孟凌云 陳 靜 山東省泰安市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 7000； 山東第一醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)為全球高發(fā)惡性腫瘤，位于致死性疾病前列[1]。與其相關(guān)的研究一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，肝臟是機(jī)體主要的代謝場(chǎng)所，其產(chǎn)生的亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylene tetraphydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，不可逆的催化5,10-亞甲基四氫葉酸(5,10-MTHF)還原為5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)，后者可以進(jìn)一步進(jìn)入甲基循環(huán)通路，通過(guò)同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)的重新甲基化過(guò)程間接為DNA甲基化和蛋白質(zhì)甲基化提供甲基，并且使血液中的同型半胱氨酸維持在一個(gè)較低的水平。并且已有研究證實(shí)HCY水平與基因多態(tài)性是具有相關(guān)性的[2]。在與其相關(guān)的眾多基因中，MTHFR C677T的突變是最常見(jiàn)的，會(huì)使得亞甲基四氫葉酸還原酶活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致Hcy升高[3]。雖然之前有對(duì)HCC患者的葉酸、Hcy水平的相關(guān)研究，但是并沒(méi)有明確說(shuō)明其與基因突變之間的關(guān)系，并且有研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性與HCC的相關(guān)性不盡相同[4-5]，推測(cè)其會(huì)受到地域、民族等因素的影響。為了進(jìn)一步明確葉酸、Hcy及MTHFR C677T基因多態(tài)性與HCC患者的相關(guān)性，本文對(duì)HCC患者與上述三者的相關(guān)性進(jìn)行研究，旨在為臨床診斷及預(yù)防HCC提供理論性指導(dǎo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年10月—2020年10月于泰安市中心醫(yī)院新診斷為原發(fā)性肝細(xì)胞癌(病理診斷明確)的患者(未行化療、放療及其他藥物治療)85例為HCC組，選取同一時(shí)期該醫(yī)院查體中心的健康人員85例為健康對(duì)照組。采樣前均告知患者家屬檢查方法及流程，并征得同意簽署知情同意書(shū)，同時(shí)此項(xiàng)研究已取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 血清葉酸及Hcy水平檢測(cè)：兩組受試者均于清晨空腹采取肘靜脈血樣，經(jīng)高速離心后取血清保存，以備后續(xù)檢測(cè)葉酸及Hcy水平并進(jìn)行基因組DNA的提取。血清葉酸采用德國(guó)羅氏601系列全自動(dòng)免疫發(fā)光分析儀；Hcy檢測(cè)采用德國(guó)羅氏8000全自動(dòng)生化分析儀。所有試劑為進(jìn)口配套試劑，質(zhì)控合格后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測(cè)：收集受試者的外周血，提取樣本中DNA。采用 Taqman-MGB 方法測(cè)定各基因位點(diǎn)的SNP分型，相關(guān)儀器和試劑均購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)AB公司。對(duì)MTHFR C667T位點(diǎn)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。每個(gè)PCR反應(yīng)體系共計(jì)為10μl，其中加入3.5μl去離子水，1μl濃度為20ng/μl的DNA模板，0.5μl 的20×Taqman-MGB探針，5μl 的2×Taqman Universal Master Mix。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10min，92℃變性15s，60℃延伸1min，20個(gè)循環(huán)；89℃變性15s，60℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，把各反應(yīng)孔放置于VIIA7DX 型高通量熒光定量 PCR 儀上，分別讀取各反應(yīng)孔的終點(diǎn)熒光，然后利用分析軟件檢測(cè)位點(diǎn)中的基因分型。

2 結(jié)果

2.1 兩組葉酸及Hcy水平比較 HCC組葉酸水平低于健康對(duì)照組，Hcy水平顯著高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 兩組血清葉酸及Hcy水平比較

2.2 兩組MTHFR C677T基因多態(tài)性及等位基因頻率比較 HCC組TT型分布率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；HCC組T基因頻率升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 兩組MTHFRC677T基因多態(tài)性及等位基因頻率比較(n)

2.3 MTHFR C677T不同基因型葉酸及Hcy水平比較 TT型Hcy水平明顯高于CT及CC型，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而三種基因型間葉酸水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同基因型葉酸及Hcy水平比較

3 討論

原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)病率和死亡率居于癌癥前列，并且我國(guó)的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者占全球總數(shù)的一半以上[6]，近年來(lái)有很多有關(guān)其致病因素的研究，主要集中在生活環(huán)境、飲食習(xí)慣及病毒感染等方面[7]，而最新的研究顯示葉酸水平的降低與肝癌發(fā)生進(jìn)展相關(guān)[8].葉酸的代謝是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，已經(jīng)有研究證實(shí)其與基因MTHFR C677T的多態(tài)性是相關(guān)的[9]，而且其代謝過(guò)程會(huì)影響HCY的水平[10]。但是并沒(méi)有研究探討過(guò)其與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的直接相關(guān)性。

國(guó)人由于喜食熟食及吸煙飲酒等不良習(xí)慣原因，容易導(dǎo)致缺乏葉酸、維生素B6和B12[11]，而葉酸水平降低則會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)同型半胱氨酸的蓄積。Hcy是體內(nèi)蛋氨酸(SAM)循環(huán)的中間產(chǎn)物，而SAM是甲基重要供體，影響DNA甲基化和修復(fù)。Hcy蓄積，影響DNA的穩(wěn)定性，異常甲基化，造成基因序列的改變，包括原癌基因激活或者抑癌基因的失活，增加惡性腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)[12]。本研究結(jié)果顯示，HCC組葉酸水平明顯低于健康對(duì)照組，而Hcy水平高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與既往研究結(jié)果一致。說(shuō)明對(duì)于原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者來(lái)說(shuō)，重視葉酸攝入水平，對(duì)于肝癌的預(yù)防至關(guān)重要，同時(shí)，Hcy水平的升高作為患者罹患肝癌的重要指標(biāo)，應(yīng)值得重視。本次研究中，MTHFR C677T基因在HCC組中TT型分布率顯著升高，T基因頻率升高，MTHFR基因的C677T位點(diǎn)突變最為常見(jiàn)，會(huì)降低亞甲基四氫葉酸還原酶的活性和熱穩(wěn)定性，繼而影響體內(nèi)葉酸代謝，使 Hcy甲基化過(guò)程受阻導(dǎo)致同型半胱氨酸在血漿中水平升高。該酶最常見(jiàn)的基因突變位點(diǎn)是rs1801133的C到T的突變，即TT突變型較CC野生型使得酶的活性顯著下降，引起葉酸合成減少，而葉酸的缺乏導(dǎo)致基因不穩(wěn)定性增加和甲基化障礙，與腫瘤的發(fā)生有相關(guān)性。另外，本研究對(duì)MTHFR C677T的不同基因型的葉酸及Hcy水平進(jìn)行了具體研究，通過(guò)與其他基因型比較發(fā)現(xiàn)，TT型的Hcy水平顯著升高，然而不同基因型間葉酸水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與原永明等人[13]的研究結(jié)論相似。既然原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的MTHFR基因型及葉酸和Hcy水平會(huì)存在異常，那么檢測(cè)具有原發(fā)性肝細(xì)胞癌傾向人群的MTHFR基因型及葉酸和Hcy水平，對(duì)于及早預(yù)防肝癌是有幫助的。目前肝癌的治療方式，不僅局限于肝臟移植，靶向治療[14]及基因治療[15]也成為HCC治療的新方向。該研究通過(guò)基因型的檢測(cè)只能間接地反映酶的相對(duì)活性，并沒(méi)有對(duì)實(shí)際的酶活性進(jìn)行測(cè)定，因此通過(guò)分析該酶血清含量及基因型反映的相對(duì)酶活性與 HCY 水平的關(guān)聯(lián)性，解釋該酶與 HCY 水平的關(guān)系可能存在一定的局限性。

綜上所述，原發(fā)性肝細(xì)胞癌傾向人群做MTHFR基因型及葉酸和Hcy水平檢測(cè)，對(duì)于及早預(yù)防肝癌有一定的幫助。但本研究屬于醫(yī)院內(nèi)病例對(duì)照研究，樣本偏少，可能存在選擇偏倚的情況，因此后續(xù)還需要進(jìn)行較大規(guī)模的普查研究，以進(jìn)一步證實(shí)研究結(jié)論及進(jìn)行更深入的探討。