曹少謙，江 凱，劉 亮,

（1.浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波 315100；2.浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校食品學(xué)院，浙江寧波 315500）

藍(lán)莓酸甜可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含花色苷、類黃酮等多種功能活性成分[1?4]。隨著人們對(duì)健康生活需求的日益增長(zhǎng)，藍(lán)莓因其具有明目、護(hù)肝、抗癌、抗衰老等多種功效而逐漸受到消費(fèi)者的青睞[5?9]。但是藍(lán)莓因采后易腐爛和發(fā)生褐變而導(dǎo)致其花色苷等功能活性成分降解，嚴(yán)重影響了其加工制品的品質(zhì)，制約了藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

花色苷非常不穩(wěn)定，易受pH、溫度、氧、酶、金屬離子和糖等因素的影響而發(fā)生降解[10?13]。雖然花色苷不能直接被多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）氧化，但是花色苷在有多酚類底物和PPO同時(shí)存在的情況下會(huì)迅速降解，因此，PPO被認(rèn)為在花色苷的降解中扮演著重要的角色[14?15]。然而，有關(guān)藍(lán)莓花色苷穩(wěn)定性的研究主要集中在熱處理、超高壓處理等對(duì)其穩(wěn)定性的影響上[16?19]，而關(guān)于藍(lán)莓花色苷耦合氧化降解的報(bào)道相對(duì)較少，僅Karder對(duì)藍(lán)莓PPO耦合氧化降解矢車(chē)菊素-3-葡萄糖進(jìn)行了報(bào)道，他認(rèn)為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖是通過(guò)耦合氧化機(jī)制與綠原酸或咖啡酸酶促氧化產(chǎn)生的醌形成降解產(chǎn)物而降解[20?22]。但有關(guān)花色苷、PPO、底物三者之間的反應(yīng)量效關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

針對(duì)以上問(wèn)題，本文擬對(duì)藍(lán)莓花色苷的偶合氧化降解途徑進(jìn)行研究，闡明花色苷偶合氧化降解過(guò)程中的量效反應(yīng)規(guī)律，為進(jìn)一步探尋藍(lán)莓在貯藏及加工過(guò)程中花色苷降解的調(diào)控措施提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓 品種園藍(lán)，選擇新鮮、無(wú)機(jī)械損傷的藍(lán)莓，貯藏于?18 ℃下備用；乙醇、丙酮、乙酸乙酯、鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、檸檬酸、檸檬酸三鈉、鄰苯二酚、無(wú)水硫酸銨、PVPP 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯基-瓊脂糖凝膠CL-4B（Phenyl-Sepharose CL-4B） Pharmacia公司。

JJ-2高速組織搗碎機(jī) 金壇市淮誠(chéng)實(shí)驗(yàn)器材廠；UV-1700 SPC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) SHIMADZU公司；90-3型磁力攪拌器 上海滬西分析儀器廠有限公司；5804R冷凍離心機(jī) Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓花色苷的提取分離 參照荔枝表皮花色苷的提取方法[23]。將冰凍的藍(lán)莓與丙酮以1:5的固液比進(jìn)行混合，置于打漿機(jī)中打漿。在4 ℃下靜置提取4 h后過(guò)濾，濾液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，所得濃縮液用大孔樹(shù)脂柱層析分離純化，收集40%乙醇洗脫組分，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇。所得旋蒸液用乙酸乙酯萃取，收集水相并再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，即得藍(lán)莓花色苷提取物，置于4 ℃的貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 花色苷濃度的測(cè)定 采用pH示差法[24]。2.0 mL花色苷提取液用pH1.0的緩沖液稀釋至25 mL，另取2.0 mL花色苷提取液用pH4.5的緩沖液稀釋至25 mL，510 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)。按下面公式計(jì)算含量：

式中，484.82是氯化矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的分子量；24825是氯化矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)；DF為稀釋度。

1.2.3 藍(lán)莓PPO提取、分離純化 參照本實(shí)驗(yàn)室提取水蜜桃PPO的方法[25]。在獲得藍(lán)莓PPO粗提液后，用Phenyl- Sepharose CL-4B（2 cm×20 cm）柱進(jìn)行分離純化。上樣液（NH4）2SO4飽和度為35%，流速為2 mL/min，收集50 mmol/L磷酸緩沖液（pH6.8）洗脫下柱液中有酶活的組分，并在此緩沖溶液中透析過(guò)夜后備用。

1.2.4 PPO活性測(cè)定 采用分光光度法[25]，分別加入1.8 mL磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH 6.0）、1 mL 10 mmol/L鄰苯二酚，調(diào)零后快速加入0.2 mL酶液，并開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔30 s記錄400 nm吸光度值，計(jì)時(shí)3 min，平行測(cè)定3次。以每分鐘吸光值增加0.001為一個(gè)酶活性單位。

1.2.5 不同鄰苯二酚濃度對(duì)偶合氧化反應(yīng)的影響在比色皿中分別加入0.2 mL的花色苷溶液（反應(yīng)體系中的終濃度為54 mg/L）和不同體積的20 mmol/L鄰苯二酚，鄰苯二酚在體系中的終濃度分別為0.67、1、1.33、1.67、2、2.67、3.33 mmol/L，加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH3.5）至2.8 mL，再加入0.2 mL的PPO混合均勻（總反應(yīng)體系3 mL，15 ℃），在350~600 nm下，以2 min為一個(gè)間隔，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行掃描，記錄峰值變化。

1.2.6 不同花色苷濃度對(duì)偶合氧化反應(yīng)的影響 在比色皿中加入0.1 mL 20 mmol/L的鄰苯二酚和不同體積的花色苷，花色苷的在體系中的終濃度分別為18、27、40.5、54、81、108、135 mg/L，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH3.5）至2.8 mL，再加入0.2 mL的PPO混合均勻（總反應(yīng)體系3 mL，反應(yīng)體系在520 nm處的吸光值在0.15~1.5之間，15 ℃），在350~600 nm下，以2 min為一個(gè)間隔，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行掃描，記錄峰值變化。

1.2.7 PPO濃度對(duì)偶合氧化反應(yīng)的影響 在比色皿中加入0.2 mL花色苷（反應(yīng)體系中的終濃度為54 mg/L），0.1 mL 20 mmol/L鄰苯二酚和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH3.5），加入不同體積的藍(lán)莓PPO混合均勻（總反應(yīng)體系3 mL，15 ℃），PPO在體系中的終酶濃度分別為7.5、15、22.5、30、37.5、45 U/mL，在350~600 nm下，以2 min為一個(gè)間隔，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行掃描，記錄峰值變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷-PPO-鄰苯二酚之間的相互作用

結(jié)果表明，在僅有藍(lán)莓PPO或鄰苯二酚存在的情況下，藍(lán)莓花色苷在1 h內(nèi)并沒(méi)有發(fā)生明顯降解。但在鄰苯二酚與藍(lán)莓PPO同時(shí)存在時(shí)，花色苷開(kāi)始逐漸降解?；ㄉ?PPO-鄰苯二酚反應(yīng)體系在不同波長(zhǎng)下的吸光值變化如圖1所示，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，該反應(yīng)體系在花色苷的特征吸收峰（520 nm）附近的吸光值逐漸降低，說(shuō)明在鄰苯二酚存在的條件下，PPO與花色苷之間發(fā)生了偶合氧化反應(yīng)。偶合氧化反應(yīng)先是由PPO將鄰苯二酚氧化成苯醌，苯醌再與花色苷反應(yīng)生成無(wú)色物質(zhì)[26]?；谏鲜隼碚摚谒{(lán)莓花色苷的偶合氧化體系中應(yīng)有兩類主要的反應(yīng)，一是鄰苯二酚的酶促氧化反應(yīng)，該反應(yīng)產(chǎn)物的特征吸收峰在400 nm附近，會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)體系在400 nm附近的吸光值不斷增加；二是花色苷與醌類物質(zhì)的氧化反應(yīng)，該反應(yīng)最終導(dǎo)致花色苷不斷被氧化降解。

圖1 鄰苯二酚存在的情況下藍(lán)莓花色苷耦合氧化降解體系光譜圖Fig.1 Spectrophotometric recordings for the degradation of blueberry anthocyanins in the presence of catechol and PPO

藍(lán)莓花色苷-PPO-鄰苯二酚偶合氧化反應(yīng)體系在不同波長(zhǎng)下吸光值變化研究結(jié)果顯示（圖2），反應(yīng)體系在520 nm處的吸光值降低最快，并形成一個(gè)倒峰，此變化由花色苷與醌類物質(zhì)的氧化反應(yīng)所致。然而，400 nm處的吸光值雖然在不斷增加，但并沒(méi)有在400 nm處觀察到一個(gè)正增長(zhǎng)的吸光值變化峰，這與前期研究荔枝花色苷的偶合氧化降解反應(yīng)時(shí)所得結(jié)果不一致[23]。這可能是由于本研究所用藍(lán)莓花色苷為粗提物，是含有多種花色苷以及其他酚類物質(zhì)的混合物，而在荔枝花色苷的研究中用的是經(jīng)過(guò)純化的單一花色苷。

圖2 藍(lán)莓花色苷耦合氧化體系不同波長(zhǎng)吸光值變化Fig.2 Changes in absorbance of the model system at different wavelengths during the coupled oxidation of blueberry anthocyanins

在藍(lán)莓花色苷的耦合氧化降解反應(yīng)的前20 min內(nèi)，花色苷的lnC/C0降解曲線為一條直線，說(shuō)明在這段時(shí)間內(nèi)，花色苷的偶合氧化降解符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型。但20 min后，其降解速率大大降低（圖3）。同時(shí)，在400 nm處的吸光值的變化在前20 min線性增加，但20 min后，其變化速率略有降低。該結(jié)果可能是由于隨著花色苷大量的被耦合氧化降解，花色苷濃度下降，鄰苯二酚與花色苷分子間的碰撞概率下降，導(dǎo)致降解速率逐漸減小所致[23]。

圖3 花色苷的耦合氧化降解與鄰苯二酚的酶促氧化Fig.3 Coupled oxidation of blueberry anthocyanins and enzymatic oxidation of catechol

2.2 鄰苯二酚濃度對(duì)偶合氧化反應(yīng)的影響

鄰苯二酚濃度對(duì)偶合氧化降解體系中花色苷降解速率的影響如圖4所示。鄰苯二酚濃度的增加會(huì)導(dǎo)致花色苷的降解速率的增加。當(dāng)鄰苯二酚濃度低于于1.33 mmol/L時(shí)，花色苷的降解速率隨著鄰苯二酚濃度的增加而迅速增加；而當(dāng)鄰苯二酚濃度高于1.33 mmol/L時(shí)，鄰苯二酚濃度的變化對(duì)花色苷降解速率的影響逐漸變小。

圖4 鄰苯二酚濃度對(duì)花色苷降解速率的影響Fig.4 Effect of catechol concentration on coupled oxidation of blueberry anthocyanins

與此同時(shí)，鄰苯二酚氧化速率在所選擇的所有濃度范圍內(nèi)均隨著鄰苯二酚濃度的增加而線性增加（圖5）。這說(shuō)明在藍(lán)莓花色苷的偶合氧化反應(yīng)體系中，增加鄰苯二酚濃度會(huì)導(dǎo)致苯醌生成速率的增加，但這些生成的苯醌并沒(méi)有進(jìn)一步與花色苷發(fā)生反應(yīng)。其原因可能是：增加鄰苯二酚濃度可能使得鄰苯二酚會(huì)與苯醌的反應(yīng)機(jī)率增加，使體系中鄰苯二酚和花色苷會(huì)相互競(jìng)爭(zhēng)與苯醌發(fā)生反應(yīng)[22]。

圖5 鄰苯二酚濃度對(duì)鄰苯二酚氧化速率的影響Fig.5 Effect of concentration of catechol on the oxidation rate of catechol

2.3 花色苷濃度對(duì)對(duì)偶合氧化反應(yīng)的影響

當(dāng)鄰苯二酚濃度不變時(shí)，花色苷濃度對(duì)對(duì)偶合氧化降解體系中花色苷降解速率的影響如圖6所示。隨著體系中初始花色苷濃度的增加，體系中花色苷的降解速率不斷降低。同時(shí)，鄰苯二酚的氧化速率隨著花色苷濃度的增加而降低（圖7）。Hemachandran等[27]的研究表明，花色苷可以抑制蘋(píng)果PPO的活性，且這種抑制屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制模式。本研究中花色苷濃度的增加可能導(dǎo)致藍(lán)莓PPO活性被抑制，導(dǎo)致苯醌的生成速率變小，從而導(dǎo)致花色苷降解速率逐漸降低。

圖6 花色苷濃度對(duì)花色苷耦合氧化反應(yīng)速率的影響Fig.6 Effect of concentration of anthocyanins on coupled oxidation of blueberry anthocyanins

圖7 花色苷濃度對(duì)鄰苯二酚氧化速率的影響Fig.7 Effect of concentration of anthocyanins on the oxidation rate of catechol

當(dāng)花色苷濃度大于81 mg/L時(shí)，其濃度的增加不再導(dǎo)致鄰苯二酚氧化速率的降低，此時(shí)的鄰苯二酚氧化速率趨近與0。這說(shuō)明在此條件下，體系中所有產(chǎn)生的苯醌幾乎全都與花色苷發(fā)生了偶合氧化反應(yīng)，所以再進(jìn)一步增加花色苷濃度，并不會(huì)導(dǎo)致降解的花色苷增多，但花色苷濃度的增加使得體系中降解花色苷的相對(duì)量變小，所以體系中花色苷的降解速率仍然在降低。

2.4 PPO濃度對(duì)偶合氧化反應(yīng)的影響

如圖8所示，藍(lán)莓花色苷偶合氧化降解速率隨著酶濃度的增加而加快，且花色苷降解速率和PPO濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。這說(shuō)明酶濃度的增加導(dǎo)致苯醌的生成量增加，使得能有更多的氧化產(chǎn)物與花色苷發(fā)生偶合氧化反應(yīng)，從而加快花色苷降解速率。文獻(xiàn)[20,22]分別研究了綠原酸和咖啡酸醌降解花色苷的反應(yīng)機(jī)制，其研究表明當(dāng)花色苷與底物等摩爾量反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)體系中花色苷的降解速率與綠原酸或咖啡酸的氧化速率之比均為2。這說(shuō)明當(dāng)花色苷與底物濃度不變時(shí)，花色苷的偶合氧化降解速率與底物的氧化速率成正比，而當(dāng)酶濃度增加時(shí)，底物的酶促氧化速率會(huì)線性增加，從而導(dǎo)致了花色苷降解速率的線性增加[23]。

圖8 酶濃度對(duì)藍(lán)莓花色苷耦合氧化反應(yīng)速率的影響Fig.8 Effect of concentration of enzyme on coupled oxidation of blueberry anthocyanins

3 結(jié)論

本文分別從藍(lán)莓中分離提取得到花色苷和PPO，研究了花色苷-PPO-鄰苯二酚的偶合氧化反應(yīng)機(jī)制，鄰苯二酚的酶促氧化生成醌類物質(zhì)和花色苷與醌類物質(zhì)的氧化反應(yīng)是偶合氧化體系中主要的兩類反應(yīng)。且花色苷的偶合氧化降解符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型。同時(shí)，本文還探討了花色苷-PPO-鄰苯二酚三者之間的量效反應(yīng)關(guān)系。研究結(jié)果表明，在偶合氧化降解體系中，鄰苯二酚、花色苷和PPO濃度均會(huì)影響花色苷的降解速率。雖然花色苷的降解速率會(huì)隨著鄰苯二酚濃度的增加而增加，但隨著鄰苯二酚濃度的增加，其花色苷的降解速率的增幅卻在逐漸減小?；ㄉ粘跏紳舛仍礁撸浣到馑俾试降?，兩種呈現(xiàn)出較為線性的負(fù)相關(guān)，而酶濃度的增加會(huì)導(dǎo)致花色苷的降解速率線性增加。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以進(jìn)一步推斷，在藍(lán)莓貯藏及加工過(guò)程中，藍(lán)莓中的PPO會(huì)與其組織中的酚類底物結(jié)合，產(chǎn)生相應(yīng)的醌類物質(zhì)，而這些物質(zhì)再通過(guò)耦合氧化機(jī)制導(dǎo)致藍(lán)莓花色苷降解，從而最終導(dǎo)致果實(shí)或者相關(guān)產(chǎn)品的褐變。且其褐變速率與組織中酶的活性、酚類底物以及花色苷含量都有密切的關(guān)系。本研究結(jié)果有利于進(jìn)一步揭示藍(lán)莓花色苷的降解機(jī)制，并為探尋藍(lán)莓在貯藏及加工過(guò)程中花色苷降解的調(diào)控措施提供理論依據(jù)。當(dāng)然，在后續(xù)的研究中，應(yīng)進(jìn)一步利用色譜、液質(zhì)聯(lián)用以及核磁共振分析等技術(shù)手段對(duì)耦合氧化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，從而更深入地闡明藍(lán)莓花色苷的降解機(jī)制。