汪仡驍 吳恒鵬 萬雪 陳方 石超 瓦慶德

1遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科（貴州遵義563000）；2遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴州遵義563003）；3遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科（貴州遵義563003）；4貴黔國(guó)際總醫(yī)院骨科（貴陽550018）

關(guān)節(jié)軟骨損傷后難以自行修復(fù)，其可導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)功能進(jìn)行性退變而影響患肢功能，嚴(yán)重者可影響生存質(zhì)量，是臨床亟待解決的一大難題。目前關(guān)節(jié)軟骨缺損的治療方法主要包括軟骨細(xì)胞移植和自體骨軟骨移植、微骨折手術(shù)等，雖有一定療效，但尚存在植入細(xì)胞肥大化、供體部位繼發(fā)病變及修復(fù)組織機(jī)械強(qiáng)度較低等相關(guān)并發(fā)癥［1-5］。

近年來，隨著表觀遺傳學(xué)及軟骨組織工程的發(fā)展，為軟骨缺損修復(fù)提供了一種新的策略［6］。細(xì)胞是構(gòu)建軟骨組織工程的關(guān)鍵成分，研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有良好的成軟骨分化能力，是軟骨組織工程中廣泛應(yīng)用的種子細(xì)胞［7-8］。BMSCs 成軟骨分化受多種因素調(diào)控，其中表觀遺傳學(xué)中的微小RNA 對(duì)調(diào)控BMSCs 成軟骨分化至關(guān)重要［9］。此外，關(guān)節(jié)內(nèi)特有的低氧環(huán)境亦能通過調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子HIF?1α 及轉(zhuǎn)錄因子SOX 基因的表達(dá)促進(jìn)BMSCs 成軟骨分化［10］。筆者在前期測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)miR?30b 在軟骨分化過程中表達(dá)具有明顯差異，且能作用于其靶基因SOX9 參與調(diào)控C3H10T1/2分化，但其在低氧環(huán)境中是否能調(diào)控BMSCs 成軟骨分化及其潛在機(jī)制尚未明確［11］。目前，miR?30b在低氧條件下對(duì)BMSCs 成軟骨分化的調(diào)控鮮有研究涉及。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過探究miR?30b 在低氧環(huán)境中調(diào)控BMSCs 成軟骨分化的作用及潛在機(jī)制，為微小RNA 調(diào)控BMSCs 成軟骨分化修復(fù)軟骨缺損提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新西蘭大白兔3 只，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，普通級(jí)，10 ～ 12 周齡，體質(zhì)量1.8 ～ 2.2 kg，合格證號(hào)：SCXK（粵）2019?0035。主要試劑：DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶（Gibco，美國(guó)），CCK?8 試劑盒、甲苯胺藍(lán)染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Percoll 淋巴細(xì)胞分離液（GE Healthcare，瑞士），NaCl、CoCl2（Sigma，德國(guó)），地塞米松、β?甘油磷酸鈉（上海麥克林生化科技有限公司），TGF?β3（Peprotech，美國(guó)），ITS 細(xì)胞培養(yǎng)添加物（賽業(yè)生物科技有限公司，美國(guó)），茜素紅染色液、維生素C（北京索萊寶科技有限公司），0.22 μm PVDF 膜（Millipore，美國(guó)），CollagenⅡ、SOX9（Proteintech，美國(guó)），α?tublin（Cell Signaling Technology，美國(guó)），CD29、CD34、CD44、CD45 抗體（Biolegend，美國(guó)）。

1.2 兔BMSCs分離與培養(yǎng)10%戊巴比妥（3 mL/kg）沿耳緣靜脈麻醉新西蘭大白兔，在無菌條件下用穿刺針穿刺骨髓腔，抽取骨髓液后轉(zhuǎn)入含肝素鈉溶液的15 mL離心管中保存。用含1%雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋骨髓原液，1 000 rpm/min 離心5 min后去除上層少量脂肪細(xì)胞。將淋巴細(xì)胞分離液（1.073 g/mL）加入15 mL離心管下層，然后將骨髓液沿管壁緩慢加入上層。2 000 rpm/min 離心20 min后緩慢吸取中間層細(xì)胞沉淀并洗滌兩次，用含10%胎牛血清和1%雙抗的低糖DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，以3× 105個(gè)/mL 密度接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3 天首次換液，以后每3 d 更換一次培養(yǎng)基，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.3 甲苯胺藍(lán)染色及茜素紅染色甲苯胺藍(lán)染色：將第3 代兔BMSCs 以2 × 105個(gè)/孔接種至6 孔板中培養(yǎng)至90%匯合度，然后加入成軟骨分化培養(yǎng)基（500 mL DMEM 培養(yǎng)基中添加10 % FBS、1% ITS、37.5 μg/mL 維生素C、1 ng/mL 地塞米松和10 ng/mL TGF?β3）進(jìn)行誘導(dǎo)。每3 d更換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)3周后去除培養(yǎng)基。4%多聚甲醛固定10 min，用甲苯胺藍(lán)染液進(jìn)行染色。茜素紅染色：6 孔板細(xì)胞培養(yǎng)同上，然后加入成骨培養(yǎng)基（500 mL 高糖DMEM 培養(yǎng)基中添加10%FBS、100 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β?甘油磷酸鈉、50 μg/mL 維生素C 及1%雙抗）進(jìn)行誘導(dǎo)。每3 d 更換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)3 周后去除培養(yǎng)基，4 %多聚甲醛固定10 min后用茜素紅染液進(jìn)行染色。

1.4 流式分析細(xì)胞表面標(biāo)記物用PBS 緩沖液調(diào)整第3 代兔BMSCs 密度至1 × 105個(gè)/mL，將100 μL細(xì)胞樣品與1 μL FITC?PE 偶聯(lián)的抗體（CD29、CD34、CD44、CD45）在4 ℃環(huán)境中避光孵育30 min，洗滌后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建根據(jù)miR?30b 前體序列（UGUAAACAUCCUACACUCAGCUGUAAUACAU?GAAUUGGCUGGGAGGUGGAUGUUUACGUC）合成miR?30b 片段，將其克隆到帶有GFP 熒光基團(tuán)的質(zhì)粒中構(gòu)建高表達(dá)miR?30b 的慢病毒載體，然后轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞條件培養(yǎng)基，過濾后感染兔BMSCs。加入抗生素2 周后，獲得穩(wěn)定表達(dá)miR?30b 的細(xì)胞株，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光表達(dá)強(qiáng)度。

1.6 CCK?8檢測(cè)細(xì)胞活力將細(xì)胞以1×103個(gè)/孔接種在96 孔板中，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后棄去舊培養(yǎng)基，然后分別加入0、50、100、150、200 μmol/L 的CoCl2溶液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后加入10 μL CCK?8 試劑，在37 ℃環(huán)境中孵育4 h 后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的OD值。

1.7 免疫組化染色用0.25%胰蛋白酶消化兔BMSCs 離心后吸出舊培養(yǎng)基，隨后用預(yù)熱的成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀并以5×105個(gè)/mL的濃度移入15 mL 離心管中，軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基配置方法同上。室溫下1 000 rpm/min 離心5 min后擰松離心管蓋，移入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 d 置換1 次軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。培養(yǎng)21 d 后軟骨微球用4%多聚甲醛固定24 h，然后包埋在石蠟中后連續(xù)切片并用CollagenⅡ單克隆抗體進(jìn)行染色鑒定軟骨分化效果。使用Image Pro Plus 圖像分析軟件測(cè)定Collagen Ⅱ陽性表達(dá)的累積光密度值。

1.8 Western blot檢測(cè)將細(xì)胞或微球用預(yù)冷PBS溶液洗滌2 次，用含RIPA 和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液進(jìn)行勻漿裂解30 min，BCA法進(jìn)行定量，然后在4 ℃下以14 000 rpm/min 離心15 min 后收集上清蛋白質(zhì)樣品置于100 ℃水浴鍋中變性10 min。在標(biāo)準(zhǔn)條件下于凝膠轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中進(jìn)行電泳和電轉(zhuǎn)，然后將聚偏二氟乙烯膜室溫下放于5 %脫脂牛奶中封閉1 h。接著用TBST 洗滌3 次，將裁剪的膜放置于相應(yīng)的一抗中4 ℃孵育過夜，隨后洗滌3 次后放入二抗室溫孵育，1 h 后再次洗滌3 次，在避光條件下對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行曝光。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，每組數(shù)據(jù)為至少3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察通過密度梯度離心法分離的原代細(xì)胞在培養(yǎng)72 h 首次換液，鏡下細(xì)胞呈梭形分布、貼壁生長(zhǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)至90%匯合度時(shí)，鏡下細(xì)胞呈梭形生長(zhǎng)、形態(tài)均一，符合間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)特征（圖1）。

圖1 顯微鏡觀察原代細(xì)胞形態(tài)（×40）Fig.1 Primary cell morphology was observed by microscopy（×40）

2.2 兔BMSCs 表面標(biāo)記物流式鑒定及誘導(dǎo)分化檢測(cè)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第3 代兔BMSCs 細(xì)胞的表面標(biāo)記物，結(jié)果顯示原代兔BMSCs 細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD34（陽性率＞95%），低表達(dá)CD44、CD45（陽性率＜1%），見圖2A?D。此外，細(xì)胞成軟骨和成骨分化誘導(dǎo)21 d 后，甲苯胺藍(lán)染色和茜素紅染色結(jié)果表明兔BMSCs 具有良好的成軟骨和成骨分化能力，見圖2E?H。

圖2 流式分析兔BMSCs 表面標(biāo)記物及雙向誘導(dǎo)分化染色Fig.2 Flow cytometricanalysis of cell surface markers on isolated rabbit BMSCs and Histochemical staining ofrabbit BMSCs subjected to chondrogenic andosteogenic induction

2.3 低氧促進(jìn)兔BMSCs增殖通過CCK?8檢測(cè)不同濃度CoCl2溶液對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示兔BMSCs在CoCl2作用下增殖能力明顯高于對(duì)照組，以150 μmol/L作用最強(qiáng)（P＜0.01），200 μmol/L 促進(jìn)作用降低（圖3A）。Western blot結(jié)果表明CoCl2溶液能促進(jìn)兔BMSCs 表達(dá)HIF?1α，在150 μmol/L 時(shí)作用最顯著（圖3B）。

圖3 低氧促進(jìn)兔BMSCs 增殖和HIF?1α 表達(dá)Fig.3 Hypoxia promoted cells proliferation and HIF?1α expression inrabbit BMSCs

2.4 miR?30b 抑制Wnt/β?catnein 信號(hào)通路蛋白表達(dá)將兔BMSCs 分為3 組（對(duì)照組、空載組和miR?30b 轉(zhuǎn)染組）進(jìn)行轉(zhuǎn)染和篩選，擴(kuò)增培養(yǎng)后通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示空載組與miR?30b 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光強(qiáng)度均高于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染效率大于90%（圖4A?C）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，West?ern blot 結(jié)果顯示miR?30b 能抑制其靶基因SOX9的表達(dá)，此外miR?30b 還能抑制Wnt/β?catnein 信號(hào)通路中Wnt 1 及β?catnein 蛋白的表達(dá)（圖4D）。

圖4 miR?30b 抑制Wnt/β?catnein 信號(hào)通路表達(dá)Fig.4 MiR?30b inhibited the Wnt/β?catenin signaling pathway

2.5 miR?30b抑制兔BMSCs成軟骨分化過表達(dá)miR?30b 的兔BMSCs 經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 后，CollagenⅡ染色結(jié)果顯示低氧可促進(jìn)兔BMSCs 成軟骨分化，而miR?30b轉(zhuǎn)染組的CollagenⅡ染色陽性率較低氧組明顯減少，且微球組織松散（圖5A?B）。Western blot 結(jié)果顯示miR?30b 轉(zhuǎn)染組的CollagenⅡ、SOX9 表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組、誘導(dǎo)組和低氧組（圖5C）。

圖5 miR?30b 抑制兔BMSCs 成軟骨分化Fig.5 MiR?30b inhibitedchondrogenic differentiation of rabbit BMSCs

3 討論

軟骨缺損難以自我修復(fù)，表觀遺傳學(xué)調(diào)控的干細(xì)胞成軟骨分化為缺損修復(fù)提供了新思路。此外，干細(xì)胞成軟骨分化需要特殊的誘導(dǎo)環(huán)境，如何有效調(diào)控干細(xì)胞成軟骨分化是多因素調(diào)控的復(fù)雜病理生理過程［12］。本研究就miR?30b 在低氧條件下如何有效調(diào)控干細(xì)胞成軟骨分化的相關(guān)結(jié)果討論如下。

BMSCs是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞［13-15］。BMSCs 常見的供體是家兔，本研究選兔作為種子細(xì)胞供體，目的是避免不同種屬之間的免疫反應(yīng)。本研究通過密度梯度離心法分離兔骨髓中的BMSCs，并通過形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)和誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。研究結(jié)果提示兔BMSCs分離成功且具有良好的干性和成軟骨分化能力，能為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供標(biāo)準(zhǔn)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

關(guān)節(jié)軟骨缺乏血液供應(yīng)，氧氣濃度從軟骨表面到軟骨下骨存在明顯差異，最深層的氧氣濃度約1%［16-17］。研究表明低氧是間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的重要調(diào)節(jié)因素之一。KIM 等［18］發(fā)現(xiàn)低氧能增加趨化因子CXCR7 表達(dá)以維持人BMSCs 表型。LEE、HERRERA 等［19-20］研究表明低氧可增加HIF?1α、SOX9 等的表達(dá)，從而促進(jìn)脂肪MSCs 增殖和軟骨分化。低氧化學(xué)誘導(dǎo)劑CoCl2廣泛用于模擬體外低氧環(huán)境。在本實(shí)驗(yàn)中，用不同濃度CoCl2溶液誘導(dǎo)低氧環(huán)境，CCK8 和Western blot 分析該低氧環(huán)境對(duì)細(xì)胞增殖和缺氧誘導(dǎo)因子HIF?1α 表達(dá)的影響。結(jié)果表明CoCl2溶液誘導(dǎo)的低氧環(huán)境能促進(jìn)兔BMSCs 增殖和表達(dá)HIF?1α。上述結(jié)果提示CoCl2誘導(dǎo)的低氧環(huán)境能促進(jìn)兔BMSCs 增殖。

BMSCs 成軟骨分化受表觀遺傳學(xué)、信號(hào)通路和環(huán)境等因素共同調(diào)控，表觀遺傳學(xué)中的miRNAs是一類短鏈非編碼RNAs，與BMSCs 成軟骨分化密切相關(guān)，目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNAs 參與調(diào)控BMSCs成軟骨分化［21-22］。課題組前期測(cè)序結(jié)果提示miR?30b 在C3H10T1/2 細(xì)胞成軟骨分化過程中表達(dá)具有明顯差異，但其在低氧環(huán)境中能否調(diào)控兔BMSCs成軟骨分化的作用及機(jī)制尚未明確［11］。因此，本實(shí)驗(yàn)制備了過表達(dá)miR?30b 的慢病毒載體轉(zhuǎn)染兔BMSCs，并通過觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度評(píng)估轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示過表達(dá)miR?30b 組與空載組熒光強(qiáng)度均明顯高于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染效率大于90%。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，Western blot 結(jié)果顯示miR?30b 能抑制其靶基因SOX9 的表達(dá)，上述結(jié)果表明miR?30b 細(xì)胞株構(gòu)建成功。此外，還分析了miR?30b 對(duì)Wnt/β?catnein 信號(hào)通路的影響，結(jié)果表明miR?30b 還能抑制該信號(hào)通路中Wnt 1 及β?catnein 蛋白的表達(dá)。因此，推測(cè)miR?30b 可能通過影響Wnt/β?catnein 信號(hào)通路參與調(diào)控兔BMSCs 成軟骨分化。同一個(gè)靶基因也可能由多個(gè)miRNA 共同調(diào)控，miRNA 在行使功能時(shí)也會(huì)受到較廣泛的調(diào)控，有待在將來的研究中，增加更多有效的檢測(cè)指標(biāo)，并深入探討miRNA 的功能及具體調(diào)控機(jī)制。

為進(jìn)一步探索miR?30b 在低氧環(huán)境中調(diào)控兔BMSCs 成軟骨分化的作用，本研究重點(diǎn)檢測(cè)成軟骨分化的標(biāo)志性基因SOX9 和CollagenⅡ。將該細(xì)胞制備成微球后，置于低氧環(huán)境中進(jìn)行成軟骨分化誘導(dǎo)。21 d 后行CollagenⅡ染色，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比低氧明顯促進(jìn)兔BMSCs 成軟骨分化；而過表達(dá)miR?30b 的細(xì)胞成軟骨分化作用明顯減弱，Collagen Ⅱ表達(dá)量較低氧組及空載組明顯減少。此外，Western blot 結(jié)果表明過表達(dá)miR?30b 的細(xì)胞微球成軟骨誘導(dǎo)21 d 后，SOX9、CollagenⅡ的表達(dá)較對(duì)照組、低氧組及空載組明顯下調(diào)。另外，過表達(dá)miR?30b 的細(xì)胞在培養(yǎng)14 d 后，微球開始松動(dòng)，培養(yǎng)至21 d 時(shí)微球出現(xiàn)松散，推測(cè)可能是miR?30b影響了細(xì)胞分化狀態(tài)從而導(dǎo)致微球松散。上述結(jié)果提示miR?30b 參與調(diào)控兔BMSCs 成軟骨分化。本實(shí)驗(yàn)中僅利用甲苯胺藍(lán)染色、免疫組化來評(píng)估微球模型，在將來的研究中可以補(bǔ)充Alcian blue染色等多種評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。此外，本研究檢測(cè)了SOX9和CollagenⅡ兩種成軟骨分化的標(biāo)志性基因，未來可增加成軟骨分化相關(guān)標(biāo)志基因的檢測(cè)以增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果說服力。

綜上所述，本研究成功分離和鑒定了兔BMSCs，并構(gòu)建了過表達(dá)miR?30b 的細(xì)胞株，同時(shí)在體外觀察到miR?30b 可抑制兔BMSCs 在低氧環(huán)境中成軟骨分化，其機(jī)制可能與調(diào)控Wnt/β?catnein 信號(hào)通路有關(guān)。因此，miR?30b 可能是兔BMSCs 成軟骨分化的關(guān)鍵調(diào)控基因之一，但還需進(jìn)一步體內(nèi)驗(yàn)證其成軟骨分化調(diào)控作用。