛋白按照1∶4的比例混勻，95 ℃條件下進行蛋白滅活5 min。聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳：分離膠為10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，按50 μg蛋白總量上樣。首先用80 V低壓條件跑膠至樣品到壓縮膠與分離膠交界處，隨后改用100 V恒壓條件，直到能夠分離各個目的條帶。轉膜條件：用濕轉法，恒流250 mA轉膜90 min。轉膜完成后，將NC膜放于TBST所配制的5%脫脂牛奶中，進行蛋白封閉1 h。封閉之后用1%牛奶配置的一抗于4 ℃條件孵育過夜。次日，NC膜用TBST清洗3次，每次10 min，隨后用1%牛奶配制的二抗室溫孵育1 h。再用TBST洗滌3次，每次10 min。用ECL顯影定影液孵育NC膜1 min，將NC膜條帶放入顯影器進行顯影。

2 結 果

2.1 各組細胞存活率比較 見圖1。與對照組相比，模型組細胞在氧糖剝奪后細胞存活率顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，含藥血清組細胞存活率顯著增加(P<0.05)。ER拮抗劑ICI182780干預后，左歸丸含藥血清的作用被顯著減弱(P<0.05)。抑制劑組與模型組細胞存活率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2 各組細胞GSH-Px、MDA、IL-1β、TNF-α表達水平比較 見表1。與對照組相比，模型組細胞在氧糖剝奪后GSH-Px水平顯著減少，MDA、IL-1β、TNF-α水平出現(xiàn)顯著升高(均P<0.05)。與模型組相比，含藥血清組細胞GSH-Px水平顯著增加，MDA、IL-1β、TNF-α水平出現(xiàn)明顯下降(均P<0.05)。ER拮抗劑ICI182780干預后，左歸丸含藥血清的作用被顯著減弱(P<0.05)。抑制劑組與模型組細胞GSH-Px、MDA、IL-1β、TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

表1 各組細胞GSH-Px、MDA、IL-1β、TNF-α表達水平比較

2.3 各組細胞TNF-α、IL-1β蛋白表達水平比較 見圖2。與對照組相比，模型組細胞在氧糖剝奪后TNF-α、IL-1β蛋白表達水平顯著上升(均P<0.05)。與模型組相比，含藥血清組細胞TNF-α、IL-1β蛋白表達水平則出現(xiàn)顯著下降(均P<0.05)。ER拮抗劑ICI182780干預后，左歸丸含藥血清的作用被顯著減弱(均P<0.05)。抑制劑組與模型組細胞TNF-α、IL-1β蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

2.4 各組細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達水平比較 見圖3。與對照組相比，模型組細胞在氧糖剝奪后Bcl-2蛋白表達水平顯著減少，Bax和Caspase-3蛋白表達水平出現(xiàn)顯著升高(均P<0.05)。與模型組相比，含藥血清組Bcl-2蛋白表達水平顯著上調，Bax和Caspase-3蛋白表達水平出現(xiàn)顯著下調(均P<0.05)。ER拮抗劑ICI182780干預后，左歸丸含藥血清的作用被顯著減弱(P<0.05)。抑制劑組與模型組Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

2.5 各組細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達水平比較 見圖4。與對照組相比，模型組細胞在氧糖剝奪后PI3K/AKT信號通路p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平顯著下降(均P<0.05)。與模型組相比，含藥血清組細胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平顯著上升(均P<0.05)。ER拮抗劑ICI182780干預后，左歸丸含藥血清的作用被顯著減弱(均P<0.05)。抑制劑組與模型組細胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

左圖：為蛋白電泳圖;右圖：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

左圖：蛋白電泳圖；右圖：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

左圖：蛋白電泳圖；右圖：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討 論

缺血性腦損傷是危害人類健康的主要疾病之一，致死、致殘率極高，目前治療手段有限，特別是針對卒中后的神經(jīng)功能恢復一直沒有有效的治療策略或藥物。中藥左歸丸是傳統(tǒng)補腎名方[7]，有研究發(fā)現(xiàn)其能夠產(chǎn)生類雌激素作用，對腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護作用。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)左歸丸可以通過ERs/PI3K/AKT信號通路對大鼠腦缺血再灌注損傷起到保護作用，但是目前尚沒有在細胞水平研究證實左歸丸對缺血損傷的保護作用。

缺血性腦損傷發(fā)生后，由于缺血、缺氧，導致腦細胞特別是神經(jīng)元損傷，誘導細胞凋亡，從而直接影響神經(jīng)功能缺陷[8-9]。因此，減少神經(jīng)細胞損傷是減輕腦缺血再灌注損傷的重要策略。海馬組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，與多種神經(jīng)功能活動相關，也是對缺血、缺氧敏感的區(qū)域，因此本研究選擇原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元膠質細胞混合細胞進行研究[10-12]。為了使中藥藥效與中藥成分的研究能協(xié)調一致，我們首先制備了左歸丸含藥血清。本研究實驗結果顯示，氧糖剝奪導致原代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞存活率顯著降低，左歸丸含藥血清可以顯著地保護氧糖剝奪造成的神經(jīng)細胞凋亡。凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的檢測結果也與CCK-8實驗結果一致，氧糖剝奪后Bcl-2蛋白表達下降，Bax和Caspase-3蛋白表達增加，左歸丸含藥血清干預后Bcl-2蛋白表達增加，Bax和Caspase-3蛋白表達減少。本研究結果首次從細胞水平證實左歸丸對缺血性腦損傷能夠起到保護作用。

研究[13-16]證實，炎癥、氧化應激、細胞凋亡和興奮性毒性等機制參與了腦缺血再灌注損傷過程。我們前期在整體動物上的研究也證實左歸丸的抗腦缺血作用與其對氧化應激、炎癥的調控作用相關。因此，本研究在細胞水平也檢測了細胞中氧化應激標記物GSH-Px、MDA和炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平，以及TNF-α、IL-1β蛋白表達水平。從結果可以看到，氧糖剝奪可致細胞中GSH-Px水平顯著下降，MDA、TNF-α、IL-1β水平上升，TNF-α、IL-1β蛋白表達水平也出現(xiàn)顯著上調，因此左歸丸含藥血清干預可以有效地減弱氧糖剝奪造成的氧化應激和炎性反應。

先前已經(jīng)有多篇研究提示左歸丸具有雌激素樣作用，我們在動物水平的研究中也發(fā)現(xiàn)其對缺血性腦損傷的保護作用由ERs/PI3K/AKT信號通路介導。ERs/PI3K/AKT信號通路在既往研究[17-20]中也被證實參與對缺血性腦損傷的調控。本研究中，模型組細胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平顯著下降，含藥血清組細胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平顯著上升，ER拮抗劑ICI182780干預可以顯著減弱左歸丸含藥血清在氧糖剝奪過程中對PI3K/AKT通路的調節(jié)作用。

綜上所述，左歸丸含藥血清對大鼠海馬神經(jīng)元和膠質細胞氧糖剝奪損傷具有保護作用，其機制與調控氧化應激、炎性反應及PI3K/AKT通路有關。