邢萍萍，嚴(yán)冠豪，譚寶華，喬佳鑫，王珊珊，洪林君，鄭恩琴，黃思秀，顧 婷

（國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心&華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，廣東廣州 510642）

印記基因（Imprinted Gene）是一類在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的具有特殊表達(dá)模式的基因，其等位基因的表達(dá)依賴于親本來源。目前在各物種中已發(fā)現(xiàn)超200個(gè)印記基因，主要在大腦發(fā)育、胚胎、胎盤和新生兒的生長發(fā)育中有重要作用?；谟H本沖突假說（Parental Conflict Hypothesis），不同親本表達(dá)的印記基因具有不同的生理功能。是從大鼠胎腦cDNA文庫中分離的由父本等位基因表達(dá)的印記基因，有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本：編碼81個(gè)氨基酸的和編碼54個(gè)氨基酸的?；蛟诙喾N組織中表達(dá)，例如腦、胰腺、垂體、下丘腦，與產(chǎn)前大腦發(fā)育和胎兒生長密切相關(guān)。已有研究表明，在胰腺細(xì)胞處于高濃度葡萄糖狀態(tài)下，基因表達(dá)上升。在敲除的小鼠模型中，胰島素分泌受損，導(dǎo)致營養(yǎng)過剩時(shí)葡萄糖加工能力下降。以上研究表明，的表達(dá)與葡萄糖穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，但其分子機(jī)制并不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在探索和在豬胎盤細(xì)胞系中的功能，為進(jìn)一步研究基因轉(zhuǎn)錄本在豬胎盤中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 質(zhì)粒pcDNA3.1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，pTr2細(xì)胞由中國科學(xué)院印遇龍?jiān)菏繄F(tuán)隊(duì)惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑 DH5（貨號(hào)：18265017）、DPBS緩沖液（貨號(hào)：C14190500BT）、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒（貨號(hào)：L3000001）、葡萄糖檢測試劑盒（貨號(hào)：E1011）、RT-PCR試劑盒（貨號(hào)：A25742）購自賽默飛公司；DMEM培養(yǎng)基（貨號(hào)：C11995500BT）、Opti-MEM試劑（貨號(hào)：31985062）、胰蛋白酶（貨號(hào)：25200）、青霉素和鏈霉素（貨號(hào)：15140122）購自GIBCO公司；胎牛血清（貨號(hào)：SE200-ES）購自Vistech公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（貨號(hào)：D3396-02）、RNA抽提試劑盒（貨號(hào)：R6934-02）購自O(shè)MEGA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：RR037A）、T4 DNA連接酶試劑盒（貨號(hào)：2011A）購自TaKaRa公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)豬、、基因的DNA序列以及基因的cDNA序列（AY 550069），用Oligo7軟件設(shè)計(jì)定量PCR引物。所有目的基因的引物均是跨外顯子設(shè)計(jì)，引物序列信息見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 熒光定量RT-PCR引物序列信息

1.3.2 豬和基因真核表達(dá)載體構(gòu)建從杜洛克豬胎盤組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以胎盤cDNA為模板進(jìn)行溫度梯度PCR，取和的最適退火溫度，以杜洛克cDNA為模板擴(kuò)增這2段序列。通過瓊脂糖凝膠回收擴(kuò)增的目的基因片段，純化產(chǎn)物，使用I、III分別對PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物用DH5感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑單克隆菌落震蕩培養(yǎng)2 h，取適量菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3.3 質(zhì)粒提取 將鑒定正確的含重組質(zhì)粒的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，用LB培養(yǎng)基加入氨芐抗生素于搖床上震蕩培養(yǎng)15 h后，使用OMEGA公司去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒Endo-Free Plasmid Mini Kit II進(jìn)行質(zhì)粒抽提。

1.3.4 pTr2細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 豬胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞（pTr2）在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中貼壁生長，培養(yǎng)環(huán)境為5% CO，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。

當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine3000試劑盒說明（每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)），將pcDNA3.1-、pcDNA3.1-真核表達(dá)載體和pcDNA3.1空白質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑Lipo3000按試劑使用說明混合，加入50 μL無血清和抗生素的opti-DMEM培養(yǎng)基中，混勻后靜置15 min之后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞在補(bǔ)充有10%FBS和重組人胰島素的不完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～8 h。

1.3.5 葡萄糖濃度測定 在細(xì)胞轉(zhuǎn)染0、8、12、24、48、72 h后收集細(xì)胞，使用葡萄糖測定試劑盒（E1011，Thermo Fisher）裂解細(xì)胞，按照說明書先加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，后加工作液。將待測樣品進(jìn)行5倍、10倍的稀釋，防止樣品濃度超出線性范圍。37℃ 20 min，反應(yīng)平衡后顏色在60 min內(nèi)穩(wěn)定，使用酶標(biāo)儀（Synergy HI,Biotek）在550 nm的波長下測量pTr2細(xì)胞裂解物的葡萄糖濃度及標(biāo)準(zhǔn)曲線。細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量根據(jù)細(xì)胞數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3.6 pTr2細(xì)胞內(nèi)RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄 將轉(zhuǎn)染24、48、72 h后的pTr2細(xì)胞用胰酶消化下來，收集到2 mL離心管中，在無菌超凈臺(tái)上按照RNA抽提試劑盒說明書抽提細(xì)胞內(nèi)總RNA。

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，全程在冰上操作。首先是去除基因組DNA反應(yīng)，5×gDNA Eraser Buffer，2 μL；gDNA Eraser，1.0 μL；總RNA 1 μg；補(bǔ)充RNase Free dHO至總體積10 μL，反應(yīng)條件：42℃，2 min；4℃，5 min。其次是反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，Prime Script RT Enzyme Mix 10.0 μL；RT Primer Mix，1.0 μL；5×Prime Script Buffer，4 μL；RNase Free HO，4.0 μL，反應(yīng)條件是：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃，5 min。檢測cDNA濃度并保存在-20℃。

1.3.7 RT-PCR檢測關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平 使用RT-PCR檢測過表達(dá)和后細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，以細(xì)胞內(nèi)cDNA為模板，引物為表1。定量PCR擴(kuò)增總體系為10 μL：SYBR Green I Realtime PCR Master Mix 5 μL，F(xiàn)orword Primer（10 μmol/L）0.4 μL，Reverse primer（10 μmol/L）0.4 μL，cDNA模 板1 μL，ddHO 3.2 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性60 s，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，83℃讀板45 s；循環(huán)40次。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 本實(shí)驗(yàn)涉及的所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。每種處理具有3次生物學(xué)重復(fù)。使用GraphPad Prism 7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用檢驗(yàn)的方法計(jì)算數(shù)據(jù)的顯著差異性。＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1基因的序列保守性分析 由于基因功能在小鼠上已有報(bào)道研究，為了探究豬基因功能，首先分析了豬與小鼠、人基因的保守性。從Ensemble數(shù)據(jù)庫下載豬（XM_005672916.3）、（XM_021077318.1）、人（NM_005386.4）、（NM_181689.3）、鼠（NM_010923.3）、（NM_180960.3）、大鼠、牛、猴、猩猩、馬和狗的核苷酸序列，利用EBI的多序列比對軟件Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行多序列比對分析。圖1為9個(gè)物種核苷酸編碼序列的比對結(jié)果，在豬、鼠、人、牛、猴、猩猩、大鼠、馬和狗中，豬和與鼠的核苷酸同源性為91.53%～95.11%，和牛的核苷酸同源性為90.69%～93.11%，和人、猩猩、大鼠、猴、馬和狗的核苷酸同源性在80.73%～90.96%，比鼠、牛的低，說明豬的基因核苷酸序列與鼠、牛相似度較高。

圖1 不同物種NNAT基因的核苷酸序列比對結(jié)果

2.2基因的進(jìn)化樹 為研究和在不同物種中的進(jìn)化關(guān)系，利用MEG7軟件，以豬、人、小鼠、猴、猩猩、大鼠、馬和狗的基因的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人和猩猩聚為一支，小鼠和猴子聚為一支，豬和牛、馬聚為一支，豬和牛在進(jìn)化上更近，這8個(gè)物種與豬聚為一大支，最后與豬的聚為一支（圖2）。結(jié)果表明，豬與牛在進(jìn)化上更近。

圖2 NNAT基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 引物最佳的退火溫度 為找到和引物的最佳退火溫度，設(shè)置引物梯度PCR體系，體系中使用生工生物工程（上海）股份有限公司合成的和引物，并且以杜洛克豬的cDNA為模板，進(jìn)行溫度梯度PCR。溫度梯度分別為 55℃、57.5℃、59℃、60.5℃、62℃、63.5℃、64℃、65℃。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)下（Tanon 1600）可以看到的引物在60.5℃中基因條帶最亮，的引物在59℃、64℃中基因條帶較亮（圖3），因此引物的最佳退火溫度是60.5℃，引物的最佳退火溫度為59℃、64℃。

圖3 NNAT-α和NNAT-β的最適退火溫度

2.4 菌液PCR檢測篩選陽性菌液結(jié)果 以經(jīng)過酶切、連接、轉(zhuǎn)化后得到的具有抗性基因的菌液為模板進(jìn)行PCR，篩選陽性克隆，將含有亮帶、符合長度和條帶單一的菌液送到測序公司進(jìn)行測序，圖中1、2、5、6各取200 μL進(jìn)行測序（圖4）。

圖4 NNAT-α和NNAT-β菌液PCR結(jié)果

2.5 真核表達(dá)載體結(jié)果檢測 測序結(jié)果與與的CDs序列通過在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST數(shù)據(jù)比對，結(jié)果顯示序列完全正確（圖5），證明和基因片段成功插入pcDNA-3.1表達(dá)載體中。

圖5 NNAT-α和NNAT-β 的真核表達(dá)載體序列比對結(jié)果

2.6 RT-PCR檢測與轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染與至pTr2細(xì)胞后的RT-PCR結(jié)果見圖6，與的表達(dá)量極顯著高于pcDNA3.1空質(zhì)粒對照組，結(jié)果表明與真核表達(dá)載體在pTr2細(xì)胞內(nèi)有良好的過表達(dá)效果，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 NNAT-α和NNAT-β在pTr2細(xì)胞內(nèi)的過表達(dá)效率

2.7 不同轉(zhuǎn)染時(shí)間和對細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度的影響 本文通過檢測pTr2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量的變化來驗(yàn)證和的功能，結(jié)果顯示（圖7），與對照組pcDNA3.1相比，在pTr2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)12 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖含量有明顯增加（＜0.05）,在48～72 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量增加并保持穩(wěn)定（＜0.001）。在pTr2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)12 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量增加（＜0.05）,在24、48、72 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量穩(wěn)定增加（＜0.01）。和在pTr2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)均可增加細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度，但是對細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的作用不完全一致。

圖7 不同轉(zhuǎn)染時(shí)間、不同處理的pTr2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量的變化

2.8和基因的過表達(dá)影響基因和PI3K-AKT通路基因的表達(dá) RT-PCR檢測和基因在pTr2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)48 h后，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和PI3K-AKT信號(hào)通路基因的變化。結(jié)果顯示（圖8），過表達(dá)48 h后，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄水平明顯增加（＜0.01），轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比差異極顯著。過表達(dá)后，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄水平明顯增加（＜0.05），基因轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比差異極顯著，但基因表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明，過表達(dá)和能夠促進(jìn)pTr2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和PI3K-AKT信號(hào)通路基因的表達(dá)。

圖8 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因GLUT和PI3K-AKT通路基因的相對表達(dá)量

3 討 論

印記基因影響胎盤的發(fā)育和營養(yǎng)代謝，基因在胎盤營養(yǎng)運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用，從序列分析看，基因序列在小鼠和人之間的保守性較高，與小鼠有91.53%～95.11%%的相似性，與人有84.62%～86.43%的相似性。從系統(tǒng)發(fā)育樹上看，基因是從豬和牛的祖先基因進(jìn)化而來，并且在不同的物種中發(fā)揮不同的生理作用。本研究將豬的mRNA序列與鼠的mRNA序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，核苷酸序列在豬和鼠之間的保守性（95.11%）高于豬和人的保守性（86.43%）。系統(tǒng)發(fā)育樹上顯示豬和牛優(yōu)先聚為一類，然后和鼠聚為一類，最后和人聚在一起，可知基因在物種間的保守性更高。

表達(dá)載體構(gòu)建是一項(xiàng)較為成熟的基因工程技術(shù)，選擇適合的質(zhì)粒作為載體，將獲得的目的基因片段與載體相連，并轉(zhuǎn)化入細(xì)胞以達(dá)到目的基因過表達(dá)的目的。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了豬2個(gè)轉(zhuǎn)錄本的真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究和在豬胎盤發(fā)育過程中的作用及機(jī)制提供技術(shù)支持。

已有研究表明，在豬胎盤中有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本，有3個(gè)外顯子，而缺乏第二個(gè)外顯子，由81個(gè)堿基對組成。但2個(gè)轉(zhuǎn)錄本在很多細(xì)胞都可以合成和分泌，揭示其具有多種功能。同時(shí)，根據(jù)不同物種間的同源性比對數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)豬和基因與鼠、人的同源性都很高，因此在小鼠模型上研究和的功能具有重要參考價(jià)值。在3T3-L1細(xì)胞的研究中，通過增加細(xì)胞內(nèi)的成脂轉(zhuǎn)錄因子，ZDF大鼠的脂肪細(xì)胞中顯著增加，并且增強(qiáng)的脂肪細(xì)胞異位表達(dá)。在慢性高血糖條件下，鼠胰腺細(xì)胞中與的比例增加，這通過抑制蛋白酶體功能而增加了高血糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，降低了對正常胰腺細(xì)胞功能重要基因的表達(dá)，例如胰島素和葡萄糖激酶（GCK）?；谝陨涎芯?，2個(gè)轉(zhuǎn)錄本在調(diào)節(jié)葡萄糖運(yùn)輸中的可能作用令人感興趣。本研究表明，到的過表達(dá)在pTr2細(xì)胞中促進(jìn)了細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，并且可能通過PI3K-AKT途徑調(diào)節(jié)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。

印記基因大部分調(diào)控胎兒和胎盤的發(fā)育，胎兒生長發(fā)育的主要能量來源是葡萄糖，占胎兒發(fā)育所需能量底物的35%～40%。胎兒葡萄糖的吸收和利用取決于胎盤的葡萄糖轉(zhuǎn)化效率，因此胎盤上表達(dá)的基因在胎兒的生長發(fā)育過程中具有重要作用。研究表明，在豬卵母細(xì)胞中注入抗抗體，的表達(dá)受到抑制，干擾了細(xì)胞葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量。此外，通過激活PI3K-AKT2信號(hào)通路來調(diào)節(jié)GLUT1的表達(dá)，這與本文的研究結(jié)果一致，pTr2細(xì)胞的RT-PCR結(jié)果表明，當(dāng)與在pTr2細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)，PI3K-AKT途徑中的基因和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（）均被上調(diào)，表明和可以通過PI3K-AKT通路調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。

在畜牧業(yè)中，母豬產(chǎn)仔數(shù)、仔豬初生重是豬場生產(chǎn)效益的重要指標(biāo)，印記基因在胎盤發(fā)育和營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，保證胎兒的正常生長與發(fā)育。因此，研究分析基因?qū)τ谔ケP發(fā)育過程中的作用機(jī)制對于提高母豬繁殖力和生產(chǎn)效益有一定意義。但是，目前對于豬的研究較少，需要對此基因進(jìn)行更深的挖掘和功能驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用真核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了豬源的和，在pTr2細(xì) 胞中轉(zhuǎn) 染與真核表達(dá)載體后，細(xì)胞內(nèi)可成功過表達(dá)，并顯示和調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，提高了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因和PI3K-AKT基因的mRNA表達(dá)量。了解和的調(diào)控機(jī)制為下一步探索基因在豬胎盤上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能以及該基因在人妊娠過程母嬰間葡萄糖運(yùn)輸中的作用機(jī)制提供理論參考。