劉祥 吳艷霞 蹇文淵 路雪婧

葡萄膜炎，作為臨床常見的眼病，正在成為失明的主要原因之一[1]，其被廣泛認為是一種自身免疫性和(或)自身炎癥反應性疾病，確切發(fā)病機制仍不清楚[2]。目前西醫(yī)主要使用糖皮質(zhì)激素治療，也有一些新的免疫抑制劑及生物制劑的應用[3]。葡萄膜炎屬于中醫(yī)學中的 “視瞻昏渺”、“瞳神緊小”、狐惑病等[4]。

已故著名中醫(yī)眼科學家陳達夫先生將中醫(yī)理論與當代醫(yī)學知識相結(jié)合，創(chuàng)立了內(nèi)眼結(jié)構(gòu)與六經(jīng)相屬學說：虹膜、睫狀體、視網(wǎng)膜都屬于肝經(jīng)，眼內(nèi)一切色素屬于腎經(jīng)，故葡萄膜炎與肝腎有關[5]。陳達夫先生在臨床使用的經(jīng)驗方補腎明目湯，后經(jīng)標準化制成口服液，主要由赤芍、決明子、青葙子、三七、菟絲子、枸杞子組成，具清肝、補腎、明目之效，一直在臨床應用于治療葡萄膜炎，且有顯著的效果。

網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學衍生出的以藥物多成分、多靶點為切入點研究藥物治療疾病機制的學科[6]，切合中醫(yī)整體觀念，作為中藥復方機制研究的新方法，有利于中醫(yī)藥理論的傳承和發(fā)展[7]。

本研究使用網(wǎng)絡藥理學，探析補腎明目口服液治療葡萄膜炎的有效成分及作用機制，為臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 補腎明目口服液活性成分及靶點篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫[8](https://tcmspw.com/index.php)，檢索赤芍、決明子、青葙子、三七、菟絲子、枸杞子6味中藥的化學成分，將使用中藥吸收、分布、代謝及排泄(Absorption distribution metabolism excretion,ADME)中口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18作為篩選條件，得到活性成分及作用靶點。將獲得的作用靶點信息統(tǒng)一在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[9](htpps://www.uniprot.org/)矯正為標準基因名稱。應用Cytoscape 3.8.0軟件建立中藥-成分-靶點網(wǎng)絡圖。

1.2 葡萄膜炎相關靶點篩選

以“Uveitis”為關鍵詞在DisGeNET[10](https://www.disgenet.org)、DrugBank[11]( http://www.omim.org)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM[12](http://www.omim.org)四個數(shù)據(jù)庫中檢索疾病靶點，合并并去除重復得到葡萄膜炎疾病的靶點。

1.3 中藥-疾病共同靶點篩選及PPI網(wǎng)絡構(gòu)建

將中藥靶點與葡萄膜炎疾病靶點取交集，并利用在線繪圖網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖,得到中藥-疾病共同靶點。在String數(shù)據(jù)庫[13]((Version 11.0，https://string-db.org)建立共同靶點PPI網(wǎng)絡，應用Cytoscape 3.8.0軟件的插件對PPI網(wǎng)絡進行模塊化聚類分析，得出基因團簇，選取分值最高的基因團簇作為核心團簇。

1.4 中藥-疾病共同靶點GO與KEGG富集分析

GO富集分析為分子功能(molecular function, MF)，生物過程(biological process, BP)和細胞組分(cellular component, CC)富集分析，KEGG富集分析為通路富集分析。Metascape平臺[14](http://metascape.org/)集成了40多個知識庫，支持對10多個高度研究的生物種類進行綜合分析。在該平臺對共同靶點進行GO富集分析，對共同靶點、核心團簇靶點進行KEGG富集分析，以P<0.1為條件進行聚類分析，并使用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)對結(jié)果進行可視化。

1.5 中藥活性成分-共同靶點-通路網(wǎng)絡圖構(gòu)建

基于通路富集分析映射的靶點，應用Cytoscype 3.8.0軟件建立中藥活性成分-共同靶點-通路網(wǎng)絡圖，并進行拓撲分析，篩選得到補腎明目口服液治療葡萄膜炎的核心活性成分和靶點。

2 結(jié)果

2.1 補腎明目口服液活性成分及靶點

通過TCMSP平臺以ADME中OB≥30%和DL≥0.18為條件篩選得到補腎明目口服液中赤芍15種、枸杞子35種、決明子12種、青葙子2種、三七7種、菟絲子10種活性成分，包括β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、槲皮素、人參皂苷、異鼠李素等，見表1。獲得作用靶點赤芍81個、枸杞子200個、決明子64個、青葙子51個、三七183個、菟絲子208個，合并并去除重復共得到補腎明目口服液靶點246個。應用Cytoscape 3.8.0進行可視化，構(gòu)建中藥-成分-靶點網(wǎng)絡圖，得到一個由315個節(jié)點，1299條邊構(gòu)成的網(wǎng)絡圖，見圖1。

表1 補腎明目口服液有效活性成分表

圖1 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖

2.2 葡萄膜炎相關靶點

以“Uveitis”為關鍵詞搜索得到疾病靶點1422個，其中DisGeNET數(shù)據(jù)庫247個、DrugBank數(shù)據(jù)庫96個、GeneCards數(shù)據(jù)庫980個、OMIM數(shù)據(jù)庫99個，合并并去除重復共得到疾病靶點1233個。

2.3 中藥-疾病共同靶點及其PPI網(wǎng)絡

取中藥靶點與疾病靶點交集，用在線繪圖工具繪制韋恩圖，得到中藥-疾病共同靶點101個，見圖2。在String平臺建立共同靶點PPI網(wǎng)絡，隱藏游離節(jié)點，得到一個由99個節(jié)點，1744條邊組成的網(wǎng)絡圖。故中藥-疾病共同靶點最終為99個。PPI網(wǎng)絡具模塊性，對功能模塊的研究可將復雜的PPI網(wǎng)絡簡化并可通過對模塊功能的研究預測蛋白質(zhì)的功能[15]，故為更明確的研究補腎明目口服液治療葡萄膜炎的作用機制，在Cytoscape 3.8.0中，用MCODE插件對PPI網(wǎng)絡進行模塊化聚類分析，共得到4個基因團簇，取其中評分最高的團簇為核心團簇，有46個靶點，其由46個節(jié)點，865條邊組成，見圖3。

圖2 中藥-疾病共同靶點韋恩圖

圖3 中藥-疾病PPI核心團簇

2.4 中藥-疾病共同靶點功能與通路富集分析

在Metascape平臺對共同靶點進行GO富集分析，對共同靶點和核心團簇靶點進行KEGG富集分析，并使用微生信在線平臺對結(jié)果可視化，見圖4、5。共同靶點的GO富集分析顯示，補腎明目口服液在治療葡萄膜炎時主要的生物學過程集中在呼吸系統(tǒng)發(fā)育(respiratory system development)、對革蘭氏陽性細菌的防御反應(defense response to Gram-positive bacterium)、突觸傳遞，谷氨酸能(synaptic transmission, glutamatergic)、T細胞介導的免疫(T cell mediated immunity)、負調(diào)節(jié)白細胞分化(negative regulation of leukocyte differentiation)、血漿脂蛋白顆粒水平的調(diào)節(jié)(regulation of plasma lipoprotein particle levels)等。分子功能富集在細胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(transcription factor binding)、激酶結(jié)合(kinase binding)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)等。在細胞組分方面，則富集在富集在線粒體膜(mitochondrial membrane)、粘著連接(adherens junction)、PML(PML body)、細胞-底物連接(cell-substrate junction)等。KEGG富集分析顯示共同靶點的通路主要富集在糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、瘧疾(Malaria)、NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)等。核心團簇靶點的通路主要富集在TNF信號通路(TNF signaling pathway)、癌癥通路(Pathways in cancer)、流體剪應力與動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、瘧疾(Malaria)、NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)等。其中TNF信號通路、NF-κB信號通路為共同靶點與核心團簇靶點信號通路均有的，提示補腎明目口服液可能主要通過這兩個通路對葡萄膜炎起治療作用。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG富集分析

2.5 中藥活性成分-共同靶點-通路網(wǎng)絡圖

運用Cytoscape 3.8.0建立補腎明目口服液活性成分-共同靶點-通路網(wǎng)絡圖，得到一個由137個節(jié)點，787條邊組成的網(wǎng)絡圖，見圖6。使用軟件中的NetworkAnalyzer進行拓撲分析，以度值為條件篩選得到補腎明目口服液治療葡萄膜炎的核心活性成分及靶點，核心靶點參數(shù)見表2。結(jié)果表明，核心成分為槲皮素(Quercetin)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、山奈酚(Kaempferol)、豆甾醇(Stigmasterol)等，主要靶點為PTGS2、RELA、CASP3、PIK3CG、JUN、BCL2、TNF等。

圖6 中藥活性成分-共同靶點-通路網(wǎng)絡圖

表2 核心靶點參數(shù)

3 討論

補腎明目口服液為陳達夫先生立足于其所創(chuàng)立的內(nèi)眼結(jié)構(gòu)與六經(jīng)相屬學說而成的復方，具有補腎、清肝、明目的功效，長期應用于臨床治療葡萄膜炎。研究表明，慢性葡萄膜炎患者外周血淋巴細胞(PBL)的凋亡及凋亡相關蛋白(Fas、Fasl)表達紊亂，補腎明目口服液可糾正這種情況，增高PBL的凋亡，達到治療葡萄膜炎的作用[16-17]，若聯(lián)合常規(guī)西醫(yī)治療，可更加有效緩解眼部不適，其臨床療效顯著[18]。應用網(wǎng)絡藥理學探析補腎明目口服液治療葡萄膜炎的有效成分及作用機制對臨床應用有積極意義。

在補腎明目口服液有效成分方面，綜合分析得出其核心有效成分為槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇等。槲皮素具有抗氧化、抗病毒、抗菌抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種作用，其抗炎作用可能是通過抑制NF-κB和MAPK信號通路[19]，實驗研究顯示其可有效改善小鼠免疫力低下狀態(tài)[20]。β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種作用[21-23]。故補腎明目口服液多種活性成分通過多種不同方式達到對葡萄膜炎的治療作用。

富集分析顯示，補腎明目口服液治療葡萄膜炎的核心靶點為：PTGS2、RELA、CASP3、PIK3CG、JUN、BCL2、TNF等，主要通路為糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、EB病毒感染、MAPK信號通路、瘧疾、NF-κB信號通路等，共同靶點與核心團簇靶點通路中均有TNF和NF-κB信號通路。以上靶點和信號通路主要與炎癥和免疫反應有關。研究顯示，葡萄膜炎患者中具有成熟表型的血液CD1c+mDC1顯著增加，且可能是由于血清中存在較高的腫瘤壞死因子(TNF-α)水平引起的，并且是p38MAPK依賴性的[24]，前期研究也表明，補腎明目口服液可以通過調(diào)節(jié)TNF家族的Fas蛋白的表達而對葡萄膜炎起治療作用。TNF在眼部炎癥中起著關鍵作用，TNF-α已成為非感染性葡萄膜炎生物治療的主要目標[25]，且抗TNF-α已越來越多的應用于治療眼部炎癥[26]。核因子-κB(NF-κB)是調(diào)節(jié)細胞增殖、炎癥反應和細胞黏附相關基因表達的最普遍的轉(zhuǎn)錄因子之一。多項研究表明，通過抑制NF-κB通路，可以有效抑制實驗型葡萄膜炎的炎癥反應[27-31]。氧化應激可以激活NF-κB ，從而產(chǎn)生眼部炎癥，許多細胞因子例如TNF-α的產(chǎn)生是通過NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄激活介導的，因此NF-κB抑制劑及抗氧化劑阻止了NF-κB依賴的眼部炎癥的激活[32]。自身免疫性葡萄膜炎中，通過活化MAPK亞族的JNK細胞通路，可調(diào)控氧化應激，從而減輕疾病癥狀[33]。故補腎明目口服液口服液通過抑制TNF和NF-κB信號通路、活化MAPK信號通路等可以有效的治療葡萄膜炎。

綜上，前期實驗已驗證補腎明目口服液可以通過TNF通路發(fā)揮治療葡萄膜炎的作用，通過網(wǎng)絡藥理學的方法，為后期的基礎實驗和臨床驗證提供思路，為補腎明目口服液的臨床應用提供更詳細準確的科學依據(jù)。