聶忠莉，曾勝莉，王曉玲，蕭茂玲，黃金玉

(1.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司，四川 成都 610041)

0 引 言

他達拉非(Tadalafil)是一種口服磷酸二酯酶V型(PDE5)抑制劑，用于治療男性勃起功能障礙(MED)[1-2].他達拉非是由起始物料D-色氨酸甲酯鹽酸鹽(SM1)和胡椒醛(SM2)合成[3-5]，化學(xué)名為(6R-12aR)-6-(1,3-苯并二惡唑-5-基)-2-甲基-2,3,6,7,12,12a-六氫化吡嗪并[1′,2′-1,6]-吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮.目前對他達拉非的降解產(chǎn)物及可能存在的雜質(zhì)相關(guān)研究較少，故本研究參考相關(guān)標準中他達拉非中有關(guān)物質(zhì)的測定方法，探索高效液相色譜法將他達拉非與其11個已知雜質(zhì)(結(jié)構(gòu)見圖1)有效分離的檢測條件[6-8]，初步確定測定他達拉非中11個已知雜質(zhì)的檢測方法，并對該方法進行方法學(xué)驗證.最終利用確定的方法測定中試樣品中雜質(zhì)的含量，為控制他達拉非質(zhì)量提供依據(jù).

圖1 他達拉非及雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Agilent 1260型液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，Waters 2695型液相色譜儀(沃特世公司)，UV759CRT型紫外可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)，BP-210D型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司).

1.2 試 藥

他達拉非(批號，190501S、190502S、190503S)、雜質(zhì)L(批號，20190501S，純度為98.86%)、雜質(zhì)N(批號，20191120，純度為97.91%)，購自四川省旭暉制藥有限公司；他達拉非對照品(批號，F(xiàn)0L003，含量為99.9%)，由美國藥典委員會提供；雜質(zhì)D(批號，P-RXX-57-0，含量為98.01%)，購于深圳大力水手生物科技有限公司；雜質(zhì)F(批號，18-11-0842，含量為97.06%)、雜質(zhì)G(批號，20-08-0614，含量為97.19%)、雜質(zhì)S(批號，19-08-2804，含量為98.46%)、雜質(zhì)V(批號，19-09-2018，含量為96.72%)、雜質(zhì)W(批號，21-01-0101，含量為90.55%)，購于美國SINCO公司；雜質(zhì)I(批號，18-T03579-02，含量為96.4%)，購于加拿大RXA化學(xué)公司；雜質(zhì)K(批號，1-ALN-19-2，含量為97%)，購于加拿大TRC公司；SM2(批號，PH-18010，含量為99.92%)，購于四川惠泉生物科技有限公司；甲醇、乙腈與異丙醇為色譜純試劑；三氟乙酸為分析純試劑.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent ZORBAX SB C84.6 mm×250 mm，5 μm)，以0.1%三氟乙酸溶液為流動相A，乙腈為流動相B，按表1進行梯度洗脫；檢測波長為285nm，柱溫為40℃，樣品盤溫度為5℃，流速為1.0 mL/min,進樣體積20μL.

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液

取本品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL含1.0 mg的溶液.

2.2.2 對照品溶液

精密稱取他達拉非雜質(zhì)F、雜質(zhì)D、雜質(zhì)I、雜質(zhì)G、SM2、雜質(zhì)K、雜質(zhì)L、雜質(zhì)V、雜質(zhì)S、雜質(zhì)W及雜質(zhì)N適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含SM2、雜質(zhì)V、雜質(zhì)S和雜質(zhì)W各約0.5 μg，其余雜質(zhì)各約含1.0 μg的混合溶液.

2.2.3 對照溶液

精密量取他達拉非供試品溶液0.1 mL，加甲醇定量稀釋至100 mL，制成每1 mL中含他達拉非1.0 μg的對照溶液.

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液

精密量取他達拉非對照品及他達拉非雜質(zhì)A適量，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中含他達拉非對照品1 mg和他達拉非雜質(zhì)A 1 μg的混合溶液.

2.3 系統(tǒng)適用性要求

在系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中，他達拉非與雜質(zhì)A依次出峰，理論塔板數(shù)按他達拉非峰計算不得低于5 000，他達拉非峰與雜質(zhì)A峰之間的分離度應(yīng)大于3.0.取“2.2.3”項下的對照溶液20 μL注入高效液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使色譜圖中他達拉非的峰高約為滿量程的20%.

2.4 專屬性試驗

按“2.1”項下的色譜條件，對他達拉非(批號190501S)強制降解試驗后的樣品進行測定，結(jié)果見表2.

表2 專屬性試驗結(jié)果

由表2可知，空白不干擾樣品測定，他達拉非較穩(wěn)定，僅在酸與堿破壞條件下產(chǎn)生降解雜質(zhì)，且主要降解雜質(zhì)為雜質(zhì)A(異構(gòu)體測定項下控制).主成分峰與雜質(zhì)峰分離度較好，主峰純度符合要求，破壞后各樣品的物料平衡均在90%～110%之間，表明方法專屬性較好.

2.5 檢測限與定量限

取“2.2.2”項下的混合溶液適量，用甲醇稀釋至一定濃度，取此溶液按“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，同時走空白基線，以儀器基線噪音3倍峰高作為檢測限，儀器基線噪音10倍峰高作為定量限，得各雜質(zhì)的檢測限與定量限，結(jié)果見表3.

表3 檢測限與定量限測定結(jié)果

2.6 線性范圍

研究各雜質(zhì)在10%-1 000% 濃度范圍內(nèi)，各雜質(zhì)峰面積與濃度之間的線性關(guān)系，結(jié)果見表4.

表4 線性范圍測定結(jié)果

2.7 回收率

精密稱取11份他達拉非樣品，其中2份加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL約含1 mg的溶液，作為空白供試品溶液，另9份分別加入50%、100%與150%限度濃度的已知雜質(zhì)，每個濃度配制3份供試品溶液，測定樣品中各雜質(zhì)的含量，計算回收率及RSD值，結(jié)果見表5，各雜質(zhì)回收率良好.

表5 雜質(zhì)平均回收率

2.8 精密度

他達拉非原料中不含已知雜質(zhì)F、雜質(zhì)D、雜質(zhì)I、雜質(zhì)G、SM2、雜質(zhì)K、雜質(zhì)L、雜質(zhì)V、雜質(zhì)S、雜質(zhì)W及雜質(zhì)N，重復(fù)性試驗采用加樣方式，測定重復(fù)6份樣品中各雜質(zhì)含量的變異程度，結(jié)果6份樣品中各已知雜質(zhì)含量RSD分別為2.49%、3.35%、4.09%、6.78%、1.02%、2.10%、2.26%、1.65%、1.00%、1.26%及1.87%，重復(fù)性試驗良好.

由甲、乙兩位研究員在不同儀器、不同時間上對同一批號樣品測定12次，各雜質(zhì)平均含量的RSD分別為2.27%、2.53%、3.28%、6.24%、1.73%、2.48%、2.24%、2.88%、1.44%、4.57%及1.84%，中間精密度良好.

2.9 耐用性

按“2.1”項下的色譜條件，在流速、柱溫以及流動相中三氟乙酸的量發(fā)生微小改變時，對加樣樣品進行測定，結(jié)果顯示，樣品中雜質(zhì)個數(shù)和雜質(zhì)量以及各成分峰之間的分離度與原條件幾乎無變化.當更換成不同型號色譜柱時，他達拉非峰與雜質(zhì)峰、雜質(zhì)峰與雜質(zhì)峰之間的分離度未符合要求，由此可知，在色譜柱不發(fā)生變化的情況下，本方法的耐用性能良好.

2.10 樣品測定

分別取3批他達拉菲中試樣品，按“2.2”項下的方法配制供試品溶液和對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件下進行測定，記錄色譜圖，按外標法計算樣品中11種雜質(zhì)的含量，結(jié)果見表6.

表6 3批中試樣品中11種雜質(zhì)的檢測結(jié)果

3 討 論

在對測定波長進行考察時，他達拉非及他達拉非各雜質(zhì)都具有不同的紫外特征峰，但在285 nm附近均有吸收，參考相關(guān)標準及文獻有關(guān)物質(zhì)的檢測波長，最終選擇285 nm作為本品有關(guān)物質(zhì)的檢測波長[9].

本研究對稀釋劑進行了篩選，分別采用50%乙腈、乙腈、甲醇以及乙腈—異丙醇(1∶1)等溶劑溶解并稀釋制成每1 mL含雜質(zhì)各約1 μg，他達拉非1 mg的混合溶液，作為系統(tǒng)溶液，進樣測定.結(jié)果在純乙腈和乙腈—異丙醇(1∶1)體系中，各雜質(zhì)峰型較差，理論板數(shù)低.取系統(tǒng)溶液在50%乙腈和甲醇溶劑中分別于不同時間進樣測定，考察峰面積變化情況，結(jié)果雜質(zhì)H和雜質(zhì)W的峰面積均呈逐漸下降趨勢，控制樣品盤溫度在5℃可以減緩下降趨勢，在甲醇中的穩(wěn)定性略優(yōu)于50%乙腈，因此選擇甲醇作為本品的稀釋劑.