曹公譯, 李晨曦, 馬 蕾, 杜林娜, 王麗萍， 劉 艷

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130118; 2. 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春130012)

肉靈芝(meat-likeGanodermalucidum, MGL)， 又稱(chēng)太歲[1]， 因其兼具原生生物和真菌的特點(diǎn)， 又不屬于動(dòng)物、 植物和微生物等常見(jiàn)生物類(lèi)群， 目前尚無(wú)統(tǒng)一的生物學(xué)分類(lèi)， 因而被稱(chēng)為“第四生命體”[1-2], 其富含吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone, PQQ)[3-4]， 具有安神助眠的功效， 對(duì)胃腸、 肝腎、 心腦等器質(zhì)性病變， 糖尿病、 高血壓等代謝性系統(tǒng)疾病， 以及腫瘤防治等均有較好的醫(yī)療效果[5-8]； 并有助于平衡機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)[9]、 抑制腫瘤[10]、 抗放射、 提高肝臟、 骨髓、 血液合成DNA、 RNA和蛋白質(zhì)能力[11]. 作為天然的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑， 肉靈芝及其浸提物的保健功效明顯， MGL比靈芝(GL)[12-16]組成更多樣， 功效更全面， 且具有很強(qiáng)的再生能力， 對(duì)其藥用成分進(jìn)行研究與開(kāi)發(fā)更具有價(jià)值. 但對(duì)其藥用價(jià)值和作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的探究和科學(xué)性的評(píng)價(jià).

秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans, 線蟲(chóng))作為典型的模式生物， 具有個(gè)體微小， 周身透明， 生命周期短， 生理現(xiàn)象明確、 易觀察， 遺傳背景清晰、 成本低、 易操作等優(yōu)點(diǎn)[17-18]， 廣泛應(yīng)用于抗氧化、 抗衰老、 藥物篩選、 遺傳進(jìn)化等領(lǐng)域的研究. 近年來(lái)， 以線蟲(chóng)為模型對(duì)天然植物、 動(dòng)物及微生物來(lái)源的提取物及其有效成分的藥效學(xué)和毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究日益廣泛[19-23]； 以線蟲(chóng)經(jīng)典的生理指標(biāo)、 壓力誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)基因模型等為參考的藥效學(xué)評(píng)價(jià)和作用機(jī)制探究也取得了重要進(jìn)展[24-27]. 然而， 以線蟲(chóng)為模型評(píng)價(jià)肉靈芝及其浸提物抗氧化作用功效及其機(jī)制的研究目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道.

本文以線蟲(chóng)正常和壓力誘導(dǎo)條件下生理病理指標(biāo)為參考， 結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析， 探究人工培育肉靈芝浸提物對(duì)壓力誘導(dǎo)條件下線蟲(chóng)氧化損傷的保護(hù)作用及其潛在作用靶點(diǎn)， 為肉靈芝及其有效成分的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器、 材料與試劑

BT25S型電子分析天平(上海天平儀器廠)、 MLS-3750型高壓滅菌鍋(日本SANYO公司)、 GZX-9070 MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)、 Centrifuge 5810R型高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)、 ALPHA 1-4 LD plus型凍干機(jī)(瑞士Buchi公司)用于實(shí)驗(yàn)試劑配制和肉靈芝浸提物提取、 凍干； UV-2501PC型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(香港基因有限公司)用于肉靈芝浸提物質(zhì)控監(jiān)測(cè)； SPL-80型生化培養(yǎng)箱(上海精科儀器有限公司)、 SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)(蘇州蘇凈集團(tuán)泰安公司)、 XTL-24型體視顯微鏡(日本奧林巴斯公司)和手動(dòng)移液器(北京大龍興創(chuàng)公司)等用于線蟲(chóng)常規(guī)培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作； Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)用于線蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序.

野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)(Bristol N2)和缺陷型大腸桿菌(EscherichiacoliOP50)均購(gòu)自美國(guó)線蟲(chóng)遺傳中心； 肉靈芝參照文獻(xiàn)[28]及其改良法經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程人工培育， 肉靈芝浸提物經(jīng)凍干后備用[8]； 酵母提取物和胰蛋白胨購(gòu)自英國(guó)OXOID公司； 瓊脂粉、 膽固醇及其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.2 方 法

1.2.1 肉靈芝浸提液制備

參照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程[28]用人工液體培育肉靈芝后， 采用離心的方式固液分離， 收集液體部分即為肉靈芝浸提物(MGL)， 其浸出液呈濃稠黃褐色透明狀， 成分及性狀穩(wěn)定， 液質(zhì)均勻， 其有效活性成分及含量見(jiàn)文獻(xiàn)[5-8]. 用培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coliOP50(OD600=0.4～0.6)稀釋MGL凍干品至終質(zhì)量濃度為1.5，2.5，5.0 mg/mL， 相同質(zhì)量濃度E.coliOP50為空白對(duì)照組.

1.2.2 線蟲(chóng)培養(yǎng)

采用固體培養(yǎng)法在線蟲(chóng)生長(zhǎng)(NGM)培養(yǎng)基表面涂布E.coliOP50菌液， 待E.coliOP50形成均質(zhì)菌膜后轉(zhuǎn)移線蟲(chóng)至NGM培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)、 繁殖并完成整個(gè)生命周期， 培養(yǎng)條件維持20 ℃， 飽和濕度95%, 恒溫恒濕. 實(shí)驗(yàn)選取蟲(chóng)卵進(jìn)行同期化培養(yǎng)(記為0 d)， 待線蟲(chóng)成長(zhǎng)至L4期進(jìn)行給藥處理， 每天轉(zhuǎn)移線蟲(chóng)至含有新鮮E.coliOP50菌膜的NGM培養(yǎng)基中， 并觀察線蟲(chóng)的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)， 記錄存活、 丟失及死亡數(shù)量.

1.2.3 線蟲(chóng)生理指標(biāo)評(píng)估

線蟲(chóng)存活率和產(chǎn)卵量是衡量線蟲(chóng)生長(zhǎng)狀態(tài)、 氧化損傷、 衰老及藥物毒性作用的經(jīng)典生理指標(biāo)[29-30]. 存活率實(shí)驗(yàn)選取L4期同期化線蟲(chóng)50只/組進(jìn)行不同質(zhì)量濃度MGL給藥處理， 采用觀察和觸碰法記錄線蟲(chóng)的生長(zhǎng)和生活狀態(tài)， 將輕微觸碰線蟲(chóng)軀干無(wú)明顯應(yīng)激反應(yīng)且咽部無(wú)收縮變化視為死亡； 將爬壁干枯或泄殖腔堵塞出現(xiàn)蟲(chóng)袋樣線蟲(chóng)記為丟失， 予以剔除. 產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)選取同期化產(chǎn)卵期成蟲(chóng)5只/組， L4期預(yù)喂食不同劑量MGL處理， 每天轉(zhuǎn)移線蟲(chóng)至新鮮培養(yǎng)基至產(chǎn)卵期結(jié)束， 恒溫恒濕培養(yǎng)蟲(chóng)卵至孵化， 觀察并統(tǒng)計(jì)幼蟲(chóng)數(shù)記為線蟲(chóng)日產(chǎn)卵量[31].

1.2.4 線蟲(chóng)氧化壓力模型構(gòu)建及氧化損傷評(píng)估

活性氧自由基(ROS)可參與并反映機(jī)體的生理生化變化及病理過(guò)程[32-34]. 熱刺激和毒物刺激是誘發(fā)機(jī)體氧自由基爆發(fā)及氧化-還原穩(wěn)態(tài)失衡的主要因素之一. 線蟲(chóng)在35 ℃熱刺激和過(guò)氧化氫誘導(dǎo)慢性氧化損傷條件下將發(fā)生顯著的熱激應(yīng)答反應(yīng)和毒物刺激響應(yīng)， 表現(xiàn)為存活率降低和體內(nèi)ROS驟增[35-36].

1) 熱激實(shí)驗(yàn). 選取L4期同期化線蟲(chóng)30只/組， 持續(xù)喂食3 d不同劑量MGL后， 轉(zhuǎn)移線蟲(chóng)至新鮮培養(yǎng)基中， 于35 ℃恒溫恒濕熱激誘導(dǎo)10 h， 期間每小時(shí)統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)存活數(shù)量， 將觸碰無(wú)應(yīng)激響應(yīng)且咽部無(wú)收縮反應(yīng)視為死亡.

2) 氧化損傷實(shí)驗(yàn). 選取L4期同期化線蟲(chóng)30只/組， 20 ℃培養(yǎng)條件下持續(xù)3 d喂食不同劑量MGL后， 轉(zhuǎn)移線蟲(chóng)至20 mmol/L過(guò)氧化氫培養(yǎng)基表面誘導(dǎo)慢性氧化損傷模型， 期間每30 min統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)存活數(shù)量， 以觸碰和咽收縮反應(yīng)判斷線蟲(chóng)存活狀態(tài).

3) 氧化損傷評(píng)估. 采用2,7-二氯二氫熒光素二乙酯(H2DCFDA)染色法評(píng)價(jià)線蟲(chóng)體內(nèi)氧自由基水平. 實(shí)驗(yàn)選取L4期同期化線蟲(chóng)100只/組， 持續(xù)喂食3 d不同劑量MGL后， 用M9 緩沖液沖洗并收集線蟲(chóng)至離心管中， 離心棄緩沖液， 采用終濃度100 μmol/L H2DCFDA避光靜止染色線蟲(chóng)2 h后， M9 緩沖液沖洗線蟲(chóng)表面殘余染料， 轉(zhuǎn)移線蟲(chóng)至瓊脂載玻片， 熒光顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm， 發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)觀察并拍照.

以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)重復(fù).

1.2.5 線蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)遵循RNA-seq高通量測(cè)序分析標(biāo)準(zhǔn)化流程， 將對(duì)照組和MGL組線蟲(chóng)收集， 經(jīng)RNA提取、 mRNA富集和反轉(zhuǎn)錄、 PCR富集和文庫(kù)質(zhì)控， 用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析， 從整體水平反映喂食MGL后各組線蟲(chóng)細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況， 并探究MGL潛在作用靶點(diǎn).

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

采用GraphPad Prism 5.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析； 用Kaplan-Meier方法繪制線蟲(chóng)存活率曲線; 用Log-rank (Mantel-Cox) Test 進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析，p<0.05*表示具有顯著性差異,p<0.01**表示極顯著差異； 基于BMKCloud(www.biocloud.net)云平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 肉靈芝浸提物主要成分分析

文獻(xiàn)[5,7]采用BCA法、 定磷法、 苯酚-硫酸法、 顯色反應(yīng)、 NBT-Gly法和比色法等對(duì)本批次肉靈芝浸提物進(jìn)行成分分析， 結(jié)果表明, 肉靈芝浸提物含有蛋白質(zhì)、 核酸、 多糖、 維生素C、 維生素E、 吡咯喹啉醌(PQQ)及游離氨基酸等成分. 對(duì)浸提物進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描， 結(jié)果如圖1所示. 由圖1可見(jiàn)， 浸提物在227，280 nm處有特征吸收峰， 與醌類(lèi)和蛋白質(zhì)的兩個(gè)特征吸收峰帶區(qū)相符， 核酸、 多糖和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不在特征吸收峰帶區(qū)范圍內(nèi)， 因此肉靈芝浸提物的主要成分為醌類(lèi)和蛋白質(zhì).

圖1 肉靈芝浸提物的紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果Fig.1 Ultraviolet full wavelength scanning results of MGL extracts

2.2 肉靈芝浸提物對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響

存活率是評(píng)價(jià)線蟲(chóng)生理狀態(tài)及藥物毒性作用的重要參考指標(biāo). 圖2為肉靈芝浸提物對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響. 由圖2可見(jiàn)： 與對(duì)照組相比， 2.5 mg/mL的MGL可顯著延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命(p<0.01**)， 隨MGL喂食劑量的增加(5.0 mg/mL)， 對(duì)線蟲(chóng)壽命的延長(zhǎng)作用不明顯； 2.5 mg/mL的MGL可使半數(shù)線蟲(chóng)存活23 d， 最長(zhǎng)存活35 d， 相比對(duì)照組分別延長(zhǎng)了43.75%和6.06%. 肉靈芝浸提物對(duì)線蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響如圖3所示. 由圖3可見(jiàn)， MGL組與對(duì)照組線蟲(chóng)的產(chǎn)卵量均呈先升高后降低的趨勢(shì)， MGL組日產(chǎn)卵量和總產(chǎn)卵量均高于對(duì)照組， 但無(wú)顯著性差異. 表明實(shí)驗(yàn)條件下肉靈芝浸提物對(duì)線蟲(chóng)的毒性作用較低， 且有一定程度的促排卵效果. 因此選擇最佳質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的MGL進(jìn)行生理指標(biāo)和抗氧化保護(hù)作用的評(píng)價(jià)研究.

2.3 肉靈芝浸提物對(duì)線蟲(chóng)抵抗體外慢性氧化損傷的保護(hù)

為驗(yàn)證肉靈芝浸提物對(duì)氧化壓力誘導(dǎo)條件下線蟲(chóng)的保護(hù)作用， 分別構(gòu)建線蟲(chóng)熱激壓力和過(guò)氧化氫誘導(dǎo)慢性氧化壓力損傷模型， 通過(guò)線蟲(chóng)存活率的變化評(píng)估肉靈芝浸提物的保護(hù)作用, 結(jié)果如圖4所示. 由圖4(A)可見(jiàn)， 在35 ℃熱激誘導(dǎo)條件下， 預(yù)喂食2.5 mg/mL的MGL組較對(duì)照組存活率顯著增高； 在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)慢性氧化損傷模型中(圖4(B))， 2.5 mg/mL肉靈芝浸提物可顯著延長(zhǎng)線蟲(chóng)的存活率.

圖4 肉靈芝浸提物對(duì)線蟲(chóng)抵抗外界氧化壓力的影響Fig.4 Effect of MGL extracts on oxidative stress resistance of nematode

在此基礎(chǔ)上， 通過(guò)染色法定性和定量分析線蟲(chóng)體內(nèi)氧自由基水平的變化， 結(jié)果分別如圖5和圖6 所示. 由圖6可見(jiàn)， 喂食2.5 mg/mL的MGL可顯著降低線蟲(chóng)體內(nèi)ROS水平(p<0.01**)， 表明肉靈芝浸提物具有顯著的抗氧化功效， 可保護(hù)線蟲(chóng)抵抗熱刺激和慢性氧化損傷， 降低線蟲(chóng)體內(nèi)ROS水平， 發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用.

圖5 2.5 mg/mL肉靈芝浸提物對(duì)線蟲(chóng)ROS影響的熒光定量分析Fig.5 Fluorescence quantitative analysis of effect of 2.5 mg/mL MGL extracts on ROS of nematodes

圖6 2.5 mg/mL肉靈芝浸提物對(duì)線蟲(chóng)ROS影響Fig.6 Effect of 2.5 mg/mL MGL extracts on ROS of nematodes

2.4 肉靈芝浸提物抗氧化作用機(jī)制

為進(jìn)一步探究肉靈芝浸提物抗氧化的作用機(jī)制， 對(duì)MGL組和對(duì)照組線蟲(chóng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)的對(duì)比分析， 結(jié)果如圖7所示. 經(jīng)RNA-seq高通量篩選和基因庫(kù)凈化處理， 共獲得有效功能注釋基因15 569 個(gè)， 經(jīng)差異表達(dá)基因篩選(DESeq_EBSeq, FDR=0.001, FC=2)， 共獲得上調(diào)基因539個(gè)， 下調(diào)基因549個(gè)， 無(wú)顯著性差異變化基因14 481個(gè)(圖7(A))； 對(duì)其進(jìn)一步GO富集分析， 篩選生物學(xué)過(guò)程、 分子功能和細(xì)胞組分分支中富集程度最高的前10個(gè)節(jié)點(diǎn)項(xiàng)， 內(nèi)含顯著性差異表達(dá)基因382個(gè)； 經(jīng)KEGG富集分析， 382個(gè)差異表達(dá)基因共富集到20個(gè)信號(hào)通路中(7(B))， 參與α-亞麻酸和脂肪酸代謝、 不飽和脂肪酸合成、 泛素調(diào)控蛋白水解和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與蛋白質(zhì)加工， 細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡以及壽命調(diào)控信號(hào)通路基因均顯著性高表達(dá). 選擇KEGG富集通路中顯著富集的9個(gè)通路內(nèi)含基因(21個(gè))進(jìn)行熱圖(圖7(C))、 蛋白互作(圖7(D))和功能注釋分析.

圖7 喂食肉靈芝浸提物線蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析和潛在靶點(diǎn)挖掘Fig.7 Transcriptome analysis and potential target mining for nematodes fed with MGL extracts

其中基因ech-1.1 (Enoyl-CoA Hydratase)，acox-3/F08A8.4 (Acyl-coenzyme A oxidase)，fat-7 (Fatty-acid desaturase 7)參與調(diào)控不飽和脂肪酸生物合成、 碳和多種氨基酸的降解與代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)；F44E5.4/F44E5.5和hsp-70基因與參與剪接體、 MAPK信號(hào)通路和內(nèi)吞作用相關(guān)蛋白的表達(dá)密切相關(guān)； Skp1蛋白家族(skr-5,7,8,9,10,12)和熱激蛋白HSP-70參與單肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解和加工； ?；o酶A氧化酶、 Skp1蛋白家族、 超氧化物歧化酶(sod-5)可發(fā)揮過(guò)氧化物酶活性， 調(diào)節(jié)線蟲(chóng)體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的平衡. 喂食肉靈芝浸提物可顯著影響脂肪酸去飽和酶、 超氧化物歧化酶、 線粒體內(nèi)膜易位酶(timm-23)、 熱激蛋白家族、 金屬硫蛋白-1(mtl-1)和Skp1蛋白家族相關(guān)蛋白的表達(dá)， 依賴(lài)壽命調(diào)節(jié)信號(hào)通路發(fā)揮抗衰老和抗氧化的保護(hù)作用. 該結(jié)果進(jìn)一步表明， 肉靈芝浸提物也具有潛在的調(diào)控脂肪代謝、 促進(jìn)蛋白合成、 抗氧化和抗衰老的生理保護(hù)功效.

綜上所述， 本文以秀麗隱桿線蟲(chóng)為模型， 通過(guò)線蟲(chóng)存活率和產(chǎn)卵量生理指標(biāo)、 氧化壓力誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法分析， 綜合評(píng)價(jià)了肉靈芝浸提物的抗氧化作用效果. 結(jié)果表明， 肉靈芝浸提物的毒副作用低、 生物安全度高， 可抵抗熱刺激和氧化損傷誘發(fā)的機(jī)體氧化穩(wěn)態(tài)失衡， 從而發(fā)揮抗氧化的作用功效. 此外， 肉靈芝還具有潛在的減脂、 促進(jìn)蛋白合成與抗衰老等保健作用， 為指導(dǎo)國(guó)民健康飲食、 抗氧化相關(guān)功能食品的開(kāi)發(fā)提供了新思路.