王冉冉，許品品，朱丹，姚希

（連云港市第一人民醫(yī)院檢驗科，連云港222061）

食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是指食管鱗狀上皮異型增生導致的食管惡性腫瘤疾病。近年來，隨著食管切除術、放化療、分子靶向治療技術的發(fā)展，ESCC患者的近期預后得到明顯改善。但由于ESCC具有侵襲性強等特點，患者遠期預后仍不理想[1]。目前，ESCC的具體發(fā)病機制仍不明確，但有研究表明，ESCC的發(fā)生、進展與多種致癌基因、抑癌基因及其產(chǎn)物的表達或結構異常密切相關[2,3]。三重基序蛋白36（tripartite motif-containing protein 36，TRIM36）可參與機體固有免疫應答，屬于一類E3泛素連接酶和免疫調節(jié)蛋白，由RING鋅指結構、B-box結構和卷曲螺旋結構域構成[4]。人源TRIM36作為TRIM家族的一員，基因位于染色體5q22.3[5]。據(jù)報道，TRIM36是一種微管結合蛋白，在胚胎形成、頂體反應、染色體分離和細胞周期進程中起著重要作用[5,6]。最近的一項研究指出，TRIM36作為雄激素受體基因通過調控癌細胞凋亡相關途徑在前列腺癌中扮演抑癌基因的作用[7]。也有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中TRIM36高表達與放射敏感性相關[8]。然而，TRIM36在ESCC患者中的生物學作用尚不清楚。本研究主要探討TRIM36表達水平與ESCC患者臨床病理特征及預后的關系，旨在為ESCC患者臨床治療及預后評估提供參考。

對象與方法

1 研究對象

76例ESCC患者病理標本為連云港市第一人民醫(yī)院檢驗科和病理科2016年1月至2017年12月收集，癌旁組織取自距腫瘤邊緣＞5cm區(qū)域正常食管黏膜。納入標準：鱗癌；TNM分期為I期、II期、III期；術前均未接受放、化療和靶向藥物治療；無其他器官惡性腫瘤。其中，男性48例，女性28例；年齡范圍32～85歲，中位年齡56歲，＜60歲42例，≥60歲34例；體質量指數(shù)（body mass index，BMI）＜25kg/m235例，≥25kg/m241例；吸煙史32例；飲酒史21例；分化程度低分化、中分化、高分化分別為13例、18例、45例；腫瘤大?。?cm 41例，≥5cm 35例；TNM分期I期、II期、III期分別為18例、22例、36例；淋巴結轉移33例。

2 TRIM36 mRNA表達水平測定

按照TRIZOL試劑盒（DP419，TIANGEN，北京）說明書要求提取ESCC組織及癌旁組織總RNA；參照反轉錄試劑盒（FP314，TIANGEN，北京）說明書要求將RNA反轉錄為cDNA，－20℃冰箱保存待用。以GAPDH為內參基因，引物序列為：上游5’-AATCCCATCACCATCTTC-3’，下游5’-AGGCTGTTGTCATACTTC-3’；TRIM36引物序列為：上 游5’-CGTCGGTCCTCCAGAGTTTGTG-3’，下游5’-GTGGCAAGTTCCGTCGTCTTCC-3’。根據(jù)SYBR@ Premix Ex TaqTM II試劑盒（RR820A，TaKaRa，大連）說明書進行熒光定量PCR擴增反應。以 2－△△Ct相對定量法計算TRIM36 mRNA相對表達量，實驗獨立重復3次。

3 TRIM36蛋白表達水平測定

分別取30mg ESCC及癌旁組織與300μl蛋白裂解液（組織與裂解液比例100:1）混合后加入研磨器中，研磨完全后至于冰上，30min使其完全裂解，離心機冷卻至4℃后20000r/min離心30min，取上清，根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒（福州邁新生物技術公司）的說明書測定提取組織樣本的蛋白濃度。取30μg蛋白行10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫5%脫脂牛奶密封1～2h，加入稀釋比例為1:1000的兔抗人TRIM36多克隆抗體（美國abcam公司）和GAPDH（美國Abcam公司）單克隆抗體，4℃孵育過夜，充分洗滌后，加入稀釋比例為1:1000的HRP山羊抗兔二抗（中國碧云天公司），室溫孵育1h，充分洗膜后，用電化學發(fā)光試劑盒（以色列BioInd公司）處理后顯影，觀察條帶，應用GIS軟件獲得蛋白條帶吸光度（A）值。以GAPDH作為內參，以目的蛋白與內參蛋白條帶A值的比值作為目的蛋白相對表達量。

4 TRIM36免疫組織化學染色

ESCC組織及癌旁組織經(jīng)10%中性甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋并切片（4μm），根據(jù)CS-X14392免疫組織化學試劑盒（上海莼試生物技術有限公司）說明書進行TRIM36免疫組織化學染色：檸檬酸緩沖液修復20min，3%雙氧水封閉20min，山羊血清封閉20min，加入兔抗人TRIM36多克隆抗體（1:1000；美國Abcam公司）4℃孵育過夜。PBS清洗后加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗（1:1000；福州邁新生物技術公司），室溫孵育60min，PBS清洗后加入DAB顯色液（福州邁新生物技術公司）顯色6～7min，蘇木精復染后封片觀察。TRIM36表達量判定方法：40倍物鏡下隨機選擇5個視野，根據(jù)染色強度和染色陽性率評定。其中：無顯色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分；陽性細胞≤5%記0分，陽性細胞6%～25%記1分，陽性細胞26%～75%記2分，陽性細胞＞75%記3分。兩者乘積＜3分為TRIM36低表達，≥3分為TRIM36高表達[9]。

5 隨訪

通過電話、微信、門診復查等方式對ESCC患者進行隨訪，隨訪時間截止于2020年12月30日。記錄所有患者5年無瘤生存時間和總體生存時間，繪制Kaplan-Meier生存曲線。隨訪時間3～69月，平均（42.36±14.67）月。

6 統(tǒng)計學分析

應用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以平均值±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。通過單因素、多因素Cox回歸模型評估影響ESCC患者預后的因素。通過Kaplan-Meier生存分析TRIM36水平與ESCC患者5年無瘤生存率和總體生存率的關系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 食管鱗狀細胞癌組織中TRIM36低表達

免疫組織化學染色顯示：在76例ESCC標本中，51例TRIM36免疫反應性降低，25例TRIM36免疫反應性增強（圖1）。Western blot檢測和qRT-PCR分析顯示，ESCC組中TRIM36蛋白水平和mRNA表達量均顯著低于癌旁對照組（圖2，表1）。

圖1 ESCC組織及癌旁組織中TRIM36表達的免疫組織化學檢測。A，ESCC組織中低TRIM36免疫反應性；B，ESCC組織中高TRIM36免疫反應性；C，癌旁組織中高TRIM36免疫反應性；比例尺，25μmFig.1 Immunohistochemical examination of TRIM36 in ESCC and adjacent tissues. A, low TRIM36 immunoreactivity in ESCC tissues; B, high TRIM36 immunoreactivity in ESCC tissues; C, high TRIM36 immunoreactivity in adjacent tissues; scale bar, 25μm

圖2 ESCC組織及癌旁組織中TRIM36表達的Western blot檢測。ParaCa，癌旁組織Fig.2 Western blot detection of TRIM36 in ESCC and paracancerous tissues. ParaCa, paracancerous tissue

表1 ESCC和癌旁組織中TRIM36蛋白和mRNA表達水平比較Tab.1 Comparison of the expression of TRIM36 protein and mRNA in ESCC and adjacent tissues

2 ESCC組織中TRIM36表達水平與臨床病理特征的關系

應用χ2檢驗分析顯示，ESCC組織中TRIM36低表達患者，腫瘤大小≥5cm患者比例、TNM分期III期患者比例、淋巴結轉移患者比例、死亡患者比例均升高，TRIM36表達水平與性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、分化程度無相關性（表2）。

表2 ESCC組織中TRIM36表達水平與臨床病理特征的關系Tab.2 Relationship between the expression of TRIM36 and the clinicopathological characteristics of ESCC

3 影響ESCC患者預后的單因素和多因素Cox回歸分析

單因素Cox回歸分析和多因素Cox回歸分析均顯示，低分化、TNM分期III期、淋巴結轉移、TRIM36低表達是影響ESCC患者5年無瘤生存率和5年總體生存率的危險因素（表3，表4）。

表3 影響ESCC患者預后的單因素Cox回歸分析Tab.3 Univariate Cox regression analysis on prognosis of ESCC patients

表4 影響ESCC患者預后的多因素Cox回歸分析Tab.4 Multivariate Cox regression analysis on prognosis of ESCC patients

因素 5年無瘤生存率 5年總體生存率HR 95%CI P HR 95%CI P腫瘤大?。?cm 1.000 1.000≥5cm 1.254 0.811～1.659 0.311 1.043 0.658～1.449 0.178淋巴結轉移是1.000 1.000否0.887 0.641～0.990 0.014 0.872 0.600～0.981 ＜0.001 TRIM36表達水平低1.000 1.000高0.855 0.611～0.982 ＜0.001 0.831 0.572～0.971 ＜0.001

4 ESCC組織中TRIM36表達水平與預后的關系

Kaplan-Meier生存分析顯示，ESCC組織中TRIM36低表達組患者5年無瘤生存率、總體生存率均低于TRIM36高表達組（圖3）。

圖3 ESCC組織中TRIM36表達水平與患者5年無瘤生存率和總體生存率的關系Fig. 3 Relationship between the TRIM36 expression in ESCC tissues and the 5 years disease-free survival rate and overall survival rate of ESCC patients

討 論

近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)TRIM家族參與多種生物過程，它既可以維持機體細胞生長分化、細胞骨架的重構、膜修復、信號通路和細胞凋亡等正常生理功能，還具有抗HIV感染、抗流行性乙型腦炎病毒感染、抗丙型肝炎病毒感染等抗病毒功能[10]。TRIM36屬于TRIM家族成員，除具有RING鋅指結構、B-box結構和卷曲螺旋結構域外，還包含羧基末端的纖連蛋白Ⅲ、雙特異性蛋白激酶spla和蘭尼堿受體[11]。有研究指出，TRIM36蛋白以位移的方式調控核受體，并通過參與原癌基因和抑癌基因對應蛋白的轉錄后修飾，在腫瘤細胞增殖及凋亡過程中發(fā)揮重要作用[12,13]。本研究從mRNA、蛋白相對表達量方面入手，選擇與腫瘤細胞增殖、凋亡相關的TRIM36基因，分析TRIM36表達水平與ESCC患者臨床病理特征和預后的關系。

TRIM36表達水平與許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預后存在相關性。Olsson等人通過生物信息學分析鑒定神經(jīng)母細胞瘤相關的異常甲基化差異表達基因的研究發(fā)現(xiàn)，TRIM36可作為神經(jīng)母細胞瘤發(fā)病相關的異常甲基化差異表達的生物標志物，研究表明TRIM36與神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生進展密切相關[14]。Kimura等人的研究發(fā)現(xiàn)，過表達TRIM36可抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移，siRNA敲除TRIM36可抑制前列腺癌細胞凋亡、促進細胞增殖和遷移，微陣列分析顯示TRIM36過表達顯著上調了細胞凋亡相關通路，研究提示，TRIM36的高表達與前列腺癌患者預后有關，TRIM36通過抑制細胞增殖和遷移、促進腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮抑瘤作用[15]。Man等人的研究指出，胃癌組織中TRIM36與臨床病理特征無相關性，但接受放療的TRIM36高表達患者的總生存率有所提高，TRIM36可能是影響胃癌放療患者臨床預后的重要因素，可能被認為是潛在的放射敏感性標志物[8]。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，ESCC組織中TRIM36的表達量顯著下調，采用癌癥基因組圖譜的ESCC全基因組RNA測序數(shù)據(jù)和基因集富集分析方法得出TRIM36的表達與β 鏈接素通路呈負相關，Kaplan-Meier和Log-rank檢驗表明，TRIM6的低表達和β鏈接素的高表達與ESCC患者的總體生存率低相關[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，ESCC組中TRIM36 mRNA和蛋白相對表達量均顯著低于癌旁對照組，這或許表明TRIM36表達水平與ESCC進展存在密切聯(lián)系。本研究評估了TRIM36蛋白表達與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關系，發(fā)現(xiàn)ESCC組織中TRIM36表達水平與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移、生命狀態(tài)有關，這或許提示TRIM36表達的下調影響了ESCC細胞生長、侵襲及分化等一系列生物學行為。Liang等人的研究證實，TRIM36通過抑制MAPK/ERK磷酸化途徑延緩前列腺癌細胞周期進程、抑制細胞增殖[7]。Miyajima等人的研究則指出，TRIM36與著絲粒蛋白CENP-H相互作用，延緩細胞周期進程[17]。此外，組織中低表達TRIM36的患者表現(xiàn)出較差的預后，多因素分析顯示組織中TRIM36表達、TNM分期和分化程度對預測ESCC患者預后有統(tǒng)計學意義，提示TRIM36可能是臨床上預測ESCC患者預后的一個潛在指標。然而，由于TRIM36在ESCC中作用的相關研究和權威報告較少，其作用機制仍需進一步探索和驗證。

總之，TRIM36在ESCC組織中低表達，與患者腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移有關，組織中TRIM36低表達的ESCC患者預后差。TRIM36在ESCC中的功能和機制研究或許為揭示ESCC發(fā)生機制提供新思路，并有望成為ESCC患者腫瘤治療的新靶點。