楊麗麗，張瓊文，張 瑜，張其偉，陳 婷，江明生

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530000）

1999年，小肌肉蛋白（Small Muscle Protein X-Link，）在人類基因組中首次被發(fā)現(xiàn)，它位于Xp22號(hào)染色體上，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，長(zhǎng)52.1 kb，mRNA長(zhǎng)886 bp，主要在心臟和骨骼肌中表達(dá)，初步推測(cè)與肌肉發(fā)育相關(guān)。2001年，Kemp等研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)運(yùn)動(dòng)的小鼠在引起肌細(xì)胞肥大的同時(shí)，基因的mRNA表達(dá)量顯著升高，推測(cè)基因參與肌細(xì)胞增殖過(guò)程。同年，Palmer等研究發(fā)現(xiàn)，在CC肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)肌細(xì)胞融合。鄧瑞強(qiáng)研究表明參與大白豬胚胎期肌纖維的發(fā)育。郭梁研究發(fā)現(xiàn)，基因在牦牛右心室表達(dá)量最高，因此推測(cè)基因在不同組織中發(fā)揮不同作用。官紅平研究發(fā)現(xiàn)，基因在豬的心肌和骨骼肌中高表達(dá)，在其他組織中低表達(dá)或不表達(dá)，且基因與肌內(nèi)脂肪含量呈極顯著相關(guān)。上述研究表明，與肌肉發(fā)育相關(guān)，但其作用機(jī)制不清楚。因此，探究基因在肌肉發(fā)育過(guò)程中的作用可為深入研究其作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

目前，的研究在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域較多，主要集中在人的聽力損失上，但是關(guān)于動(dòng)物肌肉發(fā)育的研究極少，僅在豬和牦牛上有過(guò)相關(guān)研究。動(dòng)物肌肉的發(fā)育與肉質(zhì)性狀息息相關(guān)，X染色體相關(guān)小肌肉蛋白（Small Muscle Protein X-link，）基因影響肌纖維的發(fā)育，從而影響肉質(zhì)性狀。隆林山羊是廣西地方品種，主要分布于云貴高原桂西北山區(qū)，具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，但其生長(zhǎng)速度慢，產(chǎn)肉量低，導(dǎo)致生產(chǎn)性能低，阻礙了畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。幼齡山羊生長(zhǎng)發(fā)育速度較快，此階段研究山羊的肌肉發(fā)育是最佳時(shí)期，因此本研究選擇1月齡隆林山羊作為研究對(duì)象，對(duì)基因進(jìn)行克隆，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)檢測(cè)其在不同組織中的表達(dá)，這將為山羊基因的進(jìn)一步研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1月齡隆林山羊3只，分別采集心、肝、脾、肺、腎、背肌、腿肌，及時(shí)處理后保存于-80℃。

1.2 主要試劑 TRlzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime ScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、RNase Free HO、異丙醇、無(wú)水乙醇、氯仿、定量試劑盒（Prime ScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser）、Premix Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體、大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)NCBI查找山羊基因序列，使用oligo7.0設(shè)計(jì)、GAPDH引物（表1），送至諾唯贊生物公司合成。

表1 引物信息

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成 采用TRlzol法提取1月齡隆林山羊心、肝、脾、肺、腎、背肌、腿肌的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 隆林山羊基因的克隆 以cDNA為模板、為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR體系：premix Taq 5.0 μL，cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.3 μL，加RNase free HO至10 μL。以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在紫外燈照射下用刀片切目的條帶做膠回收，膠回收產(chǎn)物連接pMD-18t載體4℃過(guò)夜，接著轉(zhuǎn)化進(jìn).DHsx感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)，再挑菌、涂板、菌液PCR驗(yàn)證，將陽(yáng)性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用1.2.2步驟反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參基因，qRT-PCR檢測(cè)在不同組織中的表達(dá)量，反應(yīng)體系為：premix Ex Taq II 5.0 μL，上下游引物各0.3 μL，cDNA 2.5 μL，加RNase free HO至10 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 變性30 s，60℃退火30 s。采用2法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5基因克隆及生物信息學(xué)分析 MegAlign軟件比對(duì)隆林山羊基因與其他物種的同源性；使用ProtParam在線軟件（https://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；ProtScale在線軟件（https://web.expasy.org/protscale/）分析疏水性；Signal 5.1在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽；TMHMM Server v.2.0軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；NetPhos 3.1 Server軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)蛋白可能存在的磷酸化位點(diǎn)及保守特異蛋白激酶位點(diǎn)；NetNGlyc 1.0軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預(yù)測(cè)蛋白潛在N-糖基化位點(diǎn)；PSORT PSORT II（http://psort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)蛋白位置；Prabi SOPMA程序（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL軟 件（http://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1基因克隆 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察到在400 bp處有清晰、單一的目的條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 SMPX菌液PCR產(chǎn)物

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1基因序列比對(duì)分析 隆林山羊基因CDS區(qū)與NCBI上山羊基因CDS區(qū)同源性高達(dá)100%，與綿羊、牛、野豬、人、小鼠、雞的同源性分別是99.2%、97.6%、92.2%、91.6%、84.9%、75.7%（圖2）。基于不同物種的基因核苷酸序列，利用Meg Align軟件構(gòu)建分子進(jìn)化樹（圖3），系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示隆林山羊與綿羊、牛的親緣關(guān)系比較近，與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖2 SMPX基因同源性比對(duì)

圖3 SMPX基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2.2理化性質(zhì) 隆林山羊基因編碼蛋白分子式是CHNOS，分子質(zhì)量為20.61 ku，原子總數(shù)為2 592個(gè)，等電點(diǎn)5.29，說(shuō)明是酸性蛋白?；蚓幋a蛋白由4種氨基酸組成（表2），丙氨酸（Ala）占比最高為32.2%，其次是半胱氨酸（Cys），占比25.9%，甘氨酸（Gly）稍低于半胱氨酸，占25.5%，蘇氨酸（Thr）最低，占16.5%，基因編碼蛋白共編碼255個(gè)氨基酸；消光系數(shù)4 125；不穩(wěn)定系數(shù)36.09；總平均親水性1.009。

表2 隆林山羊SMPX蛋白的氨基酸組成

2.2.3 SMPX蛋白親/疏水性 對(duì)隆林山羊SMPX蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第89位氨基酸處分值最大，為2.39，在125位氨基酸處分值最小，為0.1（圖4），說(shuō)明SMPX是疏水性蛋白。

圖4 SMPX蛋白親/疏水性分析

2.2.4 跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位 TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)隆林山羊SMPX蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。Signal 5.1預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在1～22氨基酸處SMPX具有信號(hào)肽，說(shuō)明SMPX是分泌蛋白。PSORT PSORT II預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、高爾基體，占比分別是33.3%、33.3%、22.2%、11.1%。綜上，隆林山羊SMPX蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，其次是細(xì)胞核。

2.2.5 磷酸化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)分析該蛋白可能存在11個(gè)磷酸化位點(diǎn)。使用NetNGlyc 1.0在線軟件，軟件預(yù)測(cè)SMPX無(wú)N-糖基化位點(diǎn)。

2.2.6 SMPX蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 分析SMPX蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)螺旋結(jié)構(gòu)占28.57%，轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占3.57%，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占66.67%，延伸占1.19%（圖5）。SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)有2種模型（圖6），且其相似度極高，第一個(gè)模型的GMQE值為0.11，無(wú)配位體；第二個(gè)模型的GMQE為0.12，無(wú)配位體。

圖5 SMPX蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖6 SMPX蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3在隆林山羊各組織表達(dá)譜分析 以GAPDH為內(nèi)參，qPCR檢測(cè)基因在隆林山羊不同組織中的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在心臟組織中表達(dá)水平最高，顯著高于心、脾、肺、腎、背肌、腿肌等組織，其次在背肌中表達(dá)量高，顯著高于心、脾、肺、腎、腿肌等組織的表達(dá)，在心、脾、肺、腎等組織中表達(dá)無(wú)顯著性，在腿肌中表達(dá)水平最低，顯著低于肝臟、脾、腎、背肌的表達(dá)（圖7）。

圖7 隆林山羊SMPX基因組織表達(dá)譜

3 討 論

近幾年，基因的研究領(lǐng)域主要在醫(yī)學(xué)方面，集中于人的聽力受損方面，在動(dòng)物相關(guān)方面的研究極少，僅在豬和牦牛肌肉發(fā)育有過(guò)研究，且作用機(jī)制不明確?；蜃钤绨l(fā)現(xiàn)于人類基因組，發(fā)現(xiàn)在心臟和骨骼肌中表達(dá)量較高，與肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。Beatriz等的研究表明，在人體中，基因可被肌肉調(diào)節(jié)因子調(diào)控，進(jìn)而影響肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，基因在豬的心肌和骨骼肌中表達(dá)量較高，其他組織不表達(dá)或表達(dá)量低，推測(cè)基因參與豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育。有研究報(bào)道，在不同時(shí)期豬背肌的表達(dá)量不同，在大白豬胚胎期60 d比胚胎期30 d、成年期大白豬表達(dá)量高14倍，與豬肌纖維的發(fā)育規(guī)律基本一致，說(shuō)明基因參與大白豬肌纖維的胚胎發(fā)育。Eftest?l的研究結(jié)果揭示，在成年小鼠骨骼肌中過(guò)表達(dá)，小鼠骨骼肌纖維類型分布和橫截面積上沒(méi)有發(fā)生明顯改變，推測(cè)在調(diào)節(jié)肌肉表型方面的作用尚不清楚。

本研究通過(guò)克隆隆林山羊基因，對(duì)基因CDS進(jìn)行生物信息學(xué)分析，其基因CDS區(qū)長(zhǎng)254 bp，編碼255個(gè)氨基酸，由4種氨基酸組成。根據(jù)編碼區(qū)序列比對(duì)分析結(jié)果可知，隆林山羊與山羊基因的同源性最高（100%），與雞的同源性最低（75.7%）。根據(jù)理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可知，隆林山羊基因無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，具有信號(hào)肽，是分泌型蛋白，具有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)；二級(jí)結(jié)構(gòu)中-螺旋結(jié)構(gòu)占28.57%，轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占3.57%，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占66.67%，延伸占1.19%。實(shí)時(shí)熒光定量qPCR檢測(cè)基因在不同組織中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在心臟和骨骼肌表達(dá)量較高，這與Patzak和官紅平的研究結(jié)果一致，基因在心肌和骨骼肌中優(yōu)先表達(dá)，故推測(cè)基因參與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育，此推測(cè)與鄧瑞強(qiáng)對(duì)豬的肌肉生長(zhǎng)發(fā)育研究相符。隆林山羊?qū)儆诘胤狡贩N，其產(chǎn)肉性能與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育存在緊密聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與背肌含量的表達(dá)存在一定聯(lián)系，下一步可擴(kuò)大數(shù)據(jù)樣本進(jìn)行進(jìn)一步研究，該結(jié)果為研究肌肉生長(zhǎng)發(fā)育提供了新思路。同時(shí)關(guān)于在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制不清楚，需要進(jìn)一步探討驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究以隆林山羊背肌cDNA為模板，成功克隆了隆林山羊的編碼區(qū)，CDS序列長(zhǎng)254 bp，編碼255個(gè)氨基酸。軟件預(yù)測(cè)分析表明無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，具有信號(hào)肽，有11個(gè)磷酸化位點(diǎn)，亞細(xì)胞定位主要分布于細(xì)胞質(zhì)。組織表達(dá)譜分析表明，在隆林山羊肝臟和背肌中表達(dá)最高，在各組織中均有表達(dá)，故推測(cè)在不同組織中發(fā)揮作用。