崔興，徐龍進(jìn)

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，濟(jì)南 250011；2.山東省疾病預(yù)防控制中心，濟(jì)南 250011）

微RNA（microRNA，miRNA）是真核細(xì)胞生物中廣泛存在的RNA分子，通過與mRNA特異性結(jié)合，抑制相關(guān)基因的表達(dá)［1］，其表達(dá)紊亂與腫瘤發(fā)病密切相關(guān)［2］。miRNA既可作為多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）診斷和治療的標(biāo)志性因子［3］，也可以通過干預(yù)增殖、自噬、凋亡等相關(guān)基因，影響MM的進(jìn)程［4-5］。miR-181家族在人體內(nèi)廣泛存在，主要包括miR-181a、miR-181b、miR-181c及miR-181d［6］。在白血病細(xì)胞模型中，miR-181a以周期蛋白p27Kip 1為靶點，抑制細(xì)胞分化和細(xì)胞周期停滯［7］。miR-181a還能以ATG5為靶點，抑制血清饑餓誘導(dǎo)和雷帕霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬［8］。miR-181a表達(dá)降低可導(dǎo)致線粒體功能障礙，線粒體膜電位降低［9］，并可以通過干預(yù)Parkin對線粒體自噬起調(diào)控作用［10］。本研究組在前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，干預(yù)MM細(xì)胞的線粒體自噬可以誘發(fā)其程序性死亡，本研究擬進(jìn)一步探討明確miR-181a對MM的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

MM細(xì)胞株MM1S購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，LipofectamineTMRNAiMAX及相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公 司；LC3 Ⅱ，LC3Ⅰ，Beclin-1，P62，cleavedcaspase-3，Bcl-2，Bax，Parkin單克隆抗體購自美國Affinity Biosciences公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡流式檢測試劑盒購自美國BD公司；miRNA的PCR引物、miRNA抑制劑（miRNA inhibitor）由北京Invitrogen公司合成。Parkin siRNA購自銳博生物公司。miRNA實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測試劑盒All-in-One miRNA qRT-PCR購自美國GeneCopoeia公司，使用美國ABI公司的ABI 7500儀器進(jìn)行qRT-PCR檢測。

1.2 MM患者骨髓及細(xì)胞株中miR-181a表達(dá)水平的檢測

抽取15例MM患者骨髓，作為MM組。抽取5例健康志愿者外周血，作為正常對照組。以上標(biāo)本均使用免疫磁珠分選。所有樣本的采集均獲得患者知情同意及醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。將MM細(xì)胞株設(shè)為MM1S組。根據(jù)操作說明書，TRIzol法提取2組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。miR-181a引物序列為5’-TGTCAGGCAACCGTATTCACCGTGAGTGGTACT CAC-3’；Short-miR-181 a序列為5’-CGTCAGATGTCC GAGTAGAGGGGGAACGGCGAACATTCAACGCTGT CGGTGA-3’。按SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR試劑盒（TaKaRa RR716）說明書配制反應(yīng)體系，經(jīng)過94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，擴(kuò)增45個循環(huán)。結(jié)果用比較閾值法定量分析，用2-△△Ct法計算。

1.3 細(xì)胞分組及檢測

1.3.1 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染：培養(yǎng)人MM細(xì)胞株MM1S細(xì)胞并傳代，將處于對數(shù)生長期細(xì)胞接種至6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)Lipofectamine?2000試劑盒說明書，分別用miR-181a inhibitor、對照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，設(shè)為miR-181a inhibitor組、miR-181a NC組。LV3-miR-181a inhibitor序列為5’-ACTCACCGACAG CGTTGAATGTT-3’。LV3-NC序列為5’-TTCTCCGA ACGTGTCACGT-3’。干擾Parkin以回復(fù)實驗的操作為在轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后，培養(yǎng)10 h，使用Parkin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，設(shè)為Parkin組。各組轉(zhuǎn)染后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測。

1.3.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活性：各組細(xì)胞離心，用PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，將2×103個細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別在24、48和72 h時，加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中再孵育2 h后上機檢測，使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度，計算各組活性，實驗重復(fù)3次。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：根據(jù)AnnexinⅤ試劑盒說明書操作。各組細(xì)胞離心，PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，將2×105個細(xì)胞加入5 μL AnnexinⅤ-EGFP混勻后，加入5 μL 碘化丙啶，混勻。避光孵育10～15 min后，上機檢測。統(tǒng)計Q4區(qū)數(shù)值，計算早期凋亡率，實驗重復(fù)3次。

1.3.4 線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測：取2×105細(xì)胞置于0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入0.5 mL JC-1染色液，37 ℃培養(yǎng)15 min，4 ℃離心4 min，洗滌，重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測，通過分析2個通道的比例（紅色Q2/綠色Q4）判斷MMP水平。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)及自噬小體的透射電子顯微鏡（簡稱電鏡）觀測：各組取2×105個細(xì)胞離心沉淀，加入2.5%戊二醛溶液固定，經(jīng)丙酮脫水、滲透、包埋固化、60～80 nm超薄切片、染色后，透射電鏡下觀察自噬泡。

1.3.6 miR-181a靶基因的生物信息學(xué)分析：通過TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）在線預(yù)測的miR-181a所有潛在靶基因，將其輸入在線功能聚類軟件David（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）對所有基因功能分類，找到miR-181a的靶基因。

1.3.7 Western blotting檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)：各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集5×105個細(xì)胞，提取總蛋白，蛋白定量，取40 μg蛋白行SDS-PAGE電泳，40 mA恒流條件下4 ℃轉(zhuǎn)膜過夜。TBST洗膜，分別加入一抗4 ℃孵育過夜（LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62、cleaved-caspase-3、Bcl-2/Bax和Parkin抗體），再與HRP標(biāo)記的二抗作用，ECL發(fā)光，采用灰度掃描系統(tǒng)測定軟件（美國National Institutes of Health）分析目的蛋白條帶。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組miR-181a的表達(dá)情況

結(jié)果顯示，MM組與MM1S組miR-181a表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.14），且均較正常對照組顯著升高（P＜ 0.001），見圖1。

圖1 3組miRNA-181a表達(dá)水平Fig.1 The miRNA-181a mRNA expression levels in three groups

2.2 miR-181a inhibitor對MM1S細(xì)胞活性的影響

與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后，MM1S細(xì)胞的活性在48 h時受到顯著抑制（P=0.008），見圖2A。提示miR-181a對維持MM細(xì)胞活性具有重要意義。

2.3 miR-181a對MMP的影響

應(yīng)用JC-1熒光探針測定各組MMP，以觀察線粒體途徑早期細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，miR-181a inhibitor組MMP的水平（0.43±0.03）顯著低于空白對照組（2.21±0.07）和miR-181a NC組（2.07±0.12）（P＜ 0.01），見圖2D。說明 抑制miR-181a可 以促進(jìn)MM1S細(xì)胞的線粒體途徑凋亡。

2.4 miR-181a靶基因的生物信息學(xué)分析

通過TargetScan在線預(yù)測及在線功能聚類軟件David對所有基因功能分類，發(fā)現(xiàn)miR-181a的靶基因為Parkin，見圖3A。

2.5 miR-181a干預(yù)Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬

Western blotting結(jié)果顯示，與對照組比較，miR-181a inhibitor組cleaved-caspase-3表達(dá)上調(diào)（P＜ 0.001），提示該組細(xì)胞凋亡水平高；Bcl-2/Bax水平顯著降低（P＜ 0.001），提示為線粒體途徑凋亡；與對照組比較，miR-181a inhibitor組的自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ/LC3Ⅰ水平上調(diào)（P＜ 0.001），P62水平顯著下降（P=0.001），提示轉(zhuǎn)染組自噬水平顯著升高；miR-181a inhibitor組Parkin表達(dá)水平高于對照組（P＜ 0.001），Parkin siRNA組回復(fù)后表達(dá)水平與對照組差異顯著（P=0.003），提示抑制miR-181a的表達(dá)后，MM1S細(xì)胞線粒體自噬水平升高，見圖3B、3C。

2.6 電鏡下觀察自噬泡和線粒體結(jié)構(gòu)

透射電鏡下，對照組未見到明顯自噬泡，線粒體的大小和形狀基本正常，見圖3D。而miR-181a inhibitor組可以觀察到線粒體結(jié)構(gòu)破壞、嵴消失、正常線粒體數(shù)量減少，自噬泡增多，證明miR-181a可以抑制自噬，降低正常線粒體水平及功能，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。見圖3E。

2.7 Parkin基因敲減對自噬與凋亡的影響

敲減Parkin以進(jìn)行回復(fù)實驗，結(jié)果顯示，Parkin組細(xì)胞活性、凋亡水平（圖2A、2B）、MMP水平（圖2D）、Bcl-2/Bax水平及線粒體自噬相關(guān)標(biāo)志物水平（圖3B）與對照組相仿，與miR-181a inhibitor組差異顯著（P＜ 0.001）。提示抑制miR-181a后，MM1S線粒體自噬水平升高，而凋亡經(jīng)由Parkin通路誘發(fā)。

圖2 各組細(xì)胞活性、凋亡水平及線粒體膜電位水平檢測結(jié)果Fig.2 The viability，apoptosis level，and mitochondrial membrane potential level test results

圖3 各組細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白水平及電鏡檢測結(jié)果Fig.3 The mitophagy proteins level and TEM test results

3 討論

miRNA對正常細(xì)胞及包括MM在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞自噬的調(diào)控涉及多個環(huán)節(jié)，包括起始、成核、成熟等［11-14］。自噬可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激防止生成錯誤折疊蛋白，促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖；子葉烯 A 和長春新堿能通過干預(yù)MM細(xì)胞自噬而抑制其自我更新［15-16］。線粒體是關(guān)乎所有細(xì)胞生命活動極其重要的細(xì)胞器，因此線粒體自噬維持線粒體的質(zhì)量與數(shù)量對細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。而線粒體自噬異常、mTOR和ERK1/2磷酸化水平增高與MM自我更新及硼替佐米耐藥有關(guān)［17］。目前已知線粒體自噬的調(diào)控方式主要有2種，一種是Parkin依賴性的，即 Parkin與線粒體外膜蛋白PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬［18］，另一種是非 Parkin依賴性的，如Nix介導(dǎo)的線粒體自噬［19］。Parkin對底物泛素化具有重要意義，能夠觸發(fā)選擇性線粒體自噬［20］，因此Parkin水平能在一定程度上反映線粒體自噬程度。而作為調(diào)控Parkin水平的miRNA，pre-miR-181a參與了包括肺癌［21］和急、慢性白血?。?2-23］在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞線粒體內(nèi)在途徑，包括Bax寡聚化，MMP降低及凋亡蛋白caspase-9和caspase-3的水解；miR-181a也可直接調(diào)控某些靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，并在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［24］。研究［25］發(fā)現(xiàn)，miR-181a可通過下調(diào)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SYSY細(xì)胞E3泛素鏈接蛋白Parkin的表達(dá)，抑制線粒體自噬，并能提高線粒體解偶聯(lián)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的程度，進(jìn)一步證實了miR-181a的靶基因及其具體作用機制。

既往研究［26］證實，MM患者骨髓、外周血單個核細(xì)胞中miR-181a水平較正常人顯著升高；在意義未明單克隆免疫球蛋白血癥患者中，該miR-181a水平也可見升高［10］，且與疾病的程度呈正相關(guān)，D-S分期Ⅲ患者水平明顯高于Ⅰ+Ⅱ期患者［27］。研究［27-29］證實，miR-181a可通過干預(yù)包括NOVA1、HOXA1等多種基因影響MM細(xì)胞的增殖；動物體內(nèi)實驗證實，敲除miR-181a后，MM瘤負(fù)荷明顯降低［30］，以上結(jié)果均證實了miR-181a與MM發(fā)病的相關(guān)性。但目前少見關(guān)于miR-181a在MM細(xì)胞線粒體自噬中的研究。

本研究結(jié)果表明，在MM患者的骨髓及MM1S細(xì)胞株中，miR-181a表達(dá)水平均高于正常人，與其他研究［27-28］結(jié)果一致。MM1S細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后，細(xì)胞活性明顯下降?？紤]到miR-181a是線粒體自噬抑制劑，因此進(jìn)行了線粒體相關(guān)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在miR-181a inhibitor作用下，MM1S細(xì)胞的MMP下降，而cleaved-caspase-3水平升高，Bcl-2/Bax水平明顯降低。Bcl-2與Bax屬于同一個家族，通過控制線粒體膜的通透性，調(diào)節(jié)凋亡激活物的釋放，影響細(xì)胞的狀態(tài)，Bcl-2表達(dá)水平升高和（或）Bax表達(dá)水平降低表示細(xì)胞對凋亡的抵抗性增強。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miR-181a后，Bcl-2水平下降明顯，而Bax水平變化不顯著，提示miR-181a inhibitor誘發(fā)了MM細(xì)胞的線粒體途徑凋亡。進(jìn)一步檢測線粒體自噬指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，miR-181a inhibitor作用下，P62蛋白表達(dá)水平降低，LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ比值升高，且電鏡證實細(xì)胞內(nèi)自噬小體增加，而miR-181a的靶基因Parkin表達(dá)水平升高，提示抑制miR-181a可以通過調(diào)控Parkin通路干預(yù)線粒體自噬，從而促進(jìn)MM細(xì)胞的凋亡?；貜?fù)實驗結(jié)果進(jìn)一步顯示，敲減Parkin后，miR-181a inhibitor降解靶基因Parkin的作用減弱，從而促進(jìn)線粒體自噬及MM細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)抑制miRNA-181a可增強Parkin表達(dá)，促進(jìn)其通路介導(dǎo)的線粒體自噬，從而促進(jìn)MM細(xì)胞的凋亡。