張春陽(yáng) 郭振委 何效兵 周芯羽

南京醫(yī)科大學(xué)連云港臨床醫(yī)學(xué)院（連云港市第一人民醫(yī)院）神經(jīng)內(nèi)科（江蘇連云港222002）

自發(fā)性腦內(nèi)出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種嚴(yán)重的致死性卒中亞型，占所有卒中患者的10% ～ 15%［1］。炎癥在ICH 引起的腦損傷中起著重要作用［2］。探討炎癥反應(yīng)在ICH 中的機(jī)制有重要意義。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的細(xì)胞，其在腦出血后幾分鐘內(nèi)被激活，并通過(guò)建立最終導(dǎo)致神經(jīng)變性的前饋炎癥環(huán)路在神經(jīng)炎癥期間發(fā)揮神經(jīng)毒性作用［3］。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞在ICH 的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，研究其作用機(jī)制對(duì)ICH 的治療具有重要意義。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）是一種多功能蛋白，主要表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplas?mic reticulum，ER）內(nèi)腔［4］。GRP78 作為ER 的主要伴侶和ER 應(yīng)激信號(hào)的主要調(diào)節(jié)者，通過(guò)控制蛋白質(zhì)折疊和組裝、防止蛋白質(zhì)聚集來(lái)調(diào)節(jié)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）［5］。目前認(rèn)為，GRP78 參與多種神經(jīng)退行性疾病，包括阿爾茨海默病、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化和帕金森病等［6］。此外，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為有助于神經(jīng)退行性變，它們的數(shù)量與神經(jīng)退行性變過(guò)程中持續(xù)的損傷有關(guān)［7］。然而，尚未明確GRP78 是否在星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性活化中發(fā)揮作用，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于此類研究較少。因此，本研究建立了ICH小鼠模型和體外LPS 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥模型，探討了GRP78 在星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性活化中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及ICH 模型建立8 周齡雄性CD1 小鼠（體質(zhì)量約30 ～ 40 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠在手術(shù)前至少3 d被飼養(yǎng)在溫度和濕度受控以及12 h光/暗循環(huán)的房間中，能自由進(jìn)食和飲水。參照文獻(xiàn)方法通過(guò)自體全血注射誘導(dǎo)ICH［8］。具體操作為：小鼠用氯胺酮（100 mg/kg）和甲苯噻嗪（10 mg/kg）（2∶1 v/v，腹腔注射）麻醉并俯臥在Kopf立體定向頭架（美國(guó)CA公司）。在手術(shù)過(guò)程中使用人工淚液軟膏（德國(guó)海露公司）保持小鼠眼睛濕潤(rùn)。將動(dòng)脈血收集在非肝素化毛細(xì)管中，立即轉(zhuǎn)移到250 μL Hamilton 注射器上的27 號(hào)針頭中。鉆出一個(gè)1 mm 的顱骨鉆孔，并將Hamilton注射器立體定向地插入右側(cè)基底神經(jīng)節(jié)（坐標(biāo)：前囟后0.2 mm，前囟外側(cè)2.2 mm 和硬腦膜下方3.5 mm）。使用Stoelting 微型輸液泵（美國(guó)Holliston公司）將總體積為30 μL 的血液輸注到右側(cè)基底神經(jīng)節(jié)中，并在注射完成后，將針頭留在原位5 min以防止可能的泄漏，然后以1 mm/min 的速度緩慢撤回。顱骨鉆孔用骨蠟封閉，縫合頭皮切口。皮下注射0.4 mL 生理鹽水以避免術(shù)后脫水。在密切觀察下使小鼠從麻醉中完全恢復(fù)。假手術(shù)是按照相同的程序進(jìn)行的，沒(méi)有注射全血。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組在本研究中，所有小鼠都被隨機(jī)分配到以下實(shí)驗(yàn)中。（1）為了評(píng)估ICH 后腦中內(nèi)源性GRP78 表達(dá)的時(shí)間過(guò)程，將42 只小鼠隨機(jī)分為7 組（n=6/組）：分別為假手術(shù)、ICH 后3、6、12、24、48、72 h 組。采用Western blot 檢測(cè)各組血腫周圍區(qū)域GRP78 的表達(dá)。（2）為了評(píng)估GRP78 靶向抑制劑HA15 在ICH 中的神經(jīng)保護(hù)作用，將36 只小鼠隨機(jī)分為3 組（n= 12/組）：假手術(shù)、ICH + 載體（PBS）、ICH + HA15。HA15（美國(guó)MCE 公司）溶于PBS 中，并在ICH 后1 h 鼻內(nèi)施用HA15（劑量為0.5 μg/kg）。在ICH 后24、72 h 評(píng)估神經(jīng)行為測(cè)試和腦水含量，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組各分配6 只小鼠進(jìn)行測(cè)定。（3）為了評(píng)估用HA15 抑制GRP78 對(duì)ICH后24 h 神經(jīng)炎癥和神經(jīng)凋亡的影響，將54 只小鼠隨機(jī)分為3 組（n= 18/組）：假手術(shù)、ICH + 載體（PBS）和ICH+HA15（0.5 μg/kg）。在ICH 后1 h 鼻內(nèi)施用HA15。在ICH 后24 h，進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的免疫熒光染色（n= 6/組）以計(jì)數(shù)血腫周圍區(qū)域的GFAP 陽(yáng)性細(xì)胞（20 ×，平均來(lái)自3 個(gè)視野/切片，10 個(gè)切片/鼠標(biāo)）。使用雙標(biāo)記免疫熒光染色評(píng)估GRP78 的星形膠質(zhì)細(xì)胞定位（n= 6/組），并計(jì)數(shù)血腫周圍區(qū)域的GFAP+GRP78+細(xì)胞（20 ×，平均來(lái)自3 個(gè)視野/切片，10 個(gè)切片/鼠標(biāo)）。使用TUNEL 法評(píng)估神經(jīng)元凋亡（n=6/組），并計(jì)數(shù)血腫周圍區(qū)域的TUNEL 陽(yáng)性染色神經(jīng)元（40 ×，平均來(lái)自3 個(gè)視野/切片，10 個(gè)切片/鼠標(biāo)）。（4）為了評(píng)估用HA15 抑制GRP78 對(duì)ICH 后24 h 血腫周圍區(qū)域ER 形態(tài)學(xué)變化和應(yīng)激情況，將總共24 只小鼠隨機(jī)分為3 組（n= 8/組）：假手術(shù)、ICH+載體（PBS）、ICH+HA15（0.5 μg/kg）。在ICH后1 h 鼻內(nèi)施用HA15。在ICH 后24 h，各取2 只小鼠進(jìn)行透射電鏡觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化。每組其余6 只小鼠取血腫周圍區(qū)域組織，進(jìn)行Western blot 分析ER 應(yīng)激的經(jīng)典下游標(biāo)志物Caspase 12 和CHOP 蛋白表達(dá)。

1.3 短期神經(jīng)行為評(píng)估在ICH 后24、72 h，使用改良的Garcia 評(píng)分測(cè)試、前肢放置測(cè)試和轉(zhuǎn)角測(cè)試評(píng)估短期神經(jīng)行為功能［9］。

1.4 腦含水量測(cè)量通過(guò)濕/干方法測(cè)量腦含水量［10］。

1.5 透射電子顯微鏡觀察ER結(jié)構(gòu)小鼠麻醉后用經(jīng)心灌注0.1 mol/L PBS，再灌注4%多聚甲醛（pH 7.4）。獲得1 mm3的血腫周圍區(qū)域組織，并浸泡在4 ℃2.5%戊二醛溶液（pH 7.40）固定24 h。隨后，將組織放入1%四氧化鋨中1 h，并用一系列分級(jí)乙醇對(duì)組織進(jìn)行脫水。再將組織浸入環(huán)氧丙烷和樹(shù)脂（1∶1）的混合物中。4 h后，將組織埋入樹(shù)脂中，并切割成100 nm 截面，使用4%醋酸鈾酰（20 min）和0.5%檸檬酸鉛（5 min）染色。最后用TECNAI10 透射電鏡（德國(guó)Philips 公司）觀察腦組織的ER 結(jié)構(gòu)。

1.6 免疫組化對(duì)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將小鼠麻醉并隨后用4%多聚甲醛灌注。取出大腦并在4%多聚甲醛中固定［10］進(jìn)行免疫組化。

1.7 Western blot 分析將組織或細(xì)胞用1×RIPA緩沖液勻漿，在4 ℃下以14 000 ×g 離心10 min，并通 過(guò)Bradford 方 法 測(cè) 量 上清液蛋白質(zhì)［11］，進(jìn)行Western blot 分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用Graph Pad Prism 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。使用單向方差分析（ANOVA）和Tukey 事后分析對(duì)多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICH后GRP78在大腦皮層中的表達(dá)水平與假手術(shù)組相比，腦出血小鼠血腫周圍區(qū)域中GRP78水平在ICH 后3 h 開(kāi)始上升，并在24 h 達(dá)到最高（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 ICH 后血腫周圍區(qū)域GRP78 時(shí)間進(jìn)程的代表性蛋白質(zhì)印跡圖像和定量分析Fig.1 Representative Western blot images and quantitative analysis of GRP78 time course in the area around hematoma after ICH

2.2 HA15 抑制GRP78 可改善ICH 后神經(jīng)行為缺陷并減少腦水腫在ICH 后24 h 和72 h，與假手術(shù)組相比，ICH 小鼠的神經(jīng)行為評(píng)分顯著更低，腦水腫更高。在ICH 后24 h 和72 h，與ICH+PBS 組相比，ICH+HA 組小鼠神經(jīng)功能缺損顯著改善（P＜0.05），并且基底神經(jīng)節(jié)和皮質(zhì)的腦水腫顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 HA15 對(duì)ICH 后24 h 和72 h 的神經(jīng)行為測(cè)試、腦水含量的影響Fig.2 Effect of ha15 on neurobehavioral test and brain water content 24 and 72 hours after ICH

2.3 HA15 抑制ICH 后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和神經(jīng)細(xì)胞凋亡由于ICH 后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生與神經(jīng)功能缺損、神經(jīng)炎癥和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，因此研究進(jìn)行了GFAP的免疫熒光以評(píng)估ICH后24 h星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。與假手術(shù)組相比，ICH+PBS組小鼠血腫周圍區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增加（P＜0.05）。然而，這種效果在HA 治療的ICH 小鼠中被部分逆轉(zhuǎn)（圖3A）。此外，免疫雙染顯示，ICH + PBS 組小鼠血腫周圍區(qū)域GFAP + GRP78+細(xì)胞較假手術(shù)組顯著增加（P＜0.05），而HA治療后GFAP+GRP78+細(xì)胞顯著下調(diào)（P＜0.05，圖3B）。細(xì)胞凋亡是ICH引起損傷的標(biāo)志，TUNEL 染色顯示ICH+PBS 組小鼠血腫周圍區(qū)域TUNEL 陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），這種效應(yīng)在HA 治療的ICH 小鼠中被部分消除（圖3C）。

圖3 HA15 對(duì)ICH 大腦的神經(jīng)保護(hù)作用Fig.3 neuroprotective effect of ha15 on ICH brain

2.4 ICH 誘導(dǎo)后24 h 血腫周圍區(qū)域ER 形態(tài)學(xué)變化和應(yīng)激情況TEM顯示，與假手術(shù)組相比，ICH組在ICH 后24 h 血腫周圍區(qū)域中破裂和腫脹ER 增加，而HA15 處理減少了破裂和腫脹ER（圖4A）。Caspase 12 和CHOP 是ER 應(yīng)激的經(jīng)典下游標(biāo)志物，它們?cè)贗CH 后24 h 血腫周圍區(qū)域中被強(qiáng)烈激活或升高，而HA15 處理減少了二者表達(dá)（圖4B、C）。

圖4 ICH 誘導(dǎo)后24 h 血腫周圍區(qū)域ER 形態(tài)學(xué)變化和應(yīng)激情況Fig.4 Er morphological changes and stress in the area around hematoma 24 hours after ICH induction

3 討論

本研究探討了GRP78 激活在小鼠ICH 后神經(jīng)炎癥中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）在血腫周圍區(qū)域中GRP78 的內(nèi)源性表達(dá)在ICH 發(fā)生后逐漸增加并在24 h 后達(dá)到峰值。（2）GRP78 靶向抑制 劑HA15（0.5 μg/kg）在ICH 后1 h 鼻內(nèi)給藥顯著改善神經(jīng)功能缺損和減少腦水腫，并減少星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和ER 應(yīng)激。（3）體外LPS 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥模型顯示HA15 通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中GRP78 表達(dá)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中ER 應(yīng)激和促炎細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元免受LPS 誘導(dǎo)的損傷。這初步闡述了ICH 發(fā)病中ER應(yīng)激的意義。

近年來(lái)，許多研究表明，ER 應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在ICH 出血后早期腦損傷中起重要作用［13］。ER 是一種主要控制蛋白質(zhì)合成和進(jìn)一步加工的細(xì)胞器。炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體鈣超載通過(guò)干擾ER 功能引起ER 應(yīng)激［14］。ER 應(yīng)激的過(guò)度激活導(dǎo)致ER 中錯(cuò)誤折疊蛋白水平的升高和積累。GRP78作為ER應(yīng)激的主要效應(yīng)分子，其在非ER應(yīng)激條件下，可以與三個(gè)主要ER 應(yīng)激傳感器（PERK、ATF6和IRE1）的ER 內(nèi)端結(jié)合，保持它們的非活動(dòng)狀態(tài)［5］。在ER應(yīng)激過(guò)程中，GRP78與這三個(gè)分子分離。本研究表明，GRP78 蛋白表達(dá)在ICH 后24 h 內(nèi)逐漸增加，表明ER 應(yīng)激可能在ICH 后被持續(xù)激活。然而，當(dāng)發(fā)生過(guò)量的ER應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞的正常功能將無(wú)法恢復(fù)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）上調(diào)，激活Caspase?12 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑［15］。此外，轉(zhuǎn)錄因子CHOP 可以下調(diào)抗凋亡Bcl?2 蛋白并增加促凋亡Bax 蛋白的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，在ICH 小鼠模型中，Caspase 12和CHOP 表達(dá)顯著上調(diào)，而HA15 可以減少過(guò)量的ER應(yīng)激，表現(xiàn)為Caspase 12 和CHOP 表達(dá)降低。噻唑苯磺酰胺化合物HA15 是GRP78 的新型抑制劑，已被證明結(jié)合并抑制必需的ER 伴侶GRP78，可強(qiáng)烈抑制ER 應(yīng)激途徑［16-18］。

因此，GRP78 蛋白通過(guò)介導(dǎo)過(guò)量的ER 應(yīng)激參與ICH 腦損傷。本研究較好闡述了ER 應(yīng)激在ICH中的具體作用途徑及機(jī)制，有助于進(jìn)一步了解ICH腦損傷的病理生理過(guò)程，從而為預(yù)防該疾病提供策略。ICH損傷會(huì)刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷和促炎細(xì)胞因子的釋放，如TNF?α、IL?1β 和IL?6［17］。星形膠質(zhì)細(xì)胞有助于神經(jīng)炎癥過(guò)程，已成為未來(lái)治療方法的一個(gè)有吸引力的靶標(biāo)［18］。整體研究結(jié)果顯示GRP78 介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活與ICH 神經(jīng)元存活和腦功能恢復(fù)密切相關(guān)［19-20］。

總之，本研究結(jié)果表明ER 應(yīng)激蛋白GRP78 通過(guò)介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性活化參與ICH 后神經(jīng)損傷。GRP78靶向抑制劑HA15可能對(duì)ICH 后神經(jīng)元存活產(chǎn)生積極影響，應(yīng)進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。本研究可進(jìn)一步深入研究臨床藥物干預(yù)ER 應(yīng)激的可能，為以后治療ICH腦損傷提供途徑。