范春玲，顏廷富，張林雁，王洋，周玉龍，孫斌，郭東華，原冬偉，趙明迪，吳海燕，劉琳珊

1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)人文學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；3. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)校醫(yī)院，黑龍江 大慶 163319

化膿隱秘桿菌（Trueperella pyogenes，T. pyogenes）是人畜共患病的重要病原體，由于其致病機(jī)理尚不明確，且無有效的疫苗及特效藥物，嚴(yán)重威脅動物和人類的生命健康［1-3］。

前期研究證明，化膿隱秘桿菌可引起奶牛腎和肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生壞死及凋亡［4-5］?；撾[秘桿菌是否也會引起奶牛脾臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡，目前尚不完全清楚。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心。脾臟的損傷會影響機(jī)體其他臟器的功能，從而影響機(jī)體的生命活動。因此，本研究通過對化膿隱秘桿菌自然感染奶牛（以下稱病牛）脾臟組織的病理學(xué)變化的觀察及其凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測，確定化膿隱秘桿菌感染是否會引起奶牛脾臟組織細(xì)胞凋亡，以探討化膿隱秘桿菌的致病機(jī)理。

1 材料與方法

1. 1 主要試劑 兔抗牛Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2 多克隆抗體和鼠抗牛Bax 單克隆抗體，以及山羊抗兔（SP-0023）、山羊抗小鼠（SP-0024）、SP Kit（Mouse）和Kit（Rabbit）試劑盒，均購自北京博奧森生物技術(shù)公司；檸檬酸鹽抗原修復(fù)液、胰蛋白酶試劑盒、多聚賴氨酸和DAB 染色液購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；甲醛、松節(jié)油、乙醇、石蠟、中性樹脂等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；蘇木素和伊紅染色液購自北京索萊寶科技有限公司。

1. 2 脾臟病理組織切片制備及其病理組織學(xué)變化觀察 取2 頭化膿隱秘桿菌檢測陰性的奶牛（對照牛）和5 頭自然感染化膿隱秘桿菌的患病奶牛（病牛），均由大慶地區(qū)提供，無菌采集脾臟組織，中性甲醛固定后，采用本課題組國家發(fā)明專利方法［6］，制作石蠟切片，經(jīng)HE 染色，鏡下觀察病理組織學(xué)變化。

1. 3 脾臟組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測 采用本課題組國家發(fā)明專利［6］與常規(guī)免疫組織化學(xué)方法相結(jié)合后的改進(jìn)方法（松節(jié)油替代二甲苯），檢測凋亡相關(guān)蛋白 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2 的表達(dá)情況。將脾臟組織石蠟切片經(jīng)松節(jié)油脫蠟、梯度酒精脫水后，流水及PBS 洗滌，吸干組織周邊水分，胰酶和檸檬酸鹽雙重法進(jìn)行修復(fù)抗原，PBS洗滌，吸干組織周邊水分。Bax 檢測采用SP Kit（Mouse）試劑盒，其他蛋白檢測采用Ki（tRabbit）試劑盒。用3% H2O2消化內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 洗滌，加入非免疫動物（小牛）血清封閉；棄血清，加入一抗［兔抗牛 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2多克隆抗體和鼠抗牛Bax 單克隆抗體（除Caspase-3為 1 ∶300 稀釋外，其他抗體均為 1 ∶400 稀釋）］，4 ℃過夜；室溫平衡后，PBS 洗滌，分別加入山羊抗兔和山羊抗小鼠，鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液孵育；PBS 洗滌，DAB 顯色；蘇木素復(fù)染；流水洗滌，烘干后直接封片。凋亡相關(guān)蛋白陽性表達(dá)表現(xiàn)為胞漿內(nèi)可見棕褐色顆粒。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)分析 每個組織切片選擇0. 20 mm 的25 個區(qū)域表達(dá)的陽性細(xì)胞，隨機(jī)選擇4 個對角線區(qū)域，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。應(yīng)用Cochran-Con 兩樣本平均數(shù)近似t 檢驗(yàn)方法，SPSS 17. 0 系統(tǒng)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P ＜0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 奶牛脾臟組織的的病理學(xué)變化 肉眼觀察可見，病牛脾臟呈紅褐色，腫大，柔軟，見圖1。病理組織學(xué)觀察可見，病牛脾臟組織出血，淋巴組織疏松水腫，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，部分可見變性壞死，見圖2。表明化膿隱秘桿菌可引起奶牛脾臟出血及淋巴細(xì)胞變性壞死。

圖1 病牛脾臟的肉眼觀察Fig. 1 Visual observation of spleens of cows infected with T. pyogenes

圖2 病牛及對照牛脾臟組織的病理學(xué)觀察（HE 染色，×400）Fig. 2 Histopathological change of spleens of cows infected with T. pyogenes and healthy cows（HE staining，× 400）

2. 2 各組牛脾臟組織細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

2. 2. 1 Caspase-3 蛋白 病牛脾臟組織Caspase-3表達(dá)陽性，陽性表達(dá)細(xì)胞分布在脾竇、淋巴小結(jié)和動脈周圍淋巴鞘；對照牛脾臟組織可見少量Caspase-3陽性表達(dá)細(xì)胞。見圖3。病牛脾臟組織Caspase-3 蛋白表達(dá)量高于對照牛，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=21.923，P < 0. 05），見表 1。

2. 2. 2 Caspase-8 蛋白 病牛脾臟組織可見少量Caspase-8 陽性表達(dá)細(xì)胞，分布在脾臟動脈周圍淋巴鞘和淋巴小結(jié)內(nèi)；對照牛脾臟組織可見少量Caspase-8陽性表達(dá)細(xì)胞。見圖3。病牛脾臟組織Caspase-8蛋白表達(dá)量與對照牛相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t =2. 073，P > 0. 05），見表 1。

2. 2. 3 Caspase-9 蛋白 病牛脾臟組織Caspase-9表達(dá)陽性，脾小梁周圍可見陽性細(xì)胞；對照牛脾臟組織Caspase-9 表達(dá)陰性。見圖3。病牛脾臟組織Caspase-9 蛋白表達(dá)量高于對照牛，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 34. 300，P < 0. 05），見表 1。

2. 2. 4 Bax 蛋白 病牛脾臟組織Bax 表達(dá)陽性，脾動脈周圍鞘、淋巴小結(jié)以及脾竇中有陽性表達(dá)細(xì)胞；對照牛脾臟組織可見少量Bax 表達(dá)陽性細(xì)胞。見圖3。病牛脾臟組織Bax 蛋白表達(dá)量高于對照牛，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 17. 085，P < 0. 05），見表1。

2. 2. 5 Bcl-2 蛋白 病牛脾臟組織可見少量Bcl-2 陽性表達(dá)細(xì)胞；對照牛脾臟組織Bcl-2 表達(dá)陰性。見圖3。病牛脾臟組織Bcl-2 蛋白表達(dá)量與對照牛相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 1. 750，P > 0. 05），見表 1。

表1 凋亡蛋白在奶牛脾臟組織中的陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量（個／ 0. 20 mm2，）Tab. 1 Number of lymphocytes positive for expressions Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9，Bax and Bcl-2 in spleens of cows（lymphocytes ／ 0. 20 mm2，）

表1 凋亡蛋白在奶牛脾臟組織中的陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量（個／ 0. 20 mm2，）Tab. 1 Number of lymphocytes positive for expressions Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9，Bax and Bcl-2 in spleens of cows（lymphocytes ／ 0. 20 mm2，）

組別 n Caspase-3 Caspase-8 Caspase-9 Bax Bcl-2對照牛 2 4. 00 ± 1. 58 6. 00 ± 2. 12 2. 80 ± 0. 97 2. 60 ± 0. 81 2. 20 ± 1. 07病牛 5 39. 00 ± 2. 55 10. 40 ± 3. 36 30. 00 ± 0. 89 18. 20 ± 1. 59 0. 80 ± 0. 58

圖3 脾臟組織凋亡蛋白的表達(dá)（DAB，× 400）Fig. 3 Expressions of Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9，Bax and Bcl-2 in spleen tissue（DAB，× 400）

根據(jù)以上陽性細(xì)胞分布和形態(tài)學(xué)特征，確定這些實(shí)質(zhì)細(xì)胞為淋巴細(xì)胞。

3 討 論

化膿隱秘桿菌可引起化膿性肺炎、肝臟膿腫、化膿性關(guān)節(jié)炎、化膿性乳房炎等疾病?；撾[秘桿菌有多種毒力因子，但主要的毒力因子有4 種：膽固醇依賴的溶血胞素pyolysin（PLO）、神經(jīng)氨酸酶（NanH和 NanP）、菌毛合成蛋白（FimA、FinC、FimE 和 FmG）和膠原結(jié)合蛋白（CbpA）［7-9］。目前對毒力因子致病機(jī)理的研究尚不深入。鐵ABC（ATP binding cassette，ATP 結(jié)合盒）轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物結(jié)合蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的化膿隱秘桿菌保護(hù)性抗原［10］。

由于缺乏有效的疫苗，至目前為止，化膿隱秘桿菌引起的感染主要依靠抗菌藥物來治療。有關(guān)化膿隱秘桿菌耐藥性的報道越來越多，尤其是對臨床常用的大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素的耐藥問題［11-12］。蘇鴻雨等［13］研究證明，利血平可能是通過抑制外排基因mef A 的轉(zhuǎn)錄和翻譯而消減化膿隱秘桿菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性。

前期研究證明，化膿隱秘桿菌可引起奶牛多個臟器化膿，腎、肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死及凋亡，其中線粒體通路發(fā)揮重要作用［4-5］。用化膿隱秘桿菌HJ-1 型感染山羊，發(fā)現(xiàn)山羊接種牛源化膿隱秘桿菌7 d 后死亡，接種部位皮膚壞死，胸腔積液、胸膜增厚，各臟器腫大、出血、壞死，以肺臟病變較為明顯，表現(xiàn)為壞死性、化膿性炎［14］。用化膿隱秘桿菌HJ-1 型建立小鼠模型［15］，結(jié)果顯示，化膿隱秘桿菌HJ-1 型在含5%血清的BHI 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 ～14 h 為該菌的對數(shù)生長期，此時的細(xì)菌數(shù)為8. 4 × 1010cfu；化膿隱秘桿菌HJ-1 型對小鼠的半數(shù)致死量（LD5）0為4. 16 ×108cfu。

本文主要研究?；撾[秘桿菌對奶牛脾臟細(xì)胞凋亡的影響。凋亡的信號通路至少包括3 條：死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。Caspase-3、Caspase-8 和 Caspase-9 是凋亡通路中的相關(guān)蛋白。Caspase-8 是死亡受體途徑關(guān)鍵的啟動型 Caspase；Caspase-9 是線粒體凋亡途徑的啟動關(guān)鍵蛋白酶；Caspase-3 是凋亡的主要執(zhí)行者?？沟蛲龅鞍譈cl-2及促凋亡蛋白Bax 均為Bcl-2 家族成員。Bax 是線粒體應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵組分，受凋亡性刺激后，Bax 形成寡聚體并轉(zhuǎn)位至線粒體膜，增加膜的通透性并導(dǎo)致Cyt-c 釋放，進(jìn)而激活Caspase 途徑，啟動細(xì)胞凋亡；而 Bcl-2 能夠通過改變Bax 空間構(gòu)象抑制細(xì)胞凋亡［16-17］。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，病牛脾臟呈紅褐色，腫大，有出血灶。而病理性觀察可見，脾臟組織出血，淋巴組織疏松水腫，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，可見變性壞死。病牛脾臟，淋巴小結(jié)、動脈周圍淋巴鞘和脾竇中可見Caspase-3、Caspase-9、Bax 陽性表達(dá)細(xì)胞，這些陽性表達(dá)細(xì)胞為淋巴細(xì)胞。而病牛脾臟組織中僅可見少量Caspase-8 和Bcl-2 陽性表達(dá)細(xì)胞，與對照牛相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0. 05）。Caspase-3 表達(dá)陽性，表明病牛脾臟淋巴細(xì)胞發(fā)生了凋亡；Caspase-8 表達(dá)陰性，表明死亡受體途徑非牛脾臟淋巴細(xì)胞凋亡的主要途徑；Caspase-9 表達(dá)陽性，表明線粒體途徑是牛脾臟淋巴細(xì)胞凋亡的主要途徑；Bax 表達(dá)陽性及Bcl-2 表達(dá)陰性，表明病牛脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)Bax 和Bcl-2 比率發(fā)生了改變。

綜合以上實(shí)驗(yàn)分析得出，化膿隱秘桿菌可通過調(diào)節(jié)奶牛脾臟淋巴細(xì)胞Bcl-2 家族的活性，引起其Bax 和Bcl-2 比率改變，增加淋巴細(xì)胞線粒體內(nèi)外膜通透性，導(dǎo)致和凋亡相關(guān)的因子釋放，激活細(xì)胞內(nèi)Caspase-9，進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)Caspase-3，從而引起脾臟淋巴細(xì)胞凋亡。脾臟淋巴細(xì)胞的凋亡和壞死可導(dǎo)致免疫功能障礙。同時化膿隱秘桿菌感染奶牛的肺臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死［4］，引起呼吸功能衰竭；而腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死［5］，引起腎功能衰竭，又引起全身多個臟器系統(tǒng)功能衰竭，最后導(dǎo)致奶牛死亡。因此，抑制宿主細(xì)胞凋亡，是防治奶?；撾[秘桿菌感染的一個新的科學(xué)思路。