李 孛， 王小勇， 鄭冰倩

肺癌是中國(guó)最常見的惡性腫瘤和腫瘤相關(guān)性死因[1]，其中肺鱗癌(lung squamous cell cancer，LUSC)約占2/3。60%以上的肺癌患者初診時(shí)已處于中晚期[2]，常發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，約占35%[3]。肺癌骨轉(zhuǎn)移的骨骼相關(guān)事件，如病理性骨折、骨痛、脊髓壓迫癥狀和高鈣血癥等，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量[4]。雙膦酸鹽的使用雖然在一定程度上延遲了骨骼的破壞，但因無法促進(jìn)新骨骼形成，治療效果并不理想[5]。因此，尋找與肺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的無創(chuàng)標(biāo)記物，以預(yù)測(cè)LUSC的骨轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后，并探討其機(jī)制，可為肺癌骨轉(zhuǎn)移的治療提供理論參考。

基于高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分子靶標(biāo)篩選，尋求肺癌骨轉(zhuǎn)移的個(gè)體化標(biāo)記物，是目前的熱點(diǎn)議題[6]。但關(guān)于該領(lǐng)域的研究均基于組織水平，尚缺乏無創(chuàng)血漿標(biāo)記物的高通量測(cè)序探索。此外，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過200 nt的非編碼RNA，可從表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等水平參與癌癥的發(fā)生。目前有較多關(guān)于lncRNA在肺癌中預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值的探索[7]，但尚無關(guān)于lncRNA在肺癌骨轉(zhuǎn)移中的相關(guān)組學(xué)研究。本研究首先通過血漿lncRNA測(cè)序篩選LUSC骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)無創(chuàng)分子標(biāo)記物，并選擇MIR4697HG進(jìn)行驗(yàn)證，通過生物信息學(xué)手段初步鑒定其預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值和生物學(xué)機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 回顧性收集2014年2月-2020年10月就診的LUSC患者58例，男性41例，女性17例，中位年齡52歲(24～76歲)，美國(guó)東部腫瘤合作組(eastern cooperative group, ECOG)評(píng)分均<2分，無骨轉(zhuǎn)移41例，骨轉(zhuǎn)移17例，其中無骨轉(zhuǎn)移組均無其他部位轉(zhuǎn)移；骨轉(zhuǎn)移組5例為單處骨轉(zhuǎn)移，12例為多處骨轉(zhuǎn)移，最常見轉(zhuǎn)移部位為肋骨(8例，47.1%)，合并其他部位轉(zhuǎn)移13例(76.4%)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理確診LUSC；(2)血漿標(biāo)本質(zhì)量合格。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他病理類型的肺癌；(2)合并多原發(fā)癌或其他惡性腫瘤。

1.2 方法

1.2.1 試劑和設(shè)備 基因芯片[nrStarTMHuman Functional lncRNA PCR Array，中國(guó)數(shù)譜(上海)生物科技有限公司]；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Multiskan Sky，美國(guó)Thermofisher公司)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(MA-6000，中國(guó)蘇州雅睿生物技術(shù)有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)、熒光定量試劑盒(SYBR Premix ExTaq II Kit)(日本TaKaRa公司)。

1.2.2 lncRNA芯片檢測(cè)和RT-PCR驗(yàn)證 采集患者清晨空腹外周血5 mL作為血漿標(biāo)本加入離心管。首先選擇3對(duì)骨轉(zhuǎn)移與非骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本進(jìn)行l(wèi)ncRNA測(cè)序，4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，吸取上清轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管中，按照TRIzol試劑盒說明書提取血漿樣本總RNA，并定量測(cè)定RNA濃度和純度。當(dāng)OD260 nm/OD280 nm為1.9～2.1時(shí)進(jìn)行進(jìn)一步分析，差異lncRNA的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。進(jìn)一步挑選MIR4697HG在血漿樣本中進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄提取RNA后進(jìn)行RT-PCR，以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析和預(yù)測(cè) 登錄GEPIA在線網(wǎng)站，對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行可視化分析，觀察MIR4697HG在人體組織中的表達(dá)分布情況，并進(jìn)行泛癌癥分析，觀察MIR4697HG在不同癌癥中的差異表達(dá)情況，最后驗(yàn)證MIR4697HG在LUSC中的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，并基于TCGA矩陣篩選與MIR4697HG存在共表達(dá)的基因(前200名)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。

1.2.4 lncRNA靶基因信號(hào)通路分析 采用DAVID Bioinformatics Resources 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)MIR4697HG的共表達(dá)基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。通過繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)，判斷血漿MIR4697HG表達(dá)水平對(duì)骨轉(zhuǎn)移LUSC的預(yù)測(cè)效能，并通過計(jì)算約登指數(shù)，尋找血漿MIR4697HG預(yù)測(cè)肺癌骨轉(zhuǎn)移的最佳截點(diǎn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖，并采用log-rank法進(jìn)行比較。P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA測(cè)序 對(duì)3對(duì)骨轉(zhuǎn)移與非骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本進(jìn)行l(wèi)ncRNA測(cè)序，共篩選出456個(gè)差異lncRNA(表1)，其中上調(diào)lncRNA 156個(gè)，下調(diào)lncRNA 300個(gè)。選擇P值最低的MIR4697HG(log2FC：-3.331 52)進(jìn)一步分析。

表1 血漿lncRNA表達(dá)譜差異分析(排名前10位的基因)

2.2 MIR4697HG的低通量外部驗(yàn)證 qPCR驗(yàn)證結(jié)果提示，無骨轉(zhuǎn)移組的血漿MIR4697HG表達(dá)水平高于骨轉(zhuǎn)移組[(0.13±0.04)vs(0.08±0.03)，P<0.000 1，圖1]。ROC曲線分析提示，血漿MIR4697HG表達(dá)水平預(yù)測(cè)骨轉(zhuǎn)移的曲線下面積為0.876，靈敏度為92.7%，特異度為76.5%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為79.8%，陰性預(yù)測(cè)值91.3%，計(jì)算約登指數(shù)決定最佳截點(diǎn)為0.087 9(圖2)。

圖1 血漿MIR4697HG在骨轉(zhuǎn)移和非骨轉(zhuǎn)移組的差異表達(dá)Fig.1 The differential expression of plasma MIR4697HG between bone metastasis and non bone metastasis groups

圖2 血漿MIR4697HG預(yù)測(cè)肺癌骨轉(zhuǎn)移的ROC曲線分析和最佳截點(diǎn)設(shè)置Fig.2 ROC curve analysis and optimal cut-off point setting of plasma MIR4697HG in predicting bone metastasis of lung cancer

2.3 MIR4697HG在LUSC的預(yù)后價(jià)值 采用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行MIR4697HG的組織分布和泛癌癥分析(圖3)，MIR4697HG主要表達(dá)在正常腦組織和結(jié)直腸組織中，在正常肺組織和乳腺組織中亦有中度表達(dá)。泛癌癥分析發(fā)現(xiàn)，MIR4697HG在多種癌癥中呈低表達(dá)，可能行使廣泛的抑癌基因角色。

圖3 MIR4697HG的組織分布和泛癌癥分析Fig.3 Tissue distribution and Pan-cancer analysis of MIR4697HG

選擇TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的LUSC數(shù)據(jù)集進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著LUSC分期的升高，MIR4697HG的表達(dá)逐漸下降(圖4)，且低表達(dá)的肺癌患者，無病生存率和總生存率均較低(圖5)。

圖4 MIR4697HG在不同肺鱗癌分期的表達(dá)模式Fig.4 Expression pattern of MIR4697HG in different stages of lung squamous cell carcinoma

A：無病生存率；B：總生存率。圖5 MIR4697HG高表達(dá)組和低表達(dá)組的生存分析Fig.5 Survival analysis of MIR4697HG high expression group and low expression group

2.4 MIR4697HG的生物學(xué)功能初探 通過共表達(dá)基因?qū)ふ襇IR4697HG的靶基因，前200名基因中共70個(gè)編碼基因，運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)MIR4697HG的靶基因進(jìn)行信號(hào)通路分析，結(jié)果提示主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用信號(hào)通路上(P=0.003 4)。

3 討 論

骨轉(zhuǎn)移是LUSC最常見的轉(zhuǎn)移部位之一，總體預(yù)后較差。一項(xiàng)納入356例肺癌患者的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，骨轉(zhuǎn)移最常見的部位是肋骨，其中位生存率僅12.5個(gè)月，1 a生存率僅為50.8%，而肺癌骨轉(zhuǎn)移數(shù)量、ECOG評(píng)分、雙膦酸鹽治療以及血清鈣、血清乳酸脫氫酶和堿性磷酸酶與預(yù)后顯著相關(guān)[9]。尋找LUSC骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的無創(chuàng)預(yù)測(cè)標(biāo)記物和預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)記物，能夠篩選高?；颊?，進(jìn)行個(gè)體化干預(yù)。

Zhang等[10]在組織學(xué)水平鑒定了LUSC的差異表達(dá)lncRNA、miRNA和mRNA，有助于研究肺癌發(fā)生的分子機(jī)制和探索預(yù)后生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。本研究通過血漿lncRNA組學(xué)分析，高通量鑒定LUSC骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA，共篩選出456個(gè)差異lncRNA，有助于為今后相關(guān)分子標(biāo)記物的研究提供參考。一些排名靠前的標(biāo)記物lncRNA分子，如TM4SF1-AS1(排名第2)，已被證實(shí)能夠激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[11]；而ABHD11-AS1(排名第3)可被m6a轉(zhuǎn)移酶METTL3所誘導(dǎo)而上調(diào)，從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的Warburg效應(yīng)[12]。

根據(jù)組學(xué)結(jié)果，本研究進(jìn)一步采用MIR4697HG進(jìn)行擴(kuò)大樣本低通量驗(yàn)證。由于回顧性研究難免存在病例脫落現(xiàn)象，納入本研究的58例患者雖為非連續(xù)病例，但患者的基線資料(年齡、性別、ECOG評(píng)分、骨轉(zhuǎn)移率等)與既往文獻(xiàn)報(bào)道相仿，具有代表性[4]。本研究進(jìn)一步證實(shí)無骨轉(zhuǎn)移組血漿MIR4697HG的表達(dá)水平高于骨轉(zhuǎn)移組。ROC曲線分析提示，血漿MIR4697HG表達(dá)水平預(yù)測(cè)骨轉(zhuǎn)移的曲線下面積為0.876，靈敏度92.7%，特異度76.5%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值79.8%，陰性預(yù)測(cè)值91.3%，具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。目前尚缺乏MIR4697HG在肺癌中的體外研究。Mao等[13]和Bady等[14]發(fā)現(xiàn)，RAD21抑制腫瘤抑制因子MIR4697HG的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的發(fā)生，且RAD21表達(dá)與膠質(zhì)瘤的預(yù)后相關(guān)。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，MIR4697HG在肺組織中中度表達(dá)，其低表達(dá)與肺癌患者不良腫瘤學(xué)預(yù)后有關(guān)，提示MIR4697HG在LUSC中扮演抑癌基因角色。進(jìn)一步的泛癌癥分析發(fā)現(xiàn)，MIR4697HG是一個(gè)普遍抑癌分子。

本研究的靶基因信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，MIR4697HG的靶基因主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用信號(hào)通路上。細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用信號(hào)通路是多種癌癥，包括胃癌[15]、肺癌[16]、肝癌[17]等進(jìn)行細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的重要過程。雖然目前尚無關(guān)于MIR4697HG在肺癌中作用機(jī)制的相關(guān)研究，但Zhang等[18]的體外研究發(fā)現(xiàn)，MIR4697HG敲除可導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶-9、磷酸化ERK和磷酸化AKT水平下降，提示MIR4697HG可通過影響細(xì)胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移過程。但因本研究樣本量小，故該結(jié)論需要設(shè)計(jì)優(yōu)良的大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，本研究通過本中心血漿樣本和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選了血漿MIR4697HG作為L(zhǎng)USC的預(yù)測(cè)因子和預(yù)后因子。