李一雷， 高興華， 楊蕎榕， 徐欣植， 楊 驥 ， 李 明*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科，上海 200032 2. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽 110001

白癜風(fēng)是一種獲得性自身免疫系統(tǒng)疾病，其特征是真皮、表皮黑素細(xì)胞進(jìn)行性破壞導(dǎo)致的原發(fā)性、局限性或泛發(fā)性累及皮膚及黏膜部位白斑。白癜風(fēng)每年全球平均發(fā)病率為0.4%～2%[1]，多在兒童和青少年時期發(fā)病，性別傾向相同[2]。白癜風(fēng)雖然一般不危及生命，但會對患者的身心健康、學(xué)習(xí)、工作及生活等多方面產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。白癜風(fēng)的病因目前尚不清楚，但多認(rèn)為是多因素導(dǎo)致，遺傳和環(huán)境因素都參與發(fā)病。在目前已知因素中，自身免疫在白癜風(fēng)的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用，但蛋白質(zhì)組學(xué)特別是小分子和血清蛋白在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用尚不清楚。白癜風(fēng)因發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、治療困難、病情反復(fù)，至今缺乏高效、特異的靶向治療手段，已經(jīng)成為皮膚病學(xué)亟待解決的一個重要課題。

雖然功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物篩選的應(yīng)用增加，但是研究人員對參與免疫性皮膚病發(fā)生發(fā)展的基因和蛋白質(zhì)模式卻知之甚少。近年來，自身免疫性皮膚病(包括紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥等)中的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用逐漸增多。這些研究提示，細(xì)胞因子、趨化因子和凋亡相關(guān)分子在自身免疫性疾病發(fā)病中發(fā)揮重要作用。這些研究不僅為疾病的發(fā)病機(jī)制提出了更深入的見解，而且發(fā)現(xiàn)了自身免疫性疾病具體的致病機(jī)制的特定基因模式[3]。

本研究采用雙向凝膠電泳(2-DE)與核素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)兩種質(zhì)譜技術(shù)篩選不同分期白癜風(fēng)的差異表達(dá)蛋白，篩選出與白癜風(fēng)發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的血清蛋白標(biāo)志物，進(jìn)而為研究疾病復(fù)發(fā)及預(yù)后，揭示疾病進(jìn)展機(jī)制提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月至2018年6月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院與2020年12月至2021年2月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科診治的30例白癜風(fēng)患者為研究對象。所有患者的臨床診斷和分期符合中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會皮膚性病專業(yè)委員會色素病學(xué)組制定并更新的《白癜風(fēng)診療共識(2018版)》[4]中的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)其白癜風(fēng)疾病活動度評分(VIDA)、臨床特征、同形反應(yīng)(KP)、Woods燈檢查結(jié)果診斷。進(jìn)展期判定參考VIDA評分：最近6周內(nèi)出現(xiàn)新皮損或原皮損擴(kuò)大加4分；最近3個月內(nèi)出現(xiàn)新皮損或原皮損擴(kuò)大加3分；最近6個月內(nèi)出現(xiàn)新皮損或原皮損擴(kuò)大加2分；最近1年內(nèi)出現(xiàn)新皮損或原皮損擴(kuò)大加1分；至少1年內(nèi)穩(wěn)定為0分；至少1年內(nèi)穩(wěn)定且有自發(fā)色素再生減1分。總分>1分即為進(jìn)展期，共15例；穩(wěn)定期15例。

進(jìn)展期男性7例、女性8例，年齡17～41歲，平均(31.20±8.47)歲；穩(wěn)定期男性8例、女7例，年齡17～48歲，平均(38.93±14.00)歲；對照組為同期健康志愿者，男性6例、女性9例，年齡17～50歲，平均年齡(41.67±9.86)歲。所有患者無其他自身免疫系統(tǒng)疾病和腫瘤，均在取樣前未接受藥物治療1個月以上。所有參與研究的患者和健康志愿者簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(B2021-151R2)。

1.2 去高豐度蛋白制備 清晨空腹取肘靜脈血5 mL，4℃ 靜置2 h，待自凝后，4℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清后-80℃ 保存?zhèn)溆谩Ｎ?00 μL樹脂勻漿于2.0 mL帶濾柱離心管中，12 000×g離心10 min，去保存液。加入400 μL平衡液，12 000×g離心10 min以洗滌樹脂，重復(fù)操作1次。緩慢滴加80 μL血清樣本于樹脂上，吸附10 min，12 000×g離心10 min；將收集到的樣本再次滴加至樹脂，吸附10 min，12 000×g離心10 min，加入100 μL平衡液洗滌樹脂，1 2000×g離心10 min；合并濾液后加入4倍體積丙酮，-20℃靜置過夜。將得到沉淀于4℃、1 2000×g離心20 min，去上清，晾干，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 2-DE

1.3.1 聚焦過程及凝膠圖像分析 第1向等電聚焦：上樣總蛋白120 μg；IPG預(yù)制膠條(24 cm，pH 4～7；Bio-Rad公司)；等電聚焦儀(GE Ettan IPGphor3)，程序為300 V 30 min、700 V 30 min、1 500 V 90 min、9 000 V 3 h、9 000 V 4 h，聚焦過程總電壓為52 kV/h。同一樣本重復(fù)聚焦3次。第2向十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE) 電泳：將膠條依次放入膠條平衡緩沖液Ⅰ、Ⅱ中，于低速搖床搖15 min，再轉(zhuǎn)至30% SDS-PAGE上；電泳程序為S1 2 W/膠 45 min、S2 17 W/膠至溴酚藍(lán)到膠底，約4.5 h，溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)底部時停止電泳并銀染。

凝膠經(jīng)掃描儀(UMAX Powerlook 1100)掃描后，用ImageMaster 2D platinum 5.0 轉(zhuǎn)件(GE)分析。組內(nèi)同一樣本3張膠圖，對其進(jìn)行背景消減、均一化和匹配等分析。蛋白表達(dá)量的組間比較采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)(α)為0.05；兩組間蛋白質(zhì)表達(dá)量相差2倍以上點為差異蛋白點。

1.3.2 質(zhì)譜鑒定 切下目的差異蛋白點進(jìn)行膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解，將抽提所得的肽段用ultrafleX Ⅲ TOF/TOF型質(zhì)譜儀進(jìn)行分析(Bruker公司) 。紫外線波長為355 nm，重復(fù)頻率為200 Hz，加速電壓為20 000 V，最優(yōu)相對分子質(zhì)量分辨率為1 500。收集相對分子質(zhì)量700～3 200處信號。胰酶自切峰為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜儀。所有實驗樣品的質(zhì)譜圖均以默認(rèn)模式獲得。利用軟件flexAnalysis(Bruker Dalton)過濾基線峰、識別信號峰；利用BioTools(Bruker Dalton)軟件搜索NCBI human數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，獲取差異表達(dá)蛋白信息，并在Gene Ontology (GO)數(shù)據(jù)庫查詢其分子功能。

1.4 iTRAQ

1.4.1 蛋白標(biāo)記及質(zhì)譜分析 使用ProteoPrep白蛋白和IgG去除試劑盒(Sigma-Aldrich公司)去除白蛋白，并使用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Thermo Fisher公司)估計IgG蛋白濃度。通過iTRAQ(AB Sciex公司)LC-MS/MS分析各組的總蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)樣品(100 μg)經(jīng)還原、烷基化和胰蛋白酶水解，進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記。所有標(biāo)記的肽合并，并在真空離心機(jī)中蒸干。用Gemini NX 3u C18 110A，150 mm×2.00 mm Phenomenex柱和Gemini 3u C6 Phenyl 110A，100 mm×2.0 mm柱進(jìn)行高效液相色譜法(HPLC)分析前，首先用緩沖液(NH3·H2O，pH 10)將iTRAQ標(biāo)記的樣品稀釋至100 μL，然后用H2O(流動相A)和80%乙腈(流動相B)進(jìn)行反相柱分離，流速為0.2 mL/min。使用溶劑梯度系統(tǒng)：0～15 min，5%～10%B；15～48 min，15%～25%B；48～60 min，25%～37%B；60～65 min，37%～95%B；65～70 min，95%B。在214 nm/280 nm處光密度監(jiān)測下洗脫，每50 s收集1次組分；總共10個組分，合并后干燥。采用線性梯度法分離多肽，用質(zhì)譜分析儀(Thermo Fisher 公司)在350～1 800m/z高分辨率模式下(>35 000)獲得質(zhì)譜，每個循環(huán)從每個質(zhì)譜中選擇最多20個前體進(jìn)行破碎，每個前體破碎的最短累計時間為120 ms、動態(tài)排除時間為10 s。串聯(lián)質(zhì)譜以高靈敏度模式(分辨率>175 000)記錄，并調(diào)整滾動碰撞能和iTRAQ試劑碰撞能。

1.4.2 功能注釋分析 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)由ReactomeFIViz(一種細(xì)胞景觀應(yīng)用程序，用于協(xié)助生物學(xué)家進(jìn)行路徑豐富和基于網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)分析)自動構(gòu)建。肽數(shù)據(jù)用ProteinPilot軟件5.0及Paragon蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索算法(AB Sciex公司)進(jìn)行分析。根據(jù)國際蛋白質(zhì)指數(shù)人類序列數(shù)據(jù)庫3.83版檢索得到的LC-MS/MS。分析半胱氨酸與甲基硫代磺酸甲酯(MMTS)烷基化情況，胰蛋白酶消化最多允許1次胰蛋白酶斷裂，同時用集成工具進(jìn)行錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)分析。基于GO，應(yīng)用PANTHER軟件對涉及生物過程、分子功能、細(xì)胞成分和途徑富集的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行評價，并獲得相應(yīng)的P值。

2 結(jié) 果

2.1 2-DE

2.1.1 電泳圖像結(jié)果 取120 μg蛋白上樣，在pH 4～7的預(yù)制干膠條進(jìn)行2-DE，獲得電泳圖，ImageMaster 2D platinum 5.0 軟件分析顯示有31個蛋白點的表達(dá)豐度變化明顯(P<0.05)。

2.1.2 電泳質(zhì)譜分析結(jié)果 結(jié)果(表1～表2)顯示：通過與對照組比較，在白癜風(fēng)穩(wěn)定期患者中得出10個差異蛋白，其中6個上調(diào)、4個下調(diào)；在白癜風(fēng)進(jìn)展期患者中得出25個差異蛋白，其中11個上調(diào)、14個下調(diào)。

表1 采用2-DE篩選的白癜風(fēng)穩(wěn)定期的差異蛋白

表 2 采用2-DE篩選的白癜風(fēng)進(jìn)展期的差異蛋白

2.2 iTRAQ質(zhì)譜分析結(jié)果 結(jié)果(表3～表4)顯示：通過與對照組比較，在穩(wěn)定期患者中得出62個差異蛋白，其中29個上調(diào)、33個下調(diào)；在進(jìn)展期患者中得出50個差異蛋白，其中30個上調(diào)、20個下調(diào)。

表3 采用iTRAQ篩選的穩(wěn)定期白癜風(fēng)的差異蛋白

續(xù)表

表4 采用iTRAQ篩選的白癜風(fēng)進(jìn)展期的差異蛋白

續(xù)表

2.3 2-DE和iTRAQ蛋白組學(xué)差異蛋白對比 兩種方法鑒定出穩(wěn)定期患者2個重合的差異蛋白，分別為間α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4、補(bǔ)體C4-A，表達(dá)均上調(diào)，其中間α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4差異倍數(shù)比率上調(diào)為主。鑒定出進(jìn)展期患者3個重合的差異蛋白，分別為補(bǔ)體C4-B、載脂蛋白A-Ⅰ(下調(diào))，間α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4的差異倍數(shù)比率下調(diào)為主(下調(diào))。

2.4 生物信息學(xué)分析 利用GO注釋富集分析兩種蛋白組學(xué)技術(shù)篩選的白癜風(fēng)不同分期差異蛋白，顯示進(jìn)展期和穩(wěn)定期差異蛋白存在于各種生物過程，如生物代謝、細(xì)胞凋亡、免疫共刺激、生物黏附、生物調(diào)控等。進(jìn)一步用PANTHER軟件分析這些蛋白在白癜風(fēng)不同分期中的富集通路，結(jié)果(圖1)顯示：進(jìn)展期差異蛋白主要富集于CCKR通路、纖溶酶原激活級聯(lián)通路、p53通路、趨化炎癥因子調(diào)控通路及DNA復(fù)制；穩(wěn)定期差異蛋白參與促性腺激素釋放激素受體調(diào)節(jié)通路、FAS信號通路、血管緊張素Ⅱ刺激信號通路等。

圖1 白癜風(fēng)穩(wěn)定期(A)與進(jìn)展期(B)差異蛋白富集通路

3 討 論

白癜風(fēng)是一種黑素細(xì)胞被破壞所致色素脫失性免疫功能失衡性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，多種致病學(xué)說共存，主要涉及遺傳、自身免疫、氧化應(yīng)激、細(xì)胞毒作用、黑素細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能缺陷、神經(jīng)介質(zhì)、微環(huán)境紊亂等。因此，尋找新的血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物有利于白癜風(fēng)不同分期的病理機(jī)制研究。

本研究采用兩種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對白癜風(fēng)不同分期患者的血清進(jìn)行差異蛋白篩選，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，穩(wěn)定期患者血清中絲氨酸蛋白酶抑制因子(SERPINA5)表達(dá)明顯上調(diào)，而亮氨酸拉鏈蛋白4(LUZP4)、補(bǔ)體C9表達(dá)明顯下調(diào)。其中，SERPINA5是活化蛋白C的抑制因子，其可以獨立作為纖溶酶原激活劑尿激酶的抑制劑參與宿主防御及腫瘤抑制、細(xì)胞凋亡等過程[5]。通過PANTHER軟件分析得出纖溶酶原激活級聯(lián)通路參與白癜風(fēng)穩(wěn)定期發(fā)生，而激活的通路中可能有篩選出的差異表達(dá)蛋白共同參與。另外，角蛋白骨架蛋白通常在鱗狀上皮組織中表達(dá)增多，本研究篩選出較多差異表達(dá)的不同序列號角蛋白，比如KRT6、KRT9，特別是進(jìn)展期白癜風(fēng)角蛋白Ⅰ型骨架蛋白16(KRT16)明顯上調(diào)。而KRT16在銀屑病、先天性厚甲中被依次報道，主要參與維持皮膚屏障功能和先天免疫相關(guān)基因表達(dá)，特別是表皮損傷相關(guān)的分子模式[6]。但認(rèn)為角蛋白可能是實驗過程中的混雜蛋白，暫排除不予考慮其為差異蛋白，而角蛋白是否為白癜風(fēng)角質(zhì)形成細(xì)胞受損導(dǎo)致輸注黑色素細(xì)胞障礙，仍需進(jìn)一步驗證。

與白癲風(fēng)穩(wěn)定期差異蛋白不同，進(jìn)展期白癜風(fēng)差異蛋白除了SERPINA5、LUZP4外，絲氨酸蛋白酶家族中SERPINA1(即α1-抗胰蛋白酶)表達(dá)亦上調(diào)。SERPINA1是血液循環(huán)系統(tǒng)中最豐富的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其主要作用為監(jiān)測肝臟或肺臟組織中蛋白酶的平衡，但在不同疾病中發(fā)揮的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用不同。成人慢性阻塞性肺病患者血液中SERPINA1降低[7]，而本研究顯示其在白癜風(fēng)進(jìn)展期患者中表達(dá)明顯上調(diào)，說明該蛋白在白癜風(fēng)患者血清中表達(dá)上調(diào)可能通過觸發(fā)急性期反應(yīng)，并改變血液循環(huán)中的急性期蛋白質(zhì)的合成和糖基化，發(fā)揮抗淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的抗炎活性。

對差異蛋白通過GO富集軟件進(jìn)行白癜風(fēng)相關(guān)通路排序，其中CCKR信號通路被首次發(fā)現(xiàn)參與白癜風(fēng)進(jìn)程。CCKR通路主要為APO脂代謝通路，為脂肪代謝時分泌因子通過腦迷走神經(jīng)傳遞信號的熱門研究機(jī)制[8]。不同分期白癜風(fēng)患者血清中篩選出的差異載脂蛋白不同，在穩(wěn)定期主要為載脂蛋白E(APOE)，在進(jìn)展期主要為載脂蛋白L1(APOL1)、載脂蛋白A(APOA)，而APOA和APOE分別為高密度脂蛋白(HDL)的主要和次要成分。脂代謝異常可誘導(dǎo)循環(huán)中及系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。近年研究[9]發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)可誘導(dǎo)樹突細(xì)胞(DCs)免疫成熟和炎癥反應(yīng)。最新研究[10]發(fā)現(xiàn)，在白癜風(fēng)病變皮膚中，DCs及其相關(guān)促炎細(xì)胞因子增加。本研究通路富集分析發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定期患者中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的差異蛋白參與AngⅡ通路，但AngⅡ是否誘導(dǎo)白癜風(fēng)患者病變皮膚中DCs及促炎因子發(fā)生聚集，從而發(fā)生免疫炎癥反應(yīng)，有待進(jìn)一步驗證。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)亦發(fā)生明顯變化。最新研究[11]發(fā)現(xiàn)，對白癜風(fēng)患者進(jìn)行紫外線光療后，p53-TRPM1/miR-211-MMP9軸激活。而p53通路參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移及黏附。本研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)不同分期中MMP9表達(dá)上調(diào)，且參與p53通路，進(jìn)一步說明MMP9可能通過p53通路介導(dǎo)的黑素細(xì)胞遷移。穩(wěn)定期白癜風(fēng)差異蛋白富集通路還包括FAS信號通路。而最新研究[12]同樣發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS介導(dǎo)的途徑參與小鼠白癜風(fēng)模型中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)依賴和誘導(dǎo)的人黑素細(xì)胞凋亡；有研究表明在白癜風(fēng)患者病變皮膚中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和干擾素γ(IFN-γ)表達(dá)水平升高，可以協(xié)同抑制FAS介導(dǎo)的凋亡。本研究篩選出的白癜風(fēng)穩(wěn)定期差異蛋白可能參與誘導(dǎo)黑色素細(xì)胞凋亡，與該作用機(jī)制相關(guān)的血清標(biāo)志物有望成成為白癜風(fēng)早期診斷和預(yù)后的有效指標(biāo)。

本研究借助2-DE與iTRAQ兩種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選白癜風(fēng)不同分期的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)SERPINA5等可能作為白癜風(fēng)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。富集通路分析發(fā)現(xiàn)，除了經(jīng)典p53通路外，差異蛋白還富集于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Fas通路及參與脂質(zhì)代謝的CCKR信號通路。本研究說明，應(yīng)用蛋白組學(xué)能篩選出新的血清標(biāo)志物及作用通路，對不同分期白癜風(fēng)的病理機(jī)制研究提供新的敏感指標(biāo)，然而篩選出的部分差異蛋白的差異率不一致，需要進(jìn)一步深入研究，以便為白癜風(fēng)患者提供有效的評估指標(biāo)及預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。