童洋萍 黃超平 王 振 唐建生 徐 偉 李芳毅 胡 玨

南華大學附屬長沙中心醫(yī)院，湖南 長沙 410004

卒中是全球第二大死亡原因，也是致殘的主要原因，在發(fā)展中國家發(fā)病率越來越高［1］，給經(jīng)濟及社會發(fā)展帶來沉重負擔。研究表明，87%的卒中是缺血性卒中［2-3］，缺血性腦卒中發(fā)病過程中伴隨多個基因表達的改變，這些基因表達的上調(diào)或下調(diào)對疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸起重要作用［4-5］，因而從分子水平揭示缺血性腦卒中的發(fā)病機制成為治療該病的研究重點［6］。而目前臨床尚未有分子標志物或基因可以準確反映腦卒中的發(fā)病機制或預測疾病的預后結(jié)局，因此，發(fā)現(xiàn)某一基因或分子標志物能夠反映腦卒中的具體進展過程，成為亟需解決的課題。研究發(fā)現(xiàn)PADI4 基因與缺血性腦卒中的發(fā)病密切相關(guān)，但尚未檢索到PADI4 在腦卒中作用的報道。肽基精氨酸脫亞胺酶（peptidyl arginine deiminase，PAD 或PADI）是一類介導修飾翻譯后蛋白質(zhì)瓜氨酸化的鈣依賴性半胱氨酸水解酶家族［7-8］，包含5種同工酶，表達于特異性組織和作用于不同的靶蛋白，與炎癥性疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病和基因調(diào)控有關(guān)。肽酰精氨酸脫亞胺酶-4（PADI4）是其中的一員，主要表達于造血組織，如外周血的中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和單核細胞［9-10］，在中性粒細胞和巨噬細胞介導的炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用［11］，參與了感染性疾病、自身免疫性疾病和缺血性疾病等發(fā)病過程［12-14］。多項研究報道抑制PADI4可以保護某些器官免受缺血性損傷。DU等［15］研究發(fā)現(xiàn)特異性抑制PADI4 可能是減輕腎缺血-再灌注損傷并發(fā)遠端肺損傷的有效策略；LANGE 等［8］研究發(fā)現(xiàn)藥理抑制PADI4 能顯著減輕新生兒缺氧缺血性腦損傷。盡管目前有關(guān)PADI4 在缺血性疾病中的研究逐漸增加，但絕大多數(shù)局限在動物研究模型，且部分動物研究結(jié)果關(guān)于PADI4 在缺血性疾病中的作用存在沖突。DU 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，特異抑制PADI4 可減少急性心肌梗死誘導的中性粒細胞浸潤、中性粒細胞細胞外陷阱（neutrophil extracellular，NETs）、炎癥反應(yīng)和心肌細胞凋亡。而EGHBALZADEH 等［16］研究表明PADI4缺乏加重心肌梗死后急性炎癥，增加組織損傷。因此，本研究從臨床上研究腦梗死患者和非腦梗死患者PADI4 的變化情況，希望從分子水平方面為腦梗死的治療提供可供參考的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020-03—10 南華大學附屬長沙市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治住院的40例急性腦梗死患者，男30例，女10例，年齡64（56～69）歲；均符合《2018 中國急性缺血性卒中診治指南》制定的腦梗死標準。納入標準：（1）年齡30～80 歲，發(fā)病24 h 內(nèi)入院；（2）TOAST 分型為大動脈粥樣硬化型或小血管閉塞型患者；（3）3 個月后電話隨訪無失聯(lián)。排除標準：（1）存在其他神經(jīng)系統(tǒng)合并疾病，如顱腦外傷或腦腫瘤者；（2）感染或有嚴重肝、腎功能障礙者；（3）存在惡性腫瘤、風濕免疫性疾病、冠心病或周圍血管閉塞性疾病患者。對照組為40例同期收治住院的與病例組年齡相匹配的非腦梗死患者，同樣按照上述剔除標準篩選，其中男17 例，女23 例，年齡57（50～65）歲。該項檢測經(jīng)院倫理委員會認可，均簽署知情同意書。

1.2 實驗材料與方法

1.2.1 臨床資料：記錄病例組及對照組的臨床基線資料、病例組影像學檢查（梗死部位、顱內(nèi)外血管情況確定TOAST分型）、實驗室檢查指標（血脂、血同型半胱氨酸、白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、單核細胞計數(shù)等）以及病例組NIHSS評分、90 d mRS評分（將mRS評分0～1分定義為預后良好，mRS評分≥2分定義為預后不良）。

1.2.2 實驗方法：入院當天抽取外周靜脈血2 mL，用紅細胞裂解法提取白細胞（北京索萊寶科技有限公司），提取白細胞內(nèi)的總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（北京全式金生物公司），再用RT-qPCR 技術(shù)檢測PADI4 的相對表達量（Real-Time PCR System 為美國ABI 公司）。PADI4 和內(nèi)參GAPDH 的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。具體序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primers for Real-Time quantitative PCR

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標準差（±s）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布的采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距描述，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數(shù)資料采用卡方檢驗，必要時使用Fisher 確切概率法；多因素分析采用二元Logistic回歸分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。診斷試驗效能的評價采用ROC 曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 2 組臨床資料比較病例組與對照組性別、高血壓、血同型半胱氨酸、白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2 組年齡、吸煙史、飲酒史、糖尿病、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、單核細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 病例組與對照組基線資料比較Table 2 Comparison of baseline data of case group and control group

2.2 PADI4 相對表達量在2 組中的表達情況及與腦梗死預后的關(guān)系

2.2.1 PADI4 在2 組的表達情況：PADI4 在病例組中的相對表達量為1.06（0.91～1.21），對照組為0.86（0.80～0.95）。病例組的相對表達量較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖1。2.2.2 Logistic 回歸分析：采用二元Logistic 回歸分析，分別納入PADI4相對表達量、性別、原發(fā)性高血壓、血同型半胱氨酸、糖尿病、白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)等相關(guān)指標，結(jié)果顯示病例組PADI4 相對表達量高于對照組（OR=42.33，95% CI：2.293～778.013，P=0.012），同時血同型半胱氨酸和糖尿病高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；2 組性別、原發(fā)性高血壓、白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

圖1 PADI4在病例組和對照組中的相對表達量Figure 1 The relative expression of PADI4 in the stroke group and control group

表3 Logistic回歸分析Table 3 Logistic regression analysis

2.2.3 病例組PADI4 相對表達量與預后的關(guān)系：PADI4 在預后良好組（mRS 0～1）的相對表達量為1.07（0.97～1.25），預后不良組（mRS≥2）的相對表達量為0.99（0.85～1.10），兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.133）。

2.3 PADI4 相對表達量的ROC 曲線分析繪制PADI4 相對表達量的ROC 曲線，進行診斷試驗效能的評價，AUC為0.759，PADI4用于診斷腦梗死的敏感度為70.0%，特異度為82.5%，P＜0.001。見圖2。

圖2 PADI4相對表達量在腦梗死中的診斷價值Figure 2 Diagnostic value relative expression of PADI4 in cerebral infarction

3 討論

腦梗死是腦卒中的主要類型，具有發(fā)病率高、復發(fā)率高、致殘率高、病死率高等特點［17-18］，病理生理機制復雜，環(huán)境及遺傳因素均參與其發(fā)病過程［19］。盡管目前缺血性腦卒中的病理生理學及其導致缺血性損傷的潛在機制已經(jīng)取得相當大的進展，但仍存在治療困難等問題。研究報道PADI4 基因與缺血性腦卒中的發(fā)病密切相關(guān)，但尚未檢索到關(guān)于PADI4在腦卒中的作用報道。本研究首次對腦梗死患者血液中的PADI4相對表達量展開研究，以評估其在腦梗死過程中的作用，并嘗試分析其分子機制，希望為腦梗死的治療提供理論依據(jù)。

研究顯示，PADI4在缺血等各種病理條件下引起的炎癥反應(yīng)和NETs的形成中起關(guān)鍵作用［20-21］。研究顯示，PADI4 是不依賴NADPH的NETs所必需的酶，PADI4能將蛋白質(zhì)、自身抗體和組蛋白H3 和H4 上的精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸化，而組蛋白H3和H4的瓜氨酸化與NET的釋放特別相關(guān)，能迅速形成NETs［22］，反映了NETs 的出現(xiàn)情況［23］。有證據(jù)表明NETs 作用于靜脈和動脈血栓的形成，在動脈粥樣硬化和血栓形成中起決定性作用［24-27］。NETs通過誘導氧化應(yīng)激、誘導內(nèi)皮細胞功能障礙和凋亡以及形成一種纖維蛋白樣的堿基使血小板黏附、激活和聚集等促進血栓形成［25］，其提供了炎癥、血栓形成、氧化應(yīng)激和心血管疾病之間先前未知的聯(lián)系。LIU 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，PADI4 基因敲除的小鼠患動脈粥樣硬化的概率相對更低。LING等［29］研究發(fā)現(xiàn)Nets可促進冠狀動脈微血栓形成，采用PADI4抑制劑可降低心肌梗死和動脈粥樣硬化的發(fā)病率。本研究發(fā)現(xiàn)PADI4 在病例組中的相對表達量較對照組顯著升高，由于腦梗死的發(fā)病與高血壓、性別、糖尿病等危險因素相關(guān)，因此，通過Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，PADI4相對表達量與腦梗死的發(fā)生獨立相關(guān)，提示PADI4在腦梗死的發(fā)生過程中可能充當危險因子，推測通過抑制PADI4的形成或降低PADI4的水平可以抑制NETs的形成而預防動脈粥樣硬化的形成或減少輕動脈粥樣硬化的程度，起到腦卒中的一級預防作用。KANG等［30］在腦缺血動物模型中發(fā)現(xiàn)，缺血腦組織中存在PADI4的上調(diào)，PADI4的過度表達導致中性粒細胞胞外網(wǎng)狀陷阱形成增加，伴隨著新生血管的減少和血-腦脊液屏障損傷的增加。同樣RABADI 等［31］在腎缺血/再灌注損傷動物模型中也發(fā)現(xiàn)PADI4 上調(diào)的情況。本研究發(fā)現(xiàn)PADI4 相對表達量在病例組中明顯升高，從側(cè)面驗證了臨床和動物實驗具有一定的一致性，PADI4基因的上調(diào)促進了腦梗死的發(fā)生。腦梗死后的病理生理機制包括興奮性氨基酸毒性、鈣超載、神經(jīng)元凋亡、炎癥反應(yīng)等。腦梗死發(fā)生后伴隨細胞內(nèi)鈣水平增加［32-33］，而PADI4 是一種Ca2+依賴酶，需要提高Ca2+水平來激活［34］，因此推測腦梗死后可能伴隨PADI4活性的增強，鈣拮抗劑治療可降低PADI4的活性，從而抑制梗死后炎癥反應(yīng)的程度。

SHIMONAGA 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，PADI4 反映NETs 的出現(xiàn)情況，在不穩(wěn)定性頸動脈斑塊中有較高的表達。KIM等［35］動物研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死后PADI4 在腦實質(zhì)和血中性粒細胞中表達顯著增強，誘導組蛋白中的瓜氨酸酸化并釋放NETs，加重炎癥和腦損傷。VAIBHAV 等［36］研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷性腦損傷患者中，PADI4 介導的NETs會加重急性神經(jīng)損傷和腦血管功能障礙，靶向治療可改善患者預后。因此，推測PADI4可能通過NETs的形成參與腦梗死的發(fā)展及加重腦損傷，PADI4 抑制劑或抑制NETs的形成可作為臨床上治療腦梗死的一種可選手段。

研究表明炎癥-免疫參與了腦梗死的病理生理過程，腦梗死發(fā)生后血-腦脊液屏障被破壞，炎癥細胞侵入缺血腦組織，進而產(chǎn)生細胞因子和黏附分子，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，造成腦組織損傷；免疫介質(zhì)能促炎癥發(fā)展，促進缺血影響區(qū)域內(nèi)眾多炎癥細胞類型，包括各種亞型T細胞、單核細胞-巨噬細胞、中性粒細胞等的滲透，這個過程導致大腦進一步的缺血性損傷［37］。最新一些關(guān)于腦梗死后的后期分子機制研究進一步闡述了分子信號通路在腦梗死后發(fā)揮重要作用，如IL-6/STAT3 通路的激活以及VEGF-A/MMP-9信號的衰減與尿素影響卒中后的神經(jīng)炎癥和細胞凋亡相關(guān)［38］；下調(diào)TLR4、p-NF-κB、pro-Caspase-1、Caspase-1 等TLR4/NF-κB/NLRP3 信號通路相關(guān)蛋白可增加缺血性腦卒中后新生神經(jīng)元數(shù)量和腦微血管密度［39］。雖然隨著炎癥分子及信號通路等各方面的研究不斷深入，對理解腦梗死后的分子機制越來越深刻，但反映臨床病程進展的分子標志物尚未明確證實。WU 等［40］通過一項19 873人的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，TNF-α的基因多態(tài)性和循環(huán)水平與缺血性腦卒中有關(guān)，可能作為分子標志物。本研究發(fā)現(xiàn)PADI4 在腦梗死患者中高表達，推測PADI4可能是研究腦梗死病理機制的一種新的生物學標志物。

關(guān)于腦梗死的預后分析顯示，PADI4相對表達量在預后良好組與預后不良組中無明顯差異。分析產(chǎn)生陰性結(jié)局的原因有樣本量較小、納入分析的腦梗死患者初始發(fā)病神經(jīng)功能缺損癥狀較輕，90 d mRS 差異較小等。以非腦梗死患者為參照繪制ROC 曲線，顯示PADI4 相對表達量對腦梗死有較好的診斷效能，可作為腦梗死發(fā)病機制的一種新的診斷標志物。

本研究發(fā)現(xiàn)PADI4 相對表達量與腦梗死的發(fā)生獨立相關(guān)，對腦梗死的發(fā)病有一定的診斷效能，其可能參與了腦梗死的發(fā)生及發(fā)展。PADI4 可能通過NETs 對腦梗死造成損傷，可作為研究腦梗死病理機制的一種新的生物學標志物。