梁國新，梁茵茹，劉淑賢，陳康振，林 勇，秦江霞*，吳洪福*

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院(順德龍江醫(yī)院)， 廣東 佛山 528318； 2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬廣州花都醫(yī)院，廣東 廣州 510800； 3.廣東醫(yī)科大學(xué) 干細(xì)胞與再生組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 東莞 523808)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)是細(xì)胞移植常用的種子細(xì)胞[1]，但直接移植NSCs至損傷局部難以維持其良好的增殖狀態(tài)，且不利于移植NSCs進(jìn)行增殖分化[2]。Pluronic F-127(PF-127)是一種溫敏性水凝膠，可作為NSCs體外擴(kuò)增和移植的支架材料[3]。富含亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的Nogo 受體相互作用蛋白1[leucine-rich repeat(LRR) and Ig domain-containing Nogo receptor interacting protein 1,LINGO-1]是中樞神經(jīng)損傷后抑制軸突再生和神經(jīng)元分化的重要負(fù)性調(diào)控因子[4]，通過基因敲除工具短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)抑制NSCs LINGO-1基因的表達(dá)。此外，NSCs的增殖和分化還受到多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響，它們促進(jìn)其增殖、分化和存活[7-8]?；诖耍狙芯繑M用PF-127水凝膠負(fù)載編碼LINGO-1 shRNA慢病毒(lenctiviral,LV))及神經(jīng)營養(yǎng)因子混合物(neurotrophic factors,NTFs)(PF-127-LV-NTFs)以構(gòu)建復(fù)合支架，體外三維培養(yǎng)SD大鼠乳鼠大腦皮質(zhì)腦組織來源NSCs，并觀察該復(fù)合支架對NSCs存活、增殖及分化的影響，評估該復(fù)合支架三維培養(yǎng)是否有利于NSCs的增殖和定向分化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：SPF級0～3 d齡SD大鼠乳鼠2只，用于NSCs的提取[南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號：SYXK(粵)2017-0123]。

1.1.2 試劑：PF-127、多聚甲醛、膠質(zhì)纖維酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein，GFAP)(Sigma-Aldrich公司)；DMEM/F-12、N-2添加劑、B27、青霉素鏈霉素、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、Trizol、GAPDH、化學(xué)發(fā)光液和山羊抗大鼠Alexa Fluor 488、山羊抗兔Alexa Fluor 568(Thermo Fisher Scientific公司)；表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(Peprotech公司)；巢蛋白(Nestin)、RIPA裂解液、β-Ⅲ微管蛋白(β-Ⅲ Tubulin)(Millipore公司)；PrimeSriptTMRT Master Mix試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)；LINGO-1、磷酸二酯酶(CNPcase)(Abcam公司)；HRP羊抗鼠/兔(ABclonal公司)；0.3% Triton X-100(Biomol公司)；5%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)(Genview公司)；Hoechst33342 (Cell Signaling Technology公司)；CCK-8試劑盒(Dojindo公司)；LIVE/DEAD細(xì)胞活性檢測試劑盒(Molecular Probes公司)。

1.2 方法

1.2.1 PF-127水凝膠的制備：在超凈工作臺內(nèi)，稱取PF-127粉末溶解于NSCs完全培養(yǎng)基(DMEM/F-12加入2% FBS、1% N-2添加劑，2% B27，20 ng/mL EGF，20 ng/mL bFGF及1% 青霉素鏈霉素混合液)中，配制成濃度為30%的PF-127溶液，4 ℃搖床輕搖(50 r/min)過夜，直至完全溶解后放置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 NSCs的分離及鑒定：從乳鼠大腦皮質(zhì)腦組織提取NSCs，加入NSCs完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，Nestin免疫熒光染色鑒定NSCs。

1.2.3 慢病毒載體(lentiviral vector,LV vector)的構(gòu)建和感染：病毒載體由GeneChem公司構(gòu)建， shRNA序列如下：5′-TAAGCA CAACATCGAAATTG AATTCAAGAGATTCAATTTCGATGTTGTGCTTTTTTT TC-3′；RNAi陰性對照序列設(shè)計(jì)為：5′-CCGGTTCTC CGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTC GGAG-3′。慢病毒載體攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)記，病毒滴度為2×108TU/mL，TU:transducing units。用感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=5，10，20的LV分別感染NSCs 72 h后在熒光倒置相差顯微鏡觀察。

1.2.4 RT-qPCR檢測LINGO-1的mRNA：LV感染NSCs 72 h后，按PrimeSriptTMRT Master Mix和 SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書操作。LINGO-1正向引物序列：5′-CTTTCCCCTTCGACA TCAAGAC-3′,反向引物序列：3′-CAGCAGCACCAGG CAGAA-5′。β-actin正向引物序列：5′-GTGGGGC GCCCCAGGCACCA-3′,反向引物序列3′-CTCCTTA ATGTCACGCACGATTTC-5′。相對表達(dá)量以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行比較。

1.2.5 Western blot檢測LINGO-1的蛋白：LV感染NSCs 72 h后，用RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，配制10% SDS-PGAE凝膠，電泳2 h后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h并用TBST洗3次，分別加一抗LINGO-1及GAPDH，4 ℃冰箱過夜。次日回收一抗，TBST洗3次后加HRP羊抗鼠/兔二抗室溫孵育1 h，接著用化學(xué)發(fā)光液檢測。

1.2.6 神經(jīng)營養(yǎng)因子混合物的配制：在0～4 ℃條件下,將BDNF(50 mg/mL)、NT-3(50 mg/mL)、PDGF(10 mg/mL)、IGF-1(10 mg/mL)、EGF(10 mg/mL)、bFGF(10 mg/mL)和GDNF(10 mg/mL)按5∶5∶1∶1∶1∶1∶1質(zhì)量比混入PF-127溶液[7]。

1.2.7 NSCs的分組及處理：1)對照組：將液態(tài)PF-127水凝膠平鋪于24孔培養(yǎng)板中(200 μL/孔)，放置37 ℃培養(yǎng)箱待水凝膠凝固后，將200 μL細(xì)胞濃度為1.5×108個(gè)/L的NSCs懸液加于成膠化的水凝膠平面上培養(yǎng)，具體步驟參照[7]；2)PF-127組：用4 ℃液態(tài)PF-127水凝膠重懸NSCs，使細(xì)胞濃度為1.5×108個(gè)/L，將液態(tài)PF-127和NSCs混合物加至24孔培養(yǎng)板(200 μL/孔)中，放入培養(yǎng)箱中2～3 min，待凝膠凝固后加入200 μL完全培養(yǎng)基；3)PF-127+LV組：在PF-127組的基礎(chǔ)上加入LV(2×108TU/mL)，后續(xù)操作同PF-127組；4)PF-127+LV+NTF組：在PF-127+LV組的基礎(chǔ)上按方法1.2.6質(zhì)量比加入NTFcocktail,后續(xù)操作同PF-127組。

1.2.8 免疫細(xì)胞熒光染色：用無菌PBS輕洗各組復(fù)合支架NSCs 2次，預(yù)冷的多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗3次，0.3% Triton X-100透化15 min，PBS沖洗3次，5% BSA室溫封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜，涉及的一抗有：Nestin(1∶200)、 LINGO-1(1∶200)、β-Ⅲ Tubulin(1∶200)、GFAP(1∶200)、CNPcase(1∶200)，吸棄一抗，PBS沖洗3次，室溫避光孵育二抗1 h，涉及的二抗有：山羊抗大鼠Alexa Fluor 488(1∶500)，山羊抗兔Alexa Fluor 568(1∶500)；hoechst33342(1∶5 000)，室溫復(fù)染10 min，吸棄二抗，PBS沖洗3次后于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.9 CCK-8法檢測細(xì)胞活力：根據(jù)CCK-8試劑盒說明書檢測PF-127對NSCs的細(xì)胞活力影響，1、4和7 d后取出1塊培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK-8，避光孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值。

1.2.10 活/死細(xì)胞的檢測(LIVE/DEAD)：培養(yǎng)7 d后，根據(jù)LIVE/DEAD細(xì)胞活性檢測試劑盒說明書操作，于熒光顯微鏡下觀察，紅色為死細(xì)胞，綠色為活細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PF-127能均勻混合NSCs且無細(xì)胞毒性

NSCs中Nestin與LINGO-1共表達(dá)(圖1A)。光鏡下發(fā)現(xiàn)PF-127能與NSCs均勻混合(圖1B)。與對照組相比，PF-127組測得的CCK-8細(xì)胞活力值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C)。

2.2 LINGO-1 shRNA能有效敲減LINGO-1的表達(dá)

編碼LINGO-1 shRNA的慢病毒載體感染NSCs的最適MOI=5(圖2A～C)。MOI=5的慢病毒能有效敲減LINGO-1的表達(dá)(圖2D～G)。

2.3 PF-127-LV-NTFs三維復(fù)合支架促進(jìn)NSCs的存活和增殖

PF-127+LV+NTF組的細(xì)胞存活比例相比對照組及PF-127+LV組明顯增高(P<0.01)(圖3A,B)。免疫熒光染色PF-127+LV+NTF組Nestin陽性細(xì)胞率明顯多于對照組(P<0.01)，略多于PF-127+LV組(P<0.05)(圖3C,D)。

A.immunofluorescence staining (scale bar=20 μm); B.images of PF-127 gel (left) and PF-127 mixed with NSCs (right) under light microscopy(scale bar=100 μm); C.cell viability of NSCs co-incubated with PF-127

2.4 PF-127-LV-NTFs三維復(fù)合支架提高NSCs定向分化為神經(jīng)元的比例

與對照組相比，在PF-127+LV組及PF-127+LV+NTF組β-Ⅲ Tubulin陽性細(xì)胞比例增加(P<0.01)，GFAP陽性細(xì)胞比例下降(P<0.01)，PF-127+LV+NTF組中CNPcase陽性細(xì)胞比例增加的(P<0.05)。與PF-127+LV組相比，PF-127+LV+NTF組β-Ⅲ Tubulin陽性細(xì)胞比例增加(P<0.05)，GFAP陽性細(xì)胞比例下降(P<0.05)(圖4)。

3 討論

NSCs移植后分布離散且損傷局部抑制性病理微環(huán)境使其分化為神經(jīng)元困難等問題直接影響其治療療效[8-9]。近年來，組織工程學(xué)方法為細(xì)胞移植治療帶來新的思路，即移植治療中通過生物材料作為支架負(fù)載種子細(xì)胞或基因藥物。PF-127水凝膠具有良好的生物相容性、極低的細(xì)胞毒性以及在不同溫度下可實(shí)現(xiàn)凝膠態(tài)-液態(tài)的轉(zhuǎn)換等優(yōu)點(diǎn)，是被廣泛使用的細(xì)胞支架及藥物緩釋系統(tǒng)載體[10]。在本研究中使用PF-127水凝膠培養(yǎng)NSCs，表現(xiàn)出其良好的生物安全性，提示PF-127水凝膠有助于NSCs存活、增殖，因此選擇PF-127水凝膠作為載體。LINGO-1是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的富含亮氨酸重復(fù)序列及免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的蛋白，因其在中樞神經(jīng)損傷后抑制軸突、神經(jīng)元再生而備受關(guān)注[11-12]，抑制LINGO-1的表達(dá)可以促進(jìn)NSCs的神經(jīng)元定向分化[4]。本研究使用shRNA可以有效抑制LINGO-1的表達(dá)，從而促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)元再生。證據(jù)表明神經(jīng)營養(yǎng)因子可以滋養(yǎng)神經(jīng)元并促進(jìn)神經(jīng)元存活和再生，在損傷局部起到抗炎、促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化的作用[13]。該研究采用的神經(jīng)營養(yǎng)因子復(fù)合物涵蓋堿性bFGF、NT-3及BDNF等多種神經(jīng)生長及營養(yǎng)因子，在PF-127-LV復(fù)合支架的基礎(chǔ)上加入NTFs，結(jié)合LIVE/DEAD及免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)PF-127+LV+NTF組的NSCs存活率更高，NSCs增殖增強(qiáng)。為了檢測各復(fù)合支架對NSCs分化成各種譜系細(xì)胞比例的影響，分別用神經(jīng)元標(biāo)志性抗體β-Ⅲ Tubulin、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性抗體GFAP以及少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記性抗體CNPase進(jìn)行免疫熒光染色， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)PF-127+LV+NTF組定向分化為神經(jīng)元的比例更優(yōu)于其他組，以上結(jié)果提示PF-127水凝膠聯(lián)合編碼LINGO-1 shRNA慢病毒促進(jìn)NSCs增殖分化的功能及神經(jīng)營養(yǎng)因子混合物的營養(yǎng)作用，可以促進(jìn)NSCs存活， 增強(qiáng)營養(yǎng)支持，促進(jìn)NSCs定向分化為神經(jīng)元。

A.representative images of GFP positive NSCs (scale bar=100 μm); B.infection efficiency of LV; C.quantification of the number of total cells; D-G.representative images showed expression of LINGO-1 protein of NSCs and quantification of relative expression level, normalized to β-actin or GAPDH; *P<0.01 compared with control; NC.negative control; LV.LINGO-1 shRNA lentivirus

A.live/dead cell viability assay of NSCs(scale bar=50 μm); B.quantitative analysis of cell viability of cells; C.proliferation of NSCs(scale bar=50 μm); D.quantitative analysis of proliferation; *P<0.05, **P<0.01 compared with control; #P<0.01 compared with PF-127+LV

A.fluorescence staining results of NSCs differentiation(scale bar=50 μm); B.quantitative analysis of staining; *P<0.05, **P<0.01 compared with control; #P<0.05 compared with PF-127+LV; GFAP.glial fibrillary acidic protein; CNPase.cyclin nuclectide 3′phosphohydrolase

綜上所述，本研究構(gòu)建了PF-127-LV-NTFs三維復(fù)合支架，該復(fù)合支架是良好的干細(xì)胞移植載體，有效促進(jìn)體外移植NSCs的存活、增殖和分化。負(fù)載NSCs的PF-127-LV-NTFs復(fù)合支架可為中樞神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生修復(fù)提供新的研究思路。