劉兆奕，吳桂平，林瑤瑤，趙紅麗，張曉丹

（沈陽醫(yī)學院 1.附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，沈陽 110002；2.研究生院，沈陽 110002）

心房顫動（簡稱房顫）是一種不規(guī)則的心律，即規(guī)則有序的心房活動喪失，代之以快速無序的顫動波，是臨床上最常見的快速型房性心律失常之一。其發(fā)病率隨年齡的增長不斷上升，在60～74歲人群中發(fā)病率高達8.0%［1］，在全球每年影響約3 300多萬患者。房顫引起的血流動力學異常和血栓事件（如心力衰竭、腦卒中等），使患者的致殘率、死亡率明顯增加?，F(xiàn)今，房顫的治療仍有很大的局限性，根本原因是其確切的發(fā)病機制尚不清楚。目前存在多種假說，包括多小波假說、局灶性沖動假說、心房重構(gòu)假說和神經(jīng)體液調(diào)節(jié)機制假說等。心房重構(gòu)是房顫發(fā)生和維持的基礎(chǔ)，心房重構(gòu)主要包括電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)和自主神經(jīng)系統(tǒng)重構(gòu)。結(jié)構(gòu)重構(gòu)的特點是心房纖維化、心房擴大以及細胞增殖、分化、凋亡等，是房顫的中心環(huán)節(jié)，與其相關(guān)的分子機制較多，關(guān)系錯綜復雜。因此，進一步研究心房重構(gòu)的機制能夠為房顫的防治提供重要的理論依據(jù)，便于早期對房顫進行安全、有效的干預和治療。

微RNA（microRNA，miRNA）是一類由18～25個核苷酸組成的單鏈非編碼小分子RNA，以mRNA為靶分子，與靶基因mRNA的3’-非翻譯區(qū)結(jié)合，通過切割降解mRNA或者抑制轉(zhuǎn)錄后的靶基因、改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)基因的表達，實現(xiàn)其在體內(nèi)的多種生物學功能。ZHAO等［2］通過組織學檢查，證明轉(zhuǎn)基因小鼠中miRNA-328以旁分泌方式將心肌細胞轉(zhuǎn)化為心肌成纖維細胞，從而促進心肌纖維化，最終導致心肌重構(gòu)。近年來，miRNA在心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的作用受到醫(yī)學界廣泛關(guān)注。已有研究［3］表明，miRNA-328在犬房顫模型中明顯上調(diào)。但miRNA-328水平的升高與心房重構(gòu)是否相關(guān)，以及miRNA-328對房顫的發(fā)生和維持是否發(fā)揮作用，未見研究報道。本研究首次探討了miRNA-328在房顫患者血清中的表達水平及其與心房重構(gòu)的相關(guān)性，從而為房顫患者心房重構(gòu)的診療和干預提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

根據(jù)《2016年歐洲心臟病學會房顫管理指南》，選取2019年1月10日至2020年5月31日于沈陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科就診的房顫患者120例（房顫組），并選擇同期正常體檢者40例作為對照組。房顫組分為陣發(fā)性房顫（40例）、持續(xù)性房顫（48例）和永久性房顫（32例）3個亞組。采用美國紐約心臟病協(xié)會標準對120例房顫患者進行心功能分級，其中Ⅰ級 13例，Ⅱ級 40例，Ⅲ級 36例，Ⅳ級 31例。所有患者行一般病史采集、心電圖、動態(tài)心電圖、心臟超聲檢查、血糖、血脂、miRNA-328定量檢測。所有研究對象均自愿參加本研究并簽署知情同意書。

排除標準：房顫病史不明，近期感染及電解質(zhì)紊亂，先天性心臟病，惡性腫瘤，帕金森病，精神病不配合治療，嚴重肝腎功能障礙，結(jié)締組織病，自身免疫性疾病，哺乳和妊娠期婦女。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集：入院后首日或次日空腹12 h以上采集肘靜脈血，采用全自動生化儀測定血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、N端腦利鈉肽前體（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）、肝腎功能等，并留取空腹血，按照RNA提取試劑盒說明離心取血清，儲存于-80 ℃冰箱中待測。

1.2.2 心臟彩色多普勒超聲檢查：記錄左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心房內(nèi)徑（left atrial diameter，LAD）。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測miRNA-328相對表達量：利用血液總RNA提取試劑盒（DP443，天根生化科技有限公司）提取總RNA，具體參照說明書進行，采用微升核酸分析（Nanodrop 2000c，美國Thermo Scientific公司）檢測RNA的濃度和純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PCR-311F，日本TOYOBO公司）進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用SYBRTMGreen試劑盒（QPK-201，美國ABI公司）分別檢測樣本中miRNA-328-5p和U6的表達水平。每個樣本至少設(shè)置3個復孔，采用2-△△Ct法計算miRNA-328-5p在各組中的相對表達量。miRNA-328-5p和U6引物由廣州銳博生物技術(shù)有限公司 提供。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 一般資料的比較

房顫組和對照組在年齡、性別、吸煙、糖尿病、TC、TG、HDL-C、LDL-C方面的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性；房顫組中冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和高血壓的患者比例及LAD均高于對照組（P＜ 0.05）。3個房顫亞組比較，年齡、LAD、LVEF、NT-proBNP的差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表1、2。

表1 房顫組和對照組一般資料的比較Tab.1 Comparison of general data between the atrial fibrillation and control groups

表2 房顫亞組一般資料的比較Tab.2 Comparison of general data among atrial fibrillation subgroups

2.2 miRNA-328相對表達量

對照組和房顫組miRNA-328的表達水平分別為1.25±0.11和1.66±0.17，房顫組miRNA-328的表達水平顯著高于對照組（P＜ 0.05）。陣發(fā)性、持續(xù)性和永久性房顫亞組miRNA-328的表達水平分別為1.54±0.09、1.61±0.05和1.84±0.14，永久性房顫亞組miRNA-328表達水平最高，與陣發(fā)性、持續(xù)性房顫亞組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），持續(xù)性房顫亞組miRNA-328表達水平較陣發(fā)性房顫亞組高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級心功能患者miRNA-328的表達水平分別為1.26±0.13、1.55±0.16、1.78±0.46和2.06±0.75，隨著心功能分級的增加，miRNA-328表達水平也逐漸升高，不同心功能分級間miRNA-328表達水平的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。

2.3 Pearson相關(guān)性分析及偏相關(guān)分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，房顫組中，miRNA-328與LAD、年齡呈正相關(guān)（r=0.264，P＜ 0.05；r=0.611，P＜ 0.05）。偏相關(guān)分析結(jié)果顯示，調(diào)整年齡、性別、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病、高血壓、吸煙等因素后，房顫組中miRNA-328表達水平仍與LAD呈正相關(guān)（r=0.368，P＜ 0.05），提示miRNA-38參與心房重構(gòu)過程。

2.4 ROC曲線分析miRNA-328的預測價值

血清miRNA-328的曲線下面積為0.782，95%置信區(qū)間為0.689～0.875（P＜ 0.01）。見圖1。

圖1 miRNA-328相對表達量的ROC曲線分析Fig.1 ROC curve analysis of miRNA-328 relative expression level

3 討論

目前，房顫的治療方式主要包括射頻消融術(shù)、抗凝、轉(zhuǎn)復竇性心律、控制心室率等藥物治療以及外科的改良迷宮手術(shù)治療，但這些治療都存在復發(fā)率高、有效性低等局限性，其根本原因是房顫的發(fā)生機制尚未明確。目前認為心房重構(gòu)是房顫的主要發(fā)病機制，因此針對心房重構(gòu)的房顫上游治療成為研究的熱點。

研究［4］表明，心房重構(gòu)主要是細胞外基質(zhì)增多，成纖維細胞增殖轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，間質(zhì)中膠原蛋白和纖維蛋白合成增加導致心肌纖維化、心肌順應(yīng)性下降以及心房擴大等一系列病理生理改變。miRNA通過調(diào)節(jié)成纖維細胞的增殖分化，從而影響心房重構(gòu)。已有研究［5-7］表明，miRNA-26、miRNA-328、miRNA-1、miRNA-133、miRNA-590、miRNA-21、miRNA-29等都與心房重構(gòu)有關(guān)。這也提示，有眾多miRNA參與調(diào)節(jié)心肌纖維化過程，分別影響房顫的發(fā)生和維持。SOEKI等［7］的研究提示，miRNA-328在左心房重構(gòu)中的重要性大于miRNA-1。

miRNA-328是一種位于染色體16q22.1上的小分子RNA，已有研究［8-10］顯示，miRNA-328不僅在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，還參與調(diào)控細胞增殖和分化、腫瘤生長、炎癥等一系列生物學過程，因此可作為多種疾病診斷和預后的標志物。MCMANUS等［11］發(fā)現(xiàn)，miRNA-328通過 影響L型Ca2+通道密度促進心房電重構(gòu)，認為miRNA-328可作為進一步探索房顫的重要標志物。LI等［12］采用RNA測序技術(shù)對房顫兔右心房進行研究，發(fā)現(xiàn)miRNA-328通過調(diào)節(jié)下游蛋白編碼基因CACNA1C參與心房電重構(gòu)。LU等［13］在房顫犬模型心房組織中證明了miRNA-328通過影響L型Ca2+通道基因，使動作電位時程縮短，從而誘導房顫的發(fā)生，下調(diào)miRNA-328表達水平或基因敲除miRNA-328可抑制房顫。既往研究［14］顯示，LAD是發(fā)生房顫的獨立危險因素，但房顫患者中miRNA-328水平與LAD的相關(guān)性少有文獻報道。另外，動物模型中的房顫與臨床患者房顫情況存在差異。

本研究以臨床房顫患者為研究對象，檢測其血清miRNA-328水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，房顫患者miRNA-328的表達水平明顯升高。且在調(diào)整性別、年齡、高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、吸煙等因素后，房顫組中血清miRNA-328表達水平仍與LAD呈正相關(guān)，提示miRNA-328可能參與房顫患者的心房重構(gòu)過程。永久性房顫亞組中miRNA-328表達水平顯著高于陣發(fā)性房顫亞組和持續(xù)性房顫亞組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。持續(xù)性房顫組中miRNA-328表達水平較陣發(fā)性房顫組高，但差異無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05），提示房顫持續(xù)時間越長，血清miRNA-328的表達水平越高，但在陣發(fā)性房顫和持續(xù)性房顫患者中差異不大。這與王璽等［15］的研究結(jié)果不同，考慮可能與樣本量差異以及研究的房顫人群之間的異質(zhì)性有關(guān)。同時，ROC曲線分析提示，miRNA-328對房顫的發(fā)生具有一定的預測價值。本研究提示，miRNA-328可能參與房顫患者的心房重構(gòu)過程，可成為房顫早期預警的生物學標志物和未來治療房顫的新靶點。

此外，房顫是心功能不全患者最常合并的心律失常，兩者常同時存在，相互促進，互為因果。且心功能不全患者本身具有心律失常易感性，心功能不全的程度越重，發(fā)生心律失常的傾向性越大。本研究中，隨著心功能分級的增加，房顫患者血清miRNA-328表達水平逐漸升高，提示在臨床上心功能不全患者發(fā)生房顫的可能性大，miRNA-328有望作為預測心功能不全患者病情嚴重程度和心功能狀態(tài)的一個指標。但本研究樣本量少，缺乏多中心的研究，結(jié)果可能存在一定偏倚，對于心功能不全合并房顫患者的心功能分級是否與miRNA-328表達水平有直接關(guān)系，還需進行進一步的基礎(chǔ)和臨床研究。