霍子奇，張賀惟，韓文超，柏 爽，閆 磊

（長春祈健生物制品有限公司，吉林 長春130012）

生物制藥行業(yè)的發(fā)展與生產(chǎn)技術(shù)有直接關(guān)聯(lián)，在多種生物制藥技術(shù)的輔助下，提升中國生物制藥的水平。真空冷凍干燥技術(shù)在水痘減毒活疫苗中的運用可提升其使用效果，延長保存時間，有效提升凍干工藝使用質(zhì)量，有利于制藥行業(yè)的發(fā)展。

1 凍干的原理

水可以分成三相，分別是氣態(tài)、液態(tài)與固態(tài)，結(jié)合熱力學(xué)有關(guān)知識理論能夠知道，壓力的降低可以促使水的冰點與沸點之間相互重合。然后采用加熱的處理方法，冰便會從液態(tài)直接經(jīng)過升華過程變?yōu)闅鈶B(tài)。凍干過程的原理便是應(yīng)用低壓低溫狀態(tài)下水三相的具體變化，首先針對需要進行干燥處理的物料予以降溫凍結(jié)處理，令物料中以液態(tài)形式存在的水可以變?yōu)橐怨虘B(tài)存在的冰，之后在真空的狀況下針對物料實施相應(yīng)的加熱處理，這樣冰會直接升華變?yōu)樗魵舛鴱闹谐?，便可以獲取低溫脫水相應(yīng)的干燥制品。一個比較典型的冷凍干燥工藝過程，通?？梢苑殖珊銐航禍亍⒑銣亟祲汉秃銣厣郎貛讉€熱力學(xué)過程。

2 水痘減毒活疫苗在凍干工藝上存在的問題

近幾年生物制藥技術(shù)快速發(fā)展，不斷產(chǎn)生新的多肽蛋白類藥物，可運用于臨床中的蛋白酶、疫苗、多肽與脂質(zhì)體等成為研發(fā)重點。而這些藥物有個共性問題，就是都屬于熱敏性藥品，為了防止熱敏性藥物在生產(chǎn)過程中溫度過高而對藥物產(chǎn)生不利的影響，同時也便于藥物的運輸及儲存，目前使用冷凍干燥法將其制備成固態(tài)的藥品[1]，經(jīng)歷幾十年的發(fā)展，藥物冷凍干燥技術(shù)已經(jīng)有了很大的進步，但仍然存在問題[2]，例如在冷凍干燥的時候會產(chǎn)生多種干燥與凍結(jié)應(yīng)力，因此也會令藥物產(chǎn)生變形和外觀的完整性受損。另外凍干法自身也有干燥時間長、速率低于能源損耗高的情況。借此為了提升藥物的穩(wěn)定性，需加強對凍干工藝的優(yōu)化。除此之外，水痘減毒活疫苗為凍干注射劑，滴度不好保持，且在自由細胞懸浮液中不穩(wěn)定，以凍干工藝，進行大規(guī)模生產(chǎn)時候若不能科學(xué)控制，都會導(dǎo)致水痘減毒活疫苗中滴度、水分、真空度、外觀（萎縮：整體縮小、下沉、缺肉）等多種指標低或者不合格，因此在水痘減毒活疫苗生產(chǎn)中，使用真空冷凍干燥技術(shù)意義重大。

3 凍干參數(shù)的設(shè)計

凍干參數(shù)的設(shè)計會受到眾多方面因素的影響，由于文章篇幅比較有限，這里簡要列舉其中一些影響因素。

3.1 凍結(jié)方式的影響

關(guān)于凍結(jié)方式，可以分成兩種不同類型，分別是全域過冷結(jié)晶和定向結(jié)晶。采用不相同的凍結(jié)方式，其形成冰晶的形態(tài)及大小也會存在一定的差異，同時也會導(dǎo)致制劑相應(yīng)的干燥速度與凍干質(zhì)量受到一定影響，因此應(yīng)用良好的凍結(jié)方式是極為關(guān)鍵的。全域過冷結(jié)晶指的是所有的溶液在處在相同或是相近的過冷溫度狀態(tài)下實施凍結(jié)處理，根據(jù)凍結(jié)的實際速率分成快速凍結(jié)與慢速凍結(jié)兩種不同方式。全域過冷結(jié)晶中，冰晶成核溫度與凍結(jié)速率是其中比較主要的參數(shù)。定向結(jié)晶指的小部分溶液在過冷的狀況下實施凍結(jié)處理的一種方式。一般情況下，應(yīng)用定向結(jié)晶方法的凍結(jié)藥液相應(yīng)的干燥速度相較于全域過冷結(jié)晶明顯更快。然而不管是采用何種凍結(jié)方法，藥液都需要保證部分或是全部地完成玻璃化凍結(jié)，以確保相應(yīng)的藥性。

3.2 凍結(jié)溫度的影響

對于凍結(jié)溫度，其結(jié)合采用預(yù)凍方法的不同和樣品性質(zhì)的不同，其結(jié)果也不盡相同。通常來講，凍結(jié)溫度和藥液的共晶之間存在著密切的關(guān)聯(lián)性，安全的凍結(jié)溫度需要小于共晶點約10℃。如果凍結(jié)溫度過低，那么便會導(dǎo)致能源浪費情況的出現(xiàn)。

3.3 凍結(jié)時間的影響

設(shè)定合理的凍結(jié)時間能夠確保藥液在完成干燥處理以前被凍牢，這樣可以避免由于抽真空出現(xiàn)噴瓶的情況。凍結(jié)的時間需要結(jié)合傳熱介質(zhì)、板層面積等方面加以定奪，通常在1～3 h內(nèi)會完全性凍結(jié)。

3.4 退火的影響

退火是將凍結(jié)疫苗進行升溫處理，使其接近相應(yīng)的共熔點，且進行一定時間的保溫，之后溫度降低至凍結(jié)溫度的處理環(huán)節(jié)。在升華前增加相應(yīng)退火處理工藝的原因如下：首先，是因為退火溫度超過凍結(jié)樣品玻璃化轉(zhuǎn)化溫度Tg，這樣更加利于溶液中含有的結(jié)晶成分和濃縮液中沒有凍結(jié)的水進行完全性的結(jié)晶，加強了結(jié)晶這一過程；其次，提升非晶相最大凍結(jié)濃縮液相應(yīng)的玻璃轉(zhuǎn)化溫度Tg，這樣可以具有更高的穩(wěn)定性；最后，退火環(huán)節(jié)中的相行為和重結(jié)晶，能夠減低由于成核溫度差異所造成的冰晶在尺寸上的差異，實現(xiàn)對冰晶形態(tài)和大小分布情況的有效調(diào)節(jié)，提升相應(yīng)的干燥效率。要想使得退火工藝相應(yīng)的目的得到良好實現(xiàn)，實際操作中需要關(guān)注加熱的速率，退火的時間和退火的溫度等相關(guān)參數(shù)。因為當前對于凍干中的退火機理認識依然不是十分清晰，所以，退火工藝相關(guān)參數(shù)的選擇也缺少一定的根據(jù)。

3.5 升化溫度的影響

關(guān)于升華溫度，不可以高于已干層相應(yīng)的崩解溫度，同時也不可以高于凍結(jié)層相應(yīng)的共熔點溫度。若是升華溫度遠遠小于共熔點溫度，那么升華的速度便會顯著下降，相應(yīng)的時間也會有所延長。若是高出共熔點相應(yīng)的溫度，那么物料便會出現(xiàn)熔化的情況，在干燥過后物料可能會產(chǎn)生溶解困難的問題，且會出現(xiàn)顏色加深等情況。所以在升華階段物料的溫度應(yīng)盡可能與共熔點溫度接近，但不可以高于這一溫度。與共熔點溫度越是相近，相應(yīng)生升華的速度也就越快。升華干燥這一階段，凍干箱的擱板是物料熱量相應(yīng)的來源，通常依賴于上擱板的熱輻射與下擱板的熱傳導(dǎo)兩種不同方式予以熱量的提供。所以，擱板的溫度需要保持在相對合理的范圍中，通常結(jié)合升華溫度、冷阱溫度和凍干箱中的壓強幾方面因素加以確立。

3.6 升華速度的設(shè)計

升華速度會對凍干工藝相應(yīng)的時間造成一定的影響，對應(yīng)的大小與提供給升華界面的熱量及其由升華界面經(jīng)過干燥層而逸出水蒸氣的快慢之間存在一定的關(guān)聯(lián)。在升華干燥時，如果真空度不足或是供熱不夠有可能會造成成品水分的升華不是十分完全，出現(xiàn)含水量較高的情況。過快的升華速度極為可能導(dǎo)致凍干層相應(yīng)的結(jié)構(gòu)受到一定的破壞，情況比較嚴重時，還會導(dǎo)致噴瓶問題的產(chǎn)生，促使凍干失敗。進行冷凍干燥處理旨在可以獲取合格且具有一定均一性的產(chǎn)品，所以對于升華速度的控制需要將此作為標準。升華干燥相應(yīng)的理想狀態(tài)是確保藥品質(zhì)量的重要基礎(chǔ)，應(yīng)盡量提升升華的速度。對于提升升華速度的措施可以歸結(jié)如下：盡量提升升華中相應(yīng)的溫度，減小冷阱溫度，變更干燥室中的壓力，提升已干層所具有的導(dǎo)熱性，減少已干層相應(yīng)的厚度。通常來講，性能比較良好的冷凍干燥劑對應(yīng)的升華時間也比較短。

3.7 解析干燥階段的影響

冷阱溫度、物料溫度、干燥時間和箱內(nèi)壓強是解析干燥環(huán)節(jié)比較常見的相關(guān)控制參數(shù)。這一環(huán)節(jié)需要將產(chǎn)品中存在的結(jié)合水除去，所以擱板應(yīng)提供充足的熱量，用以對水的結(jié)合力加以克服，讓產(chǎn)品溫度升高到其最高的準許溫度，并保持幾個小時的時間直至凍干過程結(jié)束。物料的最高準許溫度應(yīng)結(jié)合物料的品種加以定奪，通常需要保持在20～40℃范圍內(nèi)。如果物料溫度超出相應(yīng)的極限值，疫苗中的相關(guān)有效成分便會出現(xiàn)變質(zhì)的情況，導(dǎo)致疫苗效果的下降。要想確保結(jié)合水能夠順利從中除去，凍干箱中需要保持高真空，確保物料內(nèi)外可以形成比較大蒸汽壓，這樣可以有效提高相應(yīng)的傳質(zhì)效率。另外，在接下來的干燥期間，需要盡量減小冷阱溫度。升華干燥需要的時間主要取決于水分的殘留量，針對包含熱敏性成分的疫苗，為了避免其中含有的成分發(fā)生變性或是失去活性的情況，高溫的時間不可過長。

4 真空冷凍干燥技術(shù)在水痘減毒活疫苗中的運用

4.1 選擇凍干機性能

冷凍干燥（又稱“真空冷凍干燥”或“升華干燥”，簡稱“凍干”）是將富含水的物料利用升華的原理在真空條件下使物料脫水的一種干燥技術(shù)[3]，實現(xiàn)冷凍干燥技術(shù)的設(shè)備稱為凍干機，而凍干機性能的選擇是真空冷凍干燥技術(shù)的關(guān)鍵。在使用該技術(shù)實施水痘減毒活疫苗的生產(chǎn)與儲存時，需依據(jù)疫苗的生產(chǎn)工藝規(guī)程（關(guān)鍵工藝參數(shù)和關(guān)鍵質(zhì)量屬性）與生產(chǎn)需求，分析凍干機的性能，并在規(guī)范規(guī)定的輔助下，選擇最適合的凍干機設(shè)備。對于凍干機性能的選擇需要注意：①凍干機的規(guī)格、容量、隔板尺寸等需與實際生產(chǎn)量相符。在此使用上海東富龍科技有限公司生產(chǎn)的真空冷凍干燥系統(tǒng)——LYO-20型真空冷凍干燥機。②凍干機隔板正反面都需平整，保障板溫的均勻[4]。③保證冷凝器的溫度在4 h就可降到一定溫度，即不超過40℃。④箱體中的真空度需保持在45 min內(nèi)達到2 Pa以下，為水痘減毒活疫苗后期干燥環(huán)節(jié)提供對應(yīng)的環(huán)境，同時避免蒸汽冷凝管與凍干箱體產(chǎn)生真空泄漏的情況，則在使用前要先對外壓部件進行泄漏量測試，避免發(fā)生藥品污染。

4.2 技術(shù)運用過程

4.2.1 預(yù)凍階段

預(yù)凍階段是凍干機真空冷凍干燥過程的一個重要環(huán)節(jié)，預(yù)凍過程是一個液相變?yōu)楣滔嗟倪^程。預(yù)凍的方法基本有兩種，一種是在凍干機干燥室內(nèi)直接進行預(yù)凍的箱內(nèi)法，另外一種是箱外法，配套超低溫冰箱或者低溫冷庫系統(tǒng)進行低溫冷凍。

箱內(nèi)法是在凍干箱內(nèi)預(yù)凍，盛裝疫苗的容器直接放置在凍干箱的板層上冷凍干燥，直至出箱，不需要轉(zhuǎn)移，比較方便；而箱外法一般是大型凍干機生產(chǎn)，提高凍干生產(chǎn)效率，直接在低溫冷庫進行預(yù)凍，然后再移入大型凍干機干燥室內(nèi)進行真空冷凍干燥。根據(jù)水痘減毒活疫苗的生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品特點，選用箱內(nèi)法進行凍干生產(chǎn)。而影響疫苗凍干生產(chǎn)預(yù)凍階段的兩個重要參數(shù)是預(yù)凍速度和預(yù)凍溫度。

一方面，預(yù)凍速度。預(yù)凍過程在較大程度上決定水痘減毒活疫苗的質(zhì)量，在此使用預(yù)凍方法進行實驗[5]。實驗?zāi)康模嚎疾焖賰龇▽λ粶p毒活疫苗外觀與活性的影響。實驗方法：取一半疫苗產(chǎn)品實施速凍實驗，先用凍干箱預(yù)冷，然后在裝箱開始就保證容器內(nèi)的溫度在﹣40℃以下，對凍干工藝曲線與凍干后外觀、病毒滴度等要素進行考察，實施對比。速凍法預(yù)凍速度對凍干工藝曲線、凍干后外觀病毒滴度等要素分析如表1所示。

表1 速凍法預(yù)凍速度對凍干工藝曲線、凍干后外觀病毒滴度等要素分析

另一方面，預(yù)凍溫度。水痘減毒活疫苗的預(yù)凍最低溫度取決于其共熔點溫度，所以預(yù)凍的最低溫度需低于本產(chǎn)品的共熔點溫度。以固定產(chǎn)品為目的，進行真空中的升華。若水痘減毒活疫苗沒有凍實，抽真空時產(chǎn)品就會溢出；若預(yù)凍溫度過低，不但會影響水痘減毒活疫苗的存活率，還會浪費資源。結(jié)合水痘減毒活疫苗形態(tài)變化，在實驗中使用慢凍法，這樣更好觀察產(chǎn)品溫度與形態(tài)變化的關(guān)系，反復(fù)確認后，建議水痘減毒活疫苗使用﹣45℃的預(yù)凍溫度。

4.2.2 升華階段

升華階段也稱第一階段，是真空冷凍干燥的關(guān)鍵階段，大部分的水在這一階段被升華。此階段是將凍結(jié)后的疫苗置于密封的真空容器中加熱，其冰晶就會升華成水蒸氣逸出，使疫苗確保在沒有水的情況下完成干燥任務(wù)。

水痘減毒活疫苗中水升華驅(qū)動力為冷阱間與藥物的溫度差，基于藥物溫度受加熱形式的限制且要地域共熔溫度，因此冷阱溫度要低。

以控制溫度與控制時間分別為30℃與5 h、33℃與4 h、35℃與3 h進行對比分析[6]，考察水痘減毒活疫苗在冷凍干燥過程中的熱敏感程度，如表2所示。雖然30℃與35℃都能縮短水痘減毒活疫苗凍干期，但是對病毒滴度的指標有一定的影響，最佳溫控溫度與時間為30℃與5 h[7]。

表2 水痘減毒活疫苗控溫溫度篩選結(jié)果

4.2.3 解析干燥階段

解析干燥階段也稱第二階段干燥。水痘減毒活疫苗在升華階段干燥結(jié)束水分升華為水蒸氣后，在其內(nèi)部產(chǎn)生大量空隙，可能還殘留水分，吸附在干燥物質(zhì)的毛細管壁和極性基團上，若不及時對其進行處理，會影響其儲存效果，因此要對水痘減毒活疫苗進行解析干燥處理，以確保水痘減毒活疫苗的含水量控制在1.8%以內(nèi)。

隨著中國生物制藥技術(shù)的發(fā)展，真空冷凍干燥技術(shù)作用愈加提升，其在水痘減毒活疫苗中的運用，不但可突破在生產(chǎn)過程中的多種局限，還能延長保存時間與治療效果[8]。經(jīng)過上述介紹，真空冷凍干燥技術(shù)在水痘減毒活疫苗中的運用，經(jīng)過對預(yù)凍階段、升華階段與解析干燥階段進行詳細分析，為生物制藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展與推廣提供技術(shù)支持。