楊 林 河南省濮陽市油田總醫(yī)院醫(yī)學檢驗科 457000

乙型肝炎是一種因嗜肝DNA病毒所引起的病變，經(jīng)研究統(tǒng)計，每年約有100萬人死于HBV感染所致的原發(fā)性肝癌和肝硬化，目前感染機制尚未明確，但抑制HBV病毒復制是解決感染慢性化的重要課題[1]。自噬可作為一種防御機制，防止外來物質(zhì)入侵，可降解細胞內(nèi)受損細胞器和多余蛋白質(zhì)，維持細胞正常生命活動，常規(guī)情況下，細胞均存在一個自噬基礎水平，一旦機體處于蛋白質(zhì)蓄積、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、病毒感染、饑餓等狀態(tài)，自噬便會利用自身成分獲得能量，進行自我保護[2]。自噬基因Atg7、LC3是自噬過程中的泛素連接酶，不僅與造血干細胞維持、脂肪分化、線粒體自噬、軸突膜運輸?shù)扔嘘P(guān)，還在代謝應激中調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡中具有一定作用性[3]。而本文進一步探索了慢性乙型肝炎肝組織中Atg7、LC3水平對HBV復制水平的影響，報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2018年3月—2020年5月140例慢性乙型肝炎患者(觀察組)、140例健康體檢者(對照組)為試驗對象。觀察組男81例，女59例，年齡30～65歲，平均年齡(48.45±11.12)歲。對照組男82例，女58例，年齡31～66歲，平均年齡(48.29±11.36)歲。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。納入標準：(1)各項資料齊全，且自愿加入本次實驗；(2)觀察組有乙型肝炎病史，且HBsAg陽性。排除標準：(1)合并腎臟疾病者；(2)存在代謝性肝病、酒精性肝病者；(3)存在自身免疫性肝病或藥物性肝損傷者；(4)合并其他病毒感染者。

1.2 篩查方法 篩查方式：細胞培養(yǎng)：細胞系Huh7、LC3，條件5% CO2和37℃，完全培養(yǎng)基為10%胎牛血清的DMEM。Atg7、LC3表達與模型建立：取細胞鋪6孔板，其中敲減組合Atg7、LC3過表達組分別采用對照質(zhì)粒及pcDNA3.1-HIS-c-Atg7、LC3質(zhì)粒，RNA應用3000轉(zhuǎn)染細胞，48h后分別進行EBSS北楊集處理，分析HBV病毒載量。免疫熒光：對石蠟切片進行脫蠟、抗原修復，甲醛(4%)固定15min，3次PBS洗滌，在室溫打孔10min，3次PBS洗滌，運用3%BSA和1%羊血清的封閉液室溫封閉1h，一抗4℃過夜，洗滌后，二抗避光1h，含有DAPI封片。HBV病毒載量測定：收集上清液，混勻樣本稀釋劑5μl,室溫狀態(tài)下靜置10min，加入病毒核酸定量測試盒40μl PCR混合液，離心30s，2 000r/min，用儀器(ABI VII7)完成PCR擴增，具體方法按照說明書進行。

1.3 觀察指標 (1)對比兩組自噬相關(guān)蛋白7(Atg7)、LC3、HBV-DNA水平；(2)經(jīng)Pearson法分析慢性乙型肝炎發(fā)生與Atg7、LC3、HBV-DNA相關(guān)性以及HBV-DNA與Atg7、LC3相關(guān)性；(3)據(jù)AUC及標準誤評判各類篩查方式(Atg7、LC3及聯(lián)合)的預測價值。

2 結(jié)果

2.1 對比兩組各項指標 觀察組Atg7、LC3、HBV-DNA水平高于對照組(P<0.05)。如表1所示。

表1 兩組各項指標對比

2.2 分析各項指標之間相關(guān)性 慢性乙型肝炎發(fā)生與Atg7、LC3、HBV-DNA呈負相關(guān)性(P<0.05)；HBV-DNA與Atg7、LC3呈正相關(guān)性(P<0.05)。如表2所示。

表2 各項指標之間相關(guān)性分析

2.3 預測價值分析 預測價值分析顯示，Atg7篩查預測的AUC為0.814，LC3篩查預測的AUC為0.845，Atg7聯(lián)合LC3篩查預測的AUC為0.914。依據(jù)AUC及標準誤，采用Z檢驗AUC差異。如LC3與Atg7的AUC比較：Z=(0.845-0.814)/(0.035×0.035+0.041×0.041)0.5=0.575，P值=[1-NORMSDIST(0.575)]×2=0.564。聯(lián)合與LC3的AUC比較：Z=(0.914-0.845)/(0.009×0.009+0.035×0.035)0.5=1.909，P值=[1-NORMSDIST(1.909)]×2=0.056。聯(lián)合與Atg7的AUC比較：Z=(0.914-0.845)/(0.009×0.009+0.041×0.041)0.5=1.644，P值=[1-NORMSDIST(1.644)]×2=0.100。如表3所示。

表3 Atg7、LC3及聯(lián)合篩查預測HBV復制水平高表達價值

3 討論

自噬在病原體感染時，可影響炎性因子對外來病原微生物應答敏感性和下調(diào)干擾素對病毒感染，抑制促炎因子分泌和形成，但隨著相關(guān)研究增多，學者發(fā)現(xiàn)甲型流感病毒、柯薩奇病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒能夠通過此過程進行復制[4]。HBV便是引起干細胞自噬主要原因，HBV可通過乙肝病毒小表面蛋白，促使自噬體形成，利用溶酶體途徑自噬調(diào)節(jié)自身分泌，而自噬可參與HBV復制過程，此為一項惡性循環(huán)，為了更好控制HBV復制，還需探索自噬基因?qū)BV復制過程的預判和影響[5]。

Atg7屬于一種關(guān)鍵酶，在自噬體形成期間參與了Atg8-PE和Atg12-Atg5-Atg16L1兩個關(guān)鍵自噬復合體形成[6]。在2018年一項實驗中，學者發(fā)現(xiàn)Atg復合體能夠干擾HBV病毒形成，減少病毒產(chǎn)量。在本次結(jié)果中，觀察組Atg7高于對照組，說明，乙型肝炎患者可因肝組織受損和肝功能減弱，導致自噬水平被激活，出現(xiàn)明顯自噬Atg7基因改變，而HBV-DNA與Atg7呈正相關(guān)性，說明HBV高表達與Atg7存在一定相關(guān)。LC3屬于自噬相關(guān)的蛋白，是一種能夠反映自噬起始階段的分子標志物，常分為兩個亞型，即LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ型，當機體發(fā)生自噬時，LC3-Ⅰ可出現(xiàn)脂質(zhì)化變化，并形成LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ能夠與自噬體膜上磷脂酰乙醇胺結(jié)合，定位在體膜上，含量與自噬體數(shù)量相等。本次結(jié)果中，觀察組LC3高于對照組，說明乙型肝炎患者在出現(xiàn)自噬體降解減少時，可影響溶酶體和自噬體融合，導致自噬體數(shù)量明顯增加[7]。經(jīng)Pearson法分析，HBV高表達與Atg7呈負相關(guān)性，說明HBV高表達與多種自噬基因均存在相關(guān)性。經(jīng)ROC曲線分析，LC3篩查預測的AUC為0.845，Atg7篩查預測的AUC為0.814，Atg7聯(lián)合LC3篩查預測的AUC為0.914，說明聯(lián)合Atg7、LC3篩查更能夠反映HBV復制狀態(tài)。

綜上所述，機體在合并HBV感染后，可引起Atg7、LC3表達增加，早期篩查Atg7、LC3水平，可預測HBV復制高表達情況，盡早預判疾病發(fā)生、發(fā)展，便于臨床診療。