王 宇，譚福燕，張利萍，何玉豐，范建輝，李 旺，彭柿杰，邱慶華

（1.攀枝花學(xué)院 附屬醫(yī)院，四川 攀枝花 617000；2.攀枝花學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，四川 攀枝花 617000；3.攀枝花學(xué)院 康養(yǎng)學(xué)院，四川 攀枝花 617000）

黃精（Polygonatum sibiricum）是我國傳統(tǒng)中藥，為百合科黃精屬多年生草本植物，常呈圓柱狀，結(jié)節(jié)膨大，根莖可入藥［1］.最早關(guān)于黃精的記載來自《名醫(yī)別錄》：“性平、味甘，歸脾、肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎益精、滋陰潤燥的功能，用于滋補(bǔ)強(qiáng)身和肺虛燥咳及醫(yī)治腎虛精虧之證，久服輕身、延年、不饑［2］.”現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，黃精具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗抑郁，調(diào)節(jié)免疫和血糖，抑制骨質(zhì)疏松，改善睡眠等作用［3-5］.此外，黃精還有豐富的營養(yǎng)成分，可以作為一種食材.

黃精的主要有效成分為多糖、皂苷和黃酮，但核心的藥用功效還需進(jìn)一步驗(yàn)證［6］.目前，關(guān)于黃精的研究主要集中在藥理活性、化學(xué)成分、提取工藝和臨床應(yīng)用等方面，關(guān)于重要功能基因及轉(zhuǎn)錄組信息的研究卻很少，限制了黃精的深入開發(fā)及遺傳改良等后續(xù)工作的開展.目前，國內(nèi)外學(xué)者尚未對黃精的基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究，只是對黃精葉綠體基因組進(jìn)行了測序［7］.因此，本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析挖掘重要的代謝成分以及標(biāo)記基因，有利于為黃精藥性理論研究和優(yōu)良品種的選育奠定基礎(chǔ).

本實(shí)驗(yàn)利用高通量測序技術(shù)對黃精進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，得到關(guān)于多糖、皂苷、黃酮等多種代謝產(chǎn)物的分子數(shù)據(jù)，對功能注釋、分類和代謝通路進(jìn)行分析，找出黃精的藥用成分以及次生代謝相關(guān)的功能基因，為黃精遺傳育種和生命節(jié)律研究提供豐富的數(shù)據(jù)資源.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 植株由攀枝花市豐盛源農(nóng)林開發(fā)有限公司提供.

1.1.2主要儀器與試劑 凝膠成像系統(tǒng)和電泳儀購于美國伯樂公司，超微量核酸分析儀購于杭州奧盛儀器有限公司，RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和純化試劑盒購于天根生化科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1黃精RNA的提取 按照RNA 提取試劑盒說明提取黃精總RNA，使用凝膠電泳和超微量核酸分析儀對質(zhì)量和濃度進(jìn)行分析.

1.2.2文庫的構(gòu)建及測序 用磁珠富集poly（A）mRNA，隨后以mRNA 為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成第一鏈cDNA和第二鏈cDNA，隨后用純化試劑盒純化cDNA，將純化的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加尾和加接頭，構(gòu)建成cDNA 文庫，利用Illumina HiSeq 平臺測序.

1.2.3Unigene 序列的獲得和生物信息學(xué)分析對獲得的初始數(shù)據(jù)用軟件Cutadapt 去除接頭，采用組裝軟件Trinity 對樣品數(shù)據(jù)從頭組裝，組裝分析后得到Unigene序列，使用BLAST將獲得的Unigene序列與Nr、Swi-ssProt、GO、KEGG和COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，得到黃精基因的蛋白功能注釋和分類.

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析一共獲得原始數(shù)據(jù)4.37 G，經(jīng)處理后得到有效數(shù)據(jù)4.35 G（表1），146 072條Unigene，92 865 800 個堿基，Unigene 最大為8 827 bp，最小為201 bp，平均為635.75 bp.不同長度Unigene分布比例顯示（表2）：長度在200～500 bp的Unigene 占64.10%，長度≥2 000 bp 的占4.92%.

表1 黃精初始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.1 Initial data statistics of Polygonatum sibiricum

表2 Unigene 不同長度分布比例Tab.2 Distribution of Unigene different length

2.2 Unigenes 功能注釋將組裝得到的146 072條Unigene 序列與NR、Swiss-Prot、KOG、KEGG 數(shù)據(jù)庫比對，75 845 條Unigene 在NR 數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，占51.92%，；52 802 條在Swissprot 數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，占36.14%；41 239 條Unigene 在COG 數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，占28.23%；11 789 條在KEGG數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，占8.07%（表3）.

表3 Unigene功能注釋Tab.3 Unigene function annotated

2.3 NR 數(shù)據(jù)庫注釋與分類通過BLAST 與NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，結(jié)果如圖1 所示（1 雞血藤，2 指趾鳳凰，3 馬六甲，4 肩胛魚，5 蓮屬，6 葡萄，7 粳稻群體，8 滴蟲，9 木豆，10 甜橙）：在雞血藤和指趾鳳凰中獲得同源注釋的Unigene 數(shù)量最多，分別占29.90%和22.80%，在馬六甲、肩胛魚、蓮屬、葡萄中獲得同源注釋的Unigene 數(shù)量較多，分別占9.20%、5.80%、3.00%和1.90%，還有較少Unigene注釋到粳稻群體、滴蟲、木豆、甜橙中，分別占比0.90%、0.80%、0.69%和0.68%，其余24.33%注釋到其它物種中.

圖1 NR 庫中主要物種分布Fig.1 Main species distribution in NR

2.4 COG 數(shù)據(jù)庫注釋與分類將所有Unigene與COG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，預(yù)測基因功能并分類統(tǒng)計(jì)，見圖2（A：RNA 過程與修飾；B：染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和變化；C：能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化；D：細(xì)胞循環(huán)控制，細(xì)胞分裂及染色體參與；E：氨基酸運(yùn)輸和新陳代謝；F：核苷酸運(yùn)輸和新陳代謝；G：糖類運(yùn)輸和代謝；H：輔酶運(yùn)輸和代謝；I：脂類運(yùn)輸和代謝；J：翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成；K：轉(zhuǎn)錄；L：復(fù)制，重組和修補(bǔ)；M：細(xì)胞壁膜生物合成；N：細(xì)胞移動；O：翻譯后修飾蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶；P：無機(jī)離子運(yùn)輸和代謝；Q：次生代謝合成運(yùn)輸和代謝；R：一般功能預(yù)測；S：未知功能；T：信號傳導(dǎo)機(jī)制；U：細(xì)胞內(nèi)交通分泌及囊泡運(yùn)輸；V：防御機(jī)制；W：細(xì)胞外結(jié)構(gòu)；X：未知；Y：核結(jié)構(gòu)；Z：細(xì)胞骨架）.結(jié)果表明：46 414 條Unigene注釋到26 種COG 分類中，其中一般功能預(yù)測基因最多，為5 332 個，占11.5%；其次，涉及翻譯后修飾蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶的基因也較多，為5 100個，占11.0%；而涉及細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、核結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞移動的基因較少，分別占比0.04%、0.23%和0.49%.

圖2 COG 功能注釋分布Fig.2 The annotation distribution of COG’function

2.5 GO 注釋與分類36 724 條Unigenes 在GO分類中被注釋到生物進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能相關(guān)3 個類別52 個小組中（圖3）（1 代謝過程，2 細(xì)胞過程，3 單一生物過程，4 生物調(diào)節(jié)，5 對刺激的反應(yīng)，6 本土化；7 發(fā)展過程，8 多生物過程，9 生長、增長、發(fā)展、種植，10 免疫系統(tǒng)過程，11 細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生，12 有節(jié)奏的過程，13 生殖過程，14運(yùn)動，15 生物粘附，16 再生產(chǎn)，17 發(fā)信號，18 行為，19 生物學(xué)階段，20 多細(xì)胞生物過程，21 細(xì)胞殺傷，22 細(xì)胞部分，23 細(xì)胞器，24 膜，25 細(xì)胞器部分，26大分子復(fù)合物，27 膜部分，28 細(xì)胞外區(qū)域，29 膜封閉的管腔，30 細(xì)胞連接，31 類核，32 病毒部分，33細(xì)胞外區(qū)域部分，34 細(xì)胞外基質(zhì)成分，35 病毒，36其他生物部分，37 細(xì)胞外基質(zhì)，38 粘合物，39 催化活性，40 轉(zhuǎn)運(yùn)活動，41 結(jié)構(gòu)分子活動，42 電子載體活動，43 核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性，44 酶調(diào)節(jié)劑活性，45 抗氧化活性，46 分子換能器活動，47 脒-核苷酸交換因子活性，48 分子功能調(diào)節(jié)劑，49 蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性，50 營養(yǎng)庫活性，51 金屬伴侶活性，52 蛋白質(zhì)標(biāo)簽）.在生物進(jìn)程類別中，參與代謝過程（4 463 個）、細(xì)胞過程（3 763 個）和單一生物過程（1 945 個）的基因數(shù)量多；在細(xì)胞組分類別中，細(xì)胞部分（3 161個）、細(xì)胞器（2 293 個）和膜（1 312個）功能組包含的Unigenes 數(shù)量最多；在分子功能類別中，注釋較多的主要有粘合物（5 828 個）、催化活性（5 532個）和轉(zhuǎn)運(yùn)活動（604 個）功能組.

圖3 GO 注釋分布結(jié)果Fig.3 GO classification analysis of all unigenes

2.6 KEGG 注釋與分類在KEGG 代謝通路注釋中，Unigenes 主要被注釋到核糖體、碳代謝、氨基酸等生物合成相20 個KEGG 代謝通路中（圖4），其中代謝途徑通路注釋的基因數(shù)最多，為4 316，其他次生代謝產(chǎn)物合成通路注釋基因數(shù)次之，為2 294.

圖4 主要的KEGG pathway 類型歸納統(tǒng)計(jì)Fig.4 Inductive statistics of main KEGG pathway types

2.7 參與黃精多糖、甾體皂苷、黃酮生物合成的催化酶基因篩選本研究結(jié)合多糖類化合物、甾體皂苷類化合物及黃酮類化合物生物合成途徑進(jìn)行分析.根據(jù)Unigene功能注釋，鑒定出21 種共165 個可能參與黃精多糖生物合成的關(guān)鍵酶基因（表4）.主要包括己糖激酶（hexokinase，HK）、甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉(zhuǎn)移酶（mannose-1-phosphate guanylyltransferase，GMPP）和β-呋喃果糖苷（beta-fructofuranosidase，sacA）等，篩選出22 種共125 個可能參與甾體皂苷生物合成途徑的催化酶基因（表5）.共鑒定出參與甲羥戊酸（MVA）途徑的關(guān)鍵酶25 個，2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（MEP）途徑的關(guān)鍵酶31 個，以及下游途徑的關(guān)鍵酶69 個；篩選鑒定出10 種35個黃精黃酮類化合物合成相關(guān)的基因（表6），主要是查爾酮合酶（Chalcone synthase，CHS）和查爾酮異構(gòu)酶（Chalcone isomerase，CHI）等.

表4 黃精多糖代謝的關(guān)鍵酶Tab.4 Key enzymes involved in fructose and mannose metabolism

表5 皂苷元生物合成的關(guān)鍵酶Tab.5 Key enzymes involved in sapogenin biosynthesis

表6 黃酮類化合物合成的關(guān)鍵酶Tab.6 Key enzymes in the synthesis of flavonoids

3 討論

本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析和序列組裝拼接得到146 072個Unigene.黃精多糖均由阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖與半乳糖組成，其中甘露糖含量最高.黃精多糖具有抗腫瘤、降低血糖和防止動脈粥樣硬化的藥理功效［8-9］.本研究共篩選出21 種（165 條unigene）可能參與黃精多糖生物合成的關(guān)鍵酶基因，其中主要有己糖激酶、甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉(zhuǎn)移酶和β-呋喃果糖苷.有研究發(fā)現(xiàn)［10］，多糖含量與甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉(zhuǎn)移酶、β-呋喃果糖苷的表達(dá)量成正相關(guān)，但與己糖激酶的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，由此，可通過檢測這幾種基因的表達(dá)量來判別黃精的多糖含量，進(jìn)而選育高品質(zhì)的黃精植株培育.β-呋喃果糖苷酶具有蔗糖水解酶活性，不受生物堿活性影響，這一功能基因的存在可能與黃精抗生物脅迫相關(guān).

黃精中甾體皂苷類成分可廣泛參與避孕藥、消炎藥等藥物合成［11］，還具有抗抑郁、抗腫瘤、抗炎和抗病毒等功效［12］.本實(shí)驗(yàn)篩選到了甾醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶、環(huán)烯醇合成酶和UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶73C 等關(guān)鍵酶基因可能參與黃精甾體皂苷類成分下游合成的生物途徑.目前，國內(nèi)外分別從燕麥［13］、盾葉薯蕷［14］中發(fā)現(xiàn)了與甾體皂苷生物合成的關(guān)鍵酶基因.本研究在黃精的轉(zhuǎn)錄組中總共有6條Unigene 被注釋為UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（Uridine diphosphate-glycosyltransferases，UGTs），為 UTG73類型.UGTs常參與次生代謝產(chǎn)物合成的最后階段，對于生物活性成分終端產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)修飾、穩(wěn)定性和多樣性具有重要意義.據(jù)報道，GT73B6 是直接催化生成紅景天苷的關(guān)鍵酶［15］，UGT73C6 與黃酮類化合物的糖基化相關(guān)［16］.因此，后續(xù)研究可著重對UTG73C 做進(jìn)一步的表達(dá)分析與功能驗(yàn)證，以挖掘出確實(shí)與黃精甾體皂苷生物合成相關(guān)的甾體皂苷糖基轉(zhuǎn)移酶基因.

黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性，如抗菌、抗氧化和抗腫瘤的作用［17］.因此，研究與黃酮類化合物合成的相關(guān)功能基因具有重要作用，本研究共篩選出10 種（35 條unigene）可能參與黃酮類化合物合成的關(guān)鍵酶基因.其中包括查爾酮合酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）等關(guān)鍵酶基因.CHS是類黃酮生物合成途徑中的第一個關(guān)鍵酶.國內(nèi)外已從百合［18］、蝴蝶蘭［19］中克隆并鑒定了CHS 基因.CHS可參與植物花色素的形成及增強(qiáng)植物防御病原體［20］，還可調(diào)控花粉粒中類黃酮的積累，影響其常規(guī)授粉［21］.查爾酮異構(gòu)酶作為類黃酮合成途徑中的第二限速酶，Muir 等［22］把矮牽牛中編碼的CHI基因轉(zhuǎn)入番茄中，由于蘆丁的累積，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因番茄果皮中的黃酮醇含量顯著增加.擬南芥中III型CHI具有脂肪酸結(jié)合蛋白功能，可以影響植物細(xì)胞中脂肪酸的生物合成，且儲存于發(fā)育中的胚胎中［23］，但目前還沒有關(guān)于黃精中CHS 和CHI關(guān)鍵酶基因的功能研究，因此，有待進(jìn)一步探究.

黃精藥理價值廣泛，因此，挖掘參與調(diào)控黃精多糖、甾體皂苷和黃酮等質(zhì)量標(biāo)志性成分的功能基因，開展種內(nèi)聚合雜交技術(shù)，選育優(yōu)良品種，有利于黃精資源更好的開發(fā)利用.

致謝國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金資助項(xiàng)目（202011360025）對本文給予了資助，謹(jǐn)致謝意！