付開斌，陳 祥*，周志楠，張 艷，惠茂茂，洪 磊

（1.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

硒是動物機體所必需的微量元素，可以整合到氨基酸序列中形成相應(yīng)的硒蛋白并發(fā)揮其生物學(xué)功能。谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPx）家族是最早發(fā)現(xiàn)的硒蛋白，現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)的GPx家族成員有8位。谷胱甘肽過氧化物酶3（Glutathione Peroxidase 3，）也被稱作血漿GPx，它是含硒谷胱甘肽過氧化物酶家族中具有前導(dǎo)序列、能分泌到細胞外間隙的糖基化蛋白。研究表明，適宜濃度的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是維持細胞正常生命活動所必需的條件之一，ROS的過量則會造成生物膜的過氧化損傷、DNA鏈斷裂和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，引起細胞代謝途徑紊亂，進而導(dǎo)致細胞壞死、凋亡；GPx3是主要的抗氧化酶之一，它可以利用過氧化氫、脂肪酸氫過氧化物等底物，以實現(xiàn)機體內(nèi)ROS的動態(tài)平衡，其主要來源于腎臟，由近端腎小管上皮細胞和鮑曼囊壁層上皮細胞產(chǎn)生并釋放到血液中。同時，也表達于附睪并參與成熟精子免受活性氧損傷，催化降解精子在成熟過程中所接觸到的過氧化物。在雌性動物生殖上，可以清除卵泡發(fā)育過程中產(chǎn)生的活性氧和母體胎盤硒轉(zhuǎn)移以及參與胎兒發(fā)育和生產(chǎn)。Xu等研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜重塑（去蘇醒）后的氧化應(yīng)激過程中，是一種必不可少的酶，可有效降低子宮內(nèi)膜中的HO含量來為著床做好準(zhǔn)備。還可以防止健康卵泡生長過程中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡，其活性的降低會引起ROS代謝損傷，導(dǎo)致血小板高反應(yīng)性的發(fā)生和形成血栓的風(fēng)險增加。綜上，的抗氧化功能不僅與機體的疾病健康有關(guān)，還影響著動物的生殖調(diào)控。

黔北麻羊是貴州省三大優(yōu)良地方山羊品種之一，具有適應(yīng)性強、產(chǎn)肉性能良好、肉鮮美可口、蛋白質(zhì)含量高等優(yōu)點，深受廣大消費者的喜愛，具有重要的經(jīng)濟價值和發(fā)展?jié)摿?，但繁殖力始終是制約黔北麻羊快速發(fā)展的重要因素之一。因此，本研究對黔北麻羊基因的CDS區(qū)進行克隆和生物信息學(xué)分析，并探究GPx3在單、多羔黔北麻羊不同性腺組織中的表達差異，以期為提高黔北麻羊的繁殖性能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗的黔北麻羊均來自貴州省習(xí)水縣，選取健康、成年且處于相同飼養(yǎng)環(huán)境下的產(chǎn)單、多羔的黔北麻羊各6只。按照貴州省地方標(biāo)準(zhǔn)《羊屠宰操作規(guī)程》（DB22/T 2740—2017）進行屠宰，屠宰后立即采集黔北麻羊的下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢5個組織，對組織樣進行處理并標(biāo)記后放入液氮中冷凍保存，帶回實驗室后，立即轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗試劑及儀器 FirstStrand cDNA Synthesis、2×Taq MasterMix均購自貴州艾瑞特生物有限公司；TRIzol RNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自康為世紀生物科技有限公司；DNA Marker 2000、pMD-19T克隆載體均購自大連寶生物工程有限公司；LB Broth培養(yǎng)基購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；PCR擴增儀（C1000 Touch）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood II）及電泳儀（DYY-2C型）均購自美國BIORAD公司；37℃恒溫搖床、超微量紫外分光光度計（μL trospec 2100 pro）購自安瑪西亞中國有限公司；實時熒光定量PCR儀（CFX96 Real-Time System）購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的山羊基因（XM_005683183.3）的mRNA序列設(shè)計CDS區(qū)擴增引物，使用Premier 5.0軟件設(shè)計熒光定量引物，以-actin作為qRT-PCR內(nèi)參基因。引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列信息詳見表1。

表1 引物信息

1.4 總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成 使用TRIzol法提取單、多羔黔北麻羊的下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢組織的總RNA，使用超微量分光光度計測定RNA的濃度與純度值。RNA于-80℃冰箱保存。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，對黔北麻羊組織樣品中的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為20 μL：RNA模板（ng/μL）9 μL、Oligo（dT）18 Primer 1 μL，RI 1 μL、RT 1 μL，dNTP Mix 2 μL，Buffer 4 μL，Nuclease-free Water 1 μL，Random 1 μL。反應(yīng)條件為42℃孵育60 min，70℃孵育5 min。結(jié)束后在超微量紫外分光光度計下進行濃度和純度檢測。cDNA產(chǎn)物于-20℃冰箱保存。

1.5 實時熒光定量PCR及數(shù)據(jù)分析 以-actin為內(nèi)參基因，對所采集的單、多羔黔北麻羊的5種不同組織的基因mRNA進行熒光定量PCR檢測。反應(yīng)體系為10 μL：2×UltraSYBR Mixture 5 μL，Primer Sense（10 pmol/μL）0.5 μL，Primer Anti-sense（10 pmol/μL）0.5 μL，cDNA（ng/μL）0.8 μL，ddHO 3.2 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60.4℃ 30 s，72℃ 3 min，循 環(huán)40次后進行溶解曲線分析，以每5 s上升0.5℃的速率從65℃上升到95℃，實驗的每個樣品檢測做3個重復(fù)，取平均值。采用2法分析基因在單、多羔黔北麻羊5個不同性腺組織中的相對表達量，使用SPSS Statistics軟件對2相對定量法所得數(shù)據(jù)進行分析，分別以＜0.05和＜0.01為差異顯著和極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 黔北麻羊基因CDS區(qū)的擴增 以cDNA為模板，PCR擴增黔北麻羊基因的CDS區(qū)。擴增體系為20 μL：2× Es Taq MasterMix 10 μL，上下游引物各（10 pmol/μL）1 μL，ddHO 6 μL，cDNA（ng/μL）2 μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃終延伸7 min，4℃保存。

1.7 黔北麻羊基因的T克隆 將經(jīng)凝膠電泳檢測的PCR擴增產(chǎn)物按膠回收試劑盒說明書進行回收，使用超微量分光光度計對回收產(chǎn)物進行濃度和純度檢測，并與pMD-19T載體進行連接反應(yīng)（金屬浴16℃，12～16 h）。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli TOP10感受態(tài)細胞中。均勻涂布至LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）上并于37℃恒溫箱培養(yǎng)12～16 h。挑取固體培養(yǎng)基上的白斑于含氨芐青霉素和LB液體培養(yǎng)液的10 mL離心管中進行搖菌（37℃，200 r/min，12～16 h）。待菌液渾濁后即進行菌液PCR，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，篩選與目的片段一致的菌液送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.8 黔北麻羊基因的生物信息學(xué)分析 將測序結(jié)果用DNAStar軟件與NCBI數(shù)據(jù)庫中山羊的CDS區(qū)序列進行比對，在比對正確后利用MegAlign軟件對黔北麻羊GPx3的CDS區(qū)進行同源性分析；分別使用在線網(wǎng)站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）、ProtScal（https://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)疏水性；分別使用SOPMA（http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive/EHVM5c/models/）預(yù)測蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)；利用PSORT II Preadict（https://psort.hgc.jp/form2.html）進行亞細胞定位分析；使用SignalP 4.1 Sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1）進行氨基酸信號肽預(yù)測；MEGA 6.0和MegAlign軟件構(gòu)建不同物種中的系統(tǒng)進化樹和同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1基因在單、多羔黔北麻羊不同性腺組織中的表達分析基因在單、多羔黔北麻羊的不同性腺組織中均有表達，結(jié)果如圖1所示。組內(nèi)分析可知基因在黔北麻羊單羔組5個不同組織中的表達趨勢由高到低依次為：卵巢＞下丘腦＞子宮＞輸卵管＞垂體；在多羔組中表達量由高到低依次為：卵巢＞垂體＞輸卵管＞子宮＞下丘腦。通過組間比較分析得出，黔北麻羊基因在多羔組中的卵巢、垂體、輸卵管和子宮的表達量極顯著高于單羔組，但在下丘腦中未達到差異顯著水平。

圖1 GPx3基因在黔北麻羊單、多羔不同性腺組織中的相對表達量

2.2 黔北麻羊基因的PCR擴增 由圖2可知，基因熒光定量引物的擴增條帶為262 bp（圖2A）；CDS區(qū)克隆引物擴增條帶為681 bp（圖2B）。片段大小與預(yù)測結(jié)果一致，條帶清晰明亮、單一，無二聚體等非特異性片段擴增，結(jié)果可用于下一步實驗。

圖2 GPx3瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

2.3 黔北麻羊基因的T克隆載體測序鑒定 黔北麻羊基因克隆結(jié)果使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，目的條帶清晰明亮，與目的片段大小一致（圖3）。菌液測序驗證結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中山羊CDS區(qū)序列比對吻合度為99.85%（圖4）。第611位 的堿基由A突變?yōu)門，屬于同義突變，所編碼的氨基酸不變，皆為甘氨酸。菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳及測序結(jié)果皆顯示基因CDS區(qū)序列已成功克隆至pMD-19T載體中，表明pMD-19T-GPx3克隆載體構(gòu)建成功。

圖3 GPx3基因菌液PCR檢測結(jié)果

圖4 黔北麻羊GPx3基因部分克隆序列與NCBI上傳序列比對結(jié)果

2.4 黔北麻羊基因生物信息學(xué)分析

2.4.1 黔北麻羊GPx3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 黔北麻羊基因編碼區(qū)大小為681 bp，共編碼225個氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)分子式為CHNOS，原子總數(shù)3 573，相對分子質(zhì)量25 392.24，理論等電點7.63，在哺乳動物機體內(nèi)的估計半衰期為30 h。該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)為50.47，屬于不穩(wěn)定蛋白，由20種氨基酸構(gòu)成，其中亮氨酸含量最高，占總氨基酸數(shù)的11.1%，色氨酸和組氨酸含量最低，占氨基酸總數(shù)的1.3%。帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為25，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為26，提示黔北麻羊GPx3蛋白的氨基酸序列帶正電。由ProtScale分析可知，橫坐標(biāo)代表GPx3蛋白質(zhì)的氨基酸位置，縱坐標(biāo)代表GPx3蛋白質(zhì)的疏水分值，得分低于0為親水性蛋白質(zhì)，得分高于0是疏水性蛋白質(zhì)。GPx3蛋白親水性最強的是第109位上的谷氨酸（-2.689），疏水性最強的是第15位上的絲氨酸（2.567），肽鏈上的疏水性氨基酸少于親水性氨基酸，提示整條肽鏈表現(xiàn)為親水性（圖5）。

圖5 GPx3蛋白疏水性圖譜

2.4.2 黔北麻羊GPx3蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)分析與預(yù)測 由SOMPA在線軟件結(jié)果顯示，黔北麻羊GPx3蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)由-螺旋（29.78%）、-轉(zhuǎn)角（8%）、延伸鏈（17.33%）以及無規(guī)則卷曲（44.89%）構(gòu)成，可見GPx3蛋白質(zhì)主要由無規(guī)則卷曲和-螺旋構(gòu)成（圖6）。GPx3蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致（圖7）。

圖6 黔北麻羊GPx3蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

圖7 GPx3蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4.3 黔北麻羊GPx3蛋白質(zhì)亞細胞定位分析與信號肽預(yù)測 運用PSORT II Preadict對黔北麻羊GPx3蛋白質(zhì)亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，GPx3蛋白質(zhì)主要定位在細胞外（66.7%），包括細胞壁；其次為空泡（22.2%）；最低是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（11.1%）。使用SignalP 4.1預(yù)測氨基酸序列中的信號肽及其剪切位點，結(jié)果由圖8所示，黔北麻羊基因編碼的氨基酸序列中具有信號肽，信號肽平均值大于0.5，表明GPx3蛋白屬于分泌蛋白；GPx3蛋白可能的剪切位點位于第24位和第25位氨基酸之間，表明成熟肽始于第24位氨基酸。

圖8 黔北麻羊GPx3基因編碼氨基酸信號肽分析

2.4.4 GPx3氨基酸同源性分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建MegAlign進行氨基酸同源性分析，結(jié)果顯示所克隆的黔北麻羊基因CDS區(qū)序列與綿羊、牛、豬、馬、犬、小鼠、人、兔、雞的同源性分別為99.6%、98.2%、88.4%、90.7%、92.0%、86.2%、86.7%、88.4%、68.8%（圖9）。MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果表明黔北麻羊基因編碼的氨基酸序列與綿羊的遺傳距離最近，其次是牛，遺傳距離最遠的是雞，符合物種進化的規(guī)律（圖10）。

圖9 黔北麻羊GPx3基因編碼區(qū)同源性分析

圖10 黔北麻羊GPx3基因編碼區(qū)遺傳進化樹

3 討 論

是動物機體重要的抗氧化物質(zhì)，不僅在維持機體內(nèi)ROS的動態(tài)平衡具有顯著的作用，且在動物生殖調(diào)控方面也具有重要意義。有大量研究表明，基因與人類的正常妊娠和分娩以及母嬰硒轉(zhuǎn)運機制有關(guān)，且它可以影響子癇前期和妊娠高血壓綜合征的發(fā)生。熊賢榮等研究顯示在牦牛卵母細胞體外成熟過程中，硒可顯著提高卵母細胞谷胱甘肽過氧化物酶的活性及其家族基因的表達，進而提高卵丘細胞DNA完整性以及卵母細胞減數(shù)分裂和發(fā)育能力。同時，姚曉蕾等也報道了硒對母畜相關(guān)生殖激素的合成具有積極作用。故本實驗以黔北麻羊為研究對象，運用qRT-PCR方法，對產(chǎn)單、多羔黔北麻羊的5個不同性腺組織基因的表達水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)基因在產(chǎn)單、多羔黔北麻羊的下丘腦、垂體、子宮、輸卵管以及卵巢均有表達，與基因在日本沼蝦各組織均有表達的結(jié)果一致。Tao等研究發(fā)現(xiàn)，在刀額新對蝦的卵巢快速發(fā)育時期GPx的表達量呈現(xiàn)上升趨勢。本研究結(jié)果顯示在黔北麻羊多羔組中基因在卵巢的表達量極顯著高于所有組織，單羔組卵巢的表達量也極顯著高于垂體和輸卵管，顯著高于子宮。這提示基因的表達對卵巢的發(fā)育具有重要作用，推測可能是在卵巢發(fā)育時會產(chǎn)生大量ROS，因此表達量上升以保護卵巢免受氧化傷害，但具體原因及作用機理有待進一步研究。此外，基因在產(chǎn)單、多羔黔北麻羊的子宮中均有表達，這與許袖以小鼠為研究對象的研究結(jié)果相反，即在小鼠的子宮內(nèi)膜中，mRNA在妊娠期的前4天沒有表達，第5天才出現(xiàn)特異性表達，且在假孕和延遲著床的子宮中沒有表達，推測這可能是不同物種之間存在差異的結(jié)果。基因在產(chǎn)多羔黔北麻羊的垂體、子宮、輸卵管和卵巢的表達量極顯著高于產(chǎn)單羔的黔北麻羊，下丘腦未達到顯著水平，提示基因可能參與黔北麻羊產(chǎn)羔性狀的調(diào)控，其具體作用機制有待進一步研究。

本研究以黔北麻羊的卵巢、輸卵管和下丘腦組織cDNA為模板，成功克隆了基因的CDS區(qū)，與NCBI上傳數(shù)據(jù)庫中山羊的編碼區(qū)序列進行對比，同源性達99.85%，堿基由A突變?yōu)門，屬于同義突變，所編碼的氨基酸不變，表明黔北麻羊基因所編碼蛋白質(zhì)的功能不發(fā)生改變?；蚬簿幋a225個氨基酸，理論等電點（7.63）與李蒙等在三疣梭子蟹（7.98）的研究結(jié)果差距較小，推測可能是不同物種之間存在差異。GPx3蛋白是疏水性蛋白質(zhì)，且該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為50.47，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)對其發(fā)揮生物學(xué)功能起著決定性作用。本研究發(fā)現(xiàn)黔北麻羊GPx3蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)分析一致，均主要是由無規(guī)則卷曲和-螺旋構(gòu)成，這與郭笑對人體GPx3蛋白質(zhì)的預(yù)測結(jié)果相符。對GPx3蛋白進行亞細胞定位和信號肽分析，程雪艷等研究發(fā)現(xiàn)GPx3蛋白主要定位于細胞外，屬于分泌蛋白，與本實驗的結(jié)果一致；SignalP4.1預(yù)測結(jié)果顯示GPx3蛋白具有信號肽，與前人的研究結(jié)果相同，說明GPx3蛋白在跨膜蛋白運輸中起著信號識別的作用。GPx3蛋白的剪切位點位于第24位和第25位氨基酸之間，提示其成熟肽始于第24位氨基酸。經(jīng)同源性分析發(fā)現(xiàn)，黔北麻羊基因編碼區(qū)的序列與綿羊同源性最高（99.6%），其次是牛（98.2%），最低的是雞（68.8%），表明基因的CDS區(qū)序列在哺乳動物中具有較高的保守性和種屬特異性，這符合物種進化的規(guī)律，結(jié)果與唐蕾等的研究結(jié)果相同。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了黔北麻羊基因的CDS區(qū)序列，分析發(fā)現(xiàn)GPx3蛋白是一種具有信號肽的不穩(wěn)定的親水性分泌蛋白質(zhì)，二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和-螺旋構(gòu)成。qRT-PCR顯示基因在產(chǎn)單、多羔黔北麻羊的5個不同性腺組織中均有表達，且存在組織表達特異性；在多羔組中的表達量皆高于單羔組，提示基因可能對黔北麻羊的產(chǎn)羔性狀具有正向調(diào)控作用。