溫紹艷 蔡明志 梁寒

代謝重塑是腫瘤細(xì)胞的基本特征之一。除研究較為深入的糖代謝調(diào)控外，氨基酸代謝異常在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用也被逐漸認(rèn)識。絲氨酸作為非必需氨基酸，其能支持快速生長的細(xì)胞對蛋白、谷胱甘肽和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的需求[1]。磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶1（phosphoserine aminotransferase 1，PSAT1）是絲氨酸生物從頭合成代謝的重要催化酶之一，其將磷酸烯醇丙酮酸（phosphohydroxypyruvate）催化為磷酸絲氨酸（phosphoserine），而后者進(jìn)一步去磷酸化最終生成絲氨酸（serine）。已有研究表明PSAT1 在乳腺癌、卵巢癌及部分消化道惡性腫瘤中表達(dá)異常，且與耐藥相關(guān)并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，與預(yù)后負(fù)相關(guān)[2-5]。中國作為全球胃癌高發(fā)國家[6]，目前鮮見該酶與胃癌相關(guān)的研究報(bào)道。僅有的一項(xiàng)來自韓國的研究表明，當(dāng)使用幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）分泌蛋白處理胃癌AGS 細(xì)胞后，PSAT1 在該細(xì)胞中的表達(dá)水平升高[7]。因此，本研究探索PSAT1 在胃癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，了解其作為胃癌治療靶點(diǎn)的潛在可能性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

在Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/）的胃癌mRNA 數(shù)據(jù)集中，輸入PSAT1基因名，探針號為223 062_s_at，取PSAT1 表達(dá)值中位數(shù)為界，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，比較兩組患者的總生存期，繪制PSAT1 表達(dá)的生存曲線。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株及培養(yǎng) 使用含10% FBS 的RPMI-1 640培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌SGC7901、MGC803、BGC823、MKN45、NCI-N87、SNU1、SNU16、HGC27 細(xì)胞。使用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)永生化GES1 和293T 細(xì)胞。使用含10% FBS 的F12K 培養(yǎng)基培養(yǎng)AGS 細(xì)胞。使用含10% FBS 的IMDM 培養(yǎng)基培養(yǎng)KATOⅢ細(xì)胞。各培養(yǎng)基中均加入青霉素（5 U/mL）和鏈霉素（5 μg/mL）。細(xì)胞于37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 病毒質(zhì)粒構(gòu)建、包裝和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo) 合成PSAT1的CDS 序列（NM_058179.4），構(gòu)建在慢病毒載體plvx-IRES-puro 上（蘇州泓迅生物科技公司）。按照提供的病毒包裝方案，使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（美國賽默飛世爾科技公司）將PSAT1 高表達(dá)和對照質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒（pMD2.G 和psPAX2）共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T 細(xì)胞，待48 h 后收獲上清，用0.45 μm 濾器過濾，分裝后于-80 ℃冰箱保存。

BGC823 和NCI-N87 細(xì)胞按照合適密度種于6孔板24 h 后，去掉培養(yǎng)基，加入病毒懸液（1 mL/孔），用含10% FBS 的RPMI-1 640 培養(yǎng)基補(bǔ)齊2 mL 后加入聚凝胺（polybrene，10 μg/mL）增加病毒感染效率。病毒感染24 h 后，加入含嘌呤霉素（1.2 μg/mL）的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定感染的細(xì)胞。

1.2.3 RNA 提取、逆轉(zhuǎn)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)（密度約80%），采用TRIzol 提取細(xì)胞RNA（美國賽默飛世爾科技公司）。使用GoScript?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega 公司）合成cDNA 。采用TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus，日本TaKaRa 公司）對PSAT1 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測。GAPDH作為內(nèi)參。通過2-ΔΔCt法計(jì)算各樣品中PSAT1 的mRNA 表達(dá)量并進(jìn)行比較。PSAT1 的qPCR 引物由美國OriGene 公司預(yù)設(shè)計(jì)：5’-ACTTCCTGTCCAA GCCAGTGGA-3’和5’-CTGCACCTTGTATTCCAGGA CC-3’。GAPDH 的qPCR 引物為：5’-TGCACCACCA ACTGCTTAGC-3’和5’-GGCATGGACTGTGGTCATG AG-3’。

1.2.4 蛋白提取和免疫印跡實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞總蛋白在細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)收獲。細(xì)胞裂解液配方：10 mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、150 mM 氯化鈉（NaCl）、5 mM 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、1%曲拉通X-100（Triton X-100）、0.25% 脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate）、蛋白酶和磷酸酶抑制劑（瑞士Roche 公司）。收獲的蛋白采用BCA 蛋白定量試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司）進(jìn)行濃度檢測和定量。每孔20～30 μg 蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和檢測?；瘜W(xué)發(fā)光試劑采用SuperSignal West Pico PLUS（美國賽默飛世爾科技公司）。所有檢測結(jié)果均使用凝膠成像系統(tǒng)Amersham Imager 600（美國GE 公司）采集。PSAT1抗體（10 501-1-AP）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。β-actin 抗體（AC-74）購自美國Merck 公司。辣根酶標(biāo)記山羊抗兔（ZB-5 301）和辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠（ZB-5 305）IgG（H+L）均購自北京中杉金橋公司。PSAT1 抗體按照1∶1 000 稀釋，β-actin 抗體按照1∶2 000 稀釋，二抗均按照1∶5 000 稀釋。

1.2.5 細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn) 采用Cell Counting Kit-8 試劑盒（CCK-8，美國MCE 公司）檢測PSAT1 對BGC823和NCI-N87 細(xì)胞增殖的影響。PSAT1 高表達(dá)和對照BGC823 細(xì)胞種于6 塊96 孔板（2 000 細(xì)胞/孔），每組重復(fù)6 孔。每隔24 h 加入CCK-8 試劑（10 μL/孔）孵育2 h 后用酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）檢測OD450值。根據(jù)同樣的處理方法采用CCK-8 比較PSAT1 高表達(dá)/對照NCI-N87 細(xì)胞的增殖。因NCI-N87 細(xì)胞增殖慢，故每隔48 h 檢測1 次。

將500 個(gè)PSAT1 高表達(dá)/對照BGC823 細(xì)胞和800 個(gè)PSAT1 高表達(dá)/對照NCI-N87 細(xì)胞分別種于6 孔板。每組細(xì)胞種3 個(gè)復(fù)孔。7 d 和12 d 后分別收獲6 孔板。采用4%多聚甲醛室溫下固定30 min，用0.1% 結(jié)晶紫染色約10 min 后，用自來水小心沖洗，晾干后拍照計(jì)數(shù)。每個(gè)孔中所有克隆數(shù)（細(xì)胞數(shù)＞50 個(gè)計(jì)算為1 個(gè)克?。┯?jì)為1 個(gè)值。

1.2.6 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 收獲處于對數(shù)生長期的PSAT1 高表達(dá)/對照組BGC823 細(xì)胞，計(jì)數(shù)后用無菌PBS 重懸細(xì)胞（2×107個(gè)細(xì)胞/mL）。取100 μL 細(xì)胞懸液分別種于5 周齡雄性BABL/c 裸鼠（北京華阜康生物公司）背部左、右側(cè)皮下。21 d 后處死小鼠，取出瘤塊，稱重比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。生存分析采用Log-rank 檢驗(yàn)。其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PSAT1 表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

分析Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫中PSAT1表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的數(shù)據(jù)提示，根據(jù)PSAT1表達(dá)值中位數(shù)將胃癌患者分為高表達(dá)組（n=172）和低表達(dá)組（n=459）。PSAT1 高表達(dá)組患者的總生存期顯著高于低表達(dá)組患者（P=1.7e-6，圖1），提示PSAT1高表達(dá)很可能與胃癌患者較好的預(yù)后相關(guān)。

圖1 Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫中PSAT1 表達(dá)水平與胃癌患者總生存期之間的關(guān)系

2.2 PSAT1 在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平

qPCR 結(jié)果顯示除了HGC27 和SNU1 細(xì)胞外，其余8 個(gè)胃癌細(xì)胞株中PSAT1 的mRNA 水平均顯著低于GES1（圖2A）。同時(shí)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，PSAT1 蛋白在多數(shù)胃癌細(xì)胞株中低于GES1 細(xì)胞（圖2B）。HGC27 和SNU1 細(xì)胞中PSAT1 表達(dá)水平高于GES1 可能是不同胃癌細(xì)胞株中差異的遺傳背景所致。提示PSAT1 表達(dá)水平的降低可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性表型。

圖2 PSAT1 在胃癌細(xì)胞株及GES1 細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.3 確認(rèn)PSAT1 在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)效率

本研究包裝PSAT1 高表達(dá)的慢病毒，感染PSAT1 低表達(dá)的BGC823 和NCI-N87 細(xì)胞。通過qPCR 和免疫印跡實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)PSAT1 在2 個(gè)細(xì)胞中穩(wěn)定高表達(dá)（圖3）。

圖3 PSAT1 在胃癌BGC823 和NCI-N87 細(xì)胞中過表達(dá)

2.4 過表達(dá)PSAT1 后對胃癌細(xì)胞體外增殖的作用

CCK-8 試驗(yàn)顯示PSAT1 顯著抑制BGC823 和NCI-N87 細(xì)胞的增殖能力（圖4）。值得注意的是，PSAT1 對細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)在較長時(shí)間后顯現(xiàn)，如PSAT1 高表達(dá)/對照組的BGC823 細(xì)胞在72 h 后增殖率有所差異（72 h 時(shí)P=0.018；120 h 時(shí)P＜0.000 1）；而在NCI-N87 細(xì)胞中，兩組細(xì)胞在96 h 后差異逐漸增大（96 h 時(shí)P＜0.000 1，圖4）。檢測PSAT1 對胃癌細(xì)胞克隆形成能力的作用后，發(fā)現(xiàn)PSAT1 高表達(dá)的BGC823（P=0.029 6）和NCI-N87（P=0.036 5）細(xì)胞所形成的克隆數(shù)明顯少于對照組細(xì)胞（圖5）。

圖4 PSAT1 抑制胃癌細(xì)胞增殖能力

圖5 PSAT1 抑制胃癌細(xì)胞克隆形成能力

2.5 過表達(dá)PSAT1 后對胃癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的作用

進(jìn)一步檢測PSAT1 對胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)增殖能力的影響，在皮下注射21 d 后，對收獲的瘤塊進(jìn)行稱重，結(jié)果表明PSAT1 可以抑制BGC823 細(xì)胞在體內(nèi)的生長（n=7，P=0.009 1，圖6）。

圖6 PSAT1 抑制胃癌細(xì)胞體內(nèi)增殖能力

3 討論

近年來，PSAT1 在多種腫瘤發(fā)生過程中的重要作用被逐漸認(rèn)識。PSAT1 在結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、食管鱗癌、膠質(zhì)瘤中異常高表達(dá)，通過激活多條信號通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖，預(yù)示了患者的不良預(yù)后[2-5，8-9]，PSAT1 逐漸被視為潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物[10]。同時(shí)，過表達(dá)PSAT1 還可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對治療的抵抗。如PSAT1 增強(qiáng)了結(jié)直腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥[11]。在子宮頸癌，PSAT1 通過激活PI3K/Akt 信號通路來增強(qiáng)對順鉑的抵抗[12]。除此以外，PSAT1 還可以促進(jìn)肺腺癌、三陰性乳腺癌、食管鱗癌等腫瘤的轉(zhuǎn)移能力[13-15]。

在胃癌中，PSAT1 的作用和機(jī)制均不明確。有研究發(fā)現(xiàn)PSAT1 表達(dá)水平在幽門螺桿菌感染的胃癌AGS 細(xì)胞中顯著升高[7]，提示該酶與胃癌發(fā)展可能有密切關(guān)系。本研究利用Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫分析PSAT1 表達(dá)與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，確認(rèn)PSAT1 高表達(dá)患者具有更好的預(yù)后。隨之比較該基因在胃癌細(xì)胞株和GES1 細(xì)胞之間的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)該基因在多數(shù)胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)低于GES1 細(xì)胞。在胃癌細(xì)胞株中過表達(dá)該基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSAT1 可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的體外、體內(nèi)增殖能力。此結(jié)果與PSAT1 促進(jìn)其他類型腫瘤增殖的作用不同，提示該蛋白在不同遺傳背景下作用顯著不同。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了PSAT1 在胃癌細(xì)胞增殖中的抑制作用，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。