魏永成 張 勇 孟景祥 仲崇祿

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所 廣州 510520)

近年來，天然林資源逐漸減少，人工林面積不斷增加，各種逆境條件下森林面積逐步擴(kuò)大(Kullanetal.,2016)。然而在林木改良過程中，人們忽視了育種策略的有效推進(jìn)，從而使森林病害頻發(fā)，林木受損嚴(yán)重，甚至造成毀滅性災(zāi)害(Sakirogluetal.,2012)。利用抗性資源培育抗病新品種替代受害植株，能夠加速育種進(jìn)程、改善森林生態(tài)效應(yīng)、推動(dòng)林業(yè)高效可持續(xù)發(fā)展(康向陽，2020)。為有效發(fā)掘抗性資源并提高林木抗性育種效率，認(rèn)識(shí)和研究林木抗性的變異模式、變異特征等基礎(chǔ)規(guī)律十分必要。

林木抗性強(qiáng)弱與其生理生化性狀關(guān)系密切，而生理生化性狀與植物生長(zhǎng)發(fā)育之間存在一定相關(guān)性，因此利用生理生化性狀對(duì)林木進(jìn)行早期選擇具有可行性。近年來，從生理生化角度探索林木早期預(yù)測(cè)己引起學(xué)者重視，如不同種源樟樹(Cinnamiomumcamphora)的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(peroxidase,POD)活力和葉綠素含量差異顯著，其抗脅迫能力也呈顯著差異(馬一丹，2019)；不同品種櫟樹(Quercus)苗期抗寒性差異顯著，基于SOD、POD等生理生化性狀可進(jìn)行早期選擇(楊振亞，2016)；苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)活力與木質(zhì)素及其次生代謝產(chǎn)物的合成密切相關(guān)，活力越高，物質(zhì)的合成代謝越強(qiáng)，植株的抗性能力越強(qiáng)。

酚類化合物包括總酚、類黃酮、花青素和酚酸衍生物，是一類重要的抗氧化劑，主要通過苯丙烷途徑在葉綠體或細(xì)胞質(zhì)中合成(Boudet，2007；Khoddamietal.，2013)。酚類化合物在植物體內(nèi)可發(fā)揮重要作用，如防御昆蟲侵襲，防止真菌、細(xì)菌或病毒病原體感染(Daglia，2012)，保護(hù)DNA免受氧化損傷(Agatietal.，2010)等。研究發(fā)現(xiàn)，受到生物侵襲后，類黃酮化合物迅速大量合成并能夠直接產(chǎn)生免疫反應(yīng)(Kingetal.，1999)。同時(shí)，酚類化合物還可通過直接中和活性氧(reactive oxygen species,ROS)限制葉綠體中的ROS以降低氧化程度(Rice-Evansetal.,1997)。鑒于酚類化合物在植物體中的重要功能，研究不同種源植物體內(nèi)酚類化合物的差異很有必要，將為抗性種質(zhì)材料的篩選提供必要的理論支持。

木麻黃(Casuarinasspp.)抗風(fēng)、耐瘠薄，是我國(guó)華南地區(qū)營(yíng)建沿海防護(hù)林的先鋒樹種，在一些立地條件較差的沿海前緣沙質(zhì)地帶，甚至是唯一可造林的樹種(Zhongetal.,2010)，在抵御臺(tái)風(fēng)侵襲、保護(hù)農(nóng)田和城市中具有不可替代的作用，同時(shí)也具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(Zhongetal.,2013；Zhangetal.,2016)。青枯病(Ralstoniasolanacearum)是一種毀滅性植物土傳病害，傳播速度快、發(fā)病死亡率高，可危害54科200余種植物，包括許多具有重要經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值的植物(喬俊卿等，2013)，如煙草(Nicotianatabacum)、番茄(Lycopersiconesculentum)和桉樹(Eucalyptusspp.)等，是世界范圍內(nèi)最難防治的細(xì)菌性重大病害之一(Salanoubatetal.,2002；Sheetal.,2017)。木麻黃青枯病自發(fā)現(xiàn)以來，研究重點(diǎn)多集中在致病和抗病機(jī)制(Selvakesavanetal.,2016)等方面，在遺傳改良的基礎(chǔ)問題如抗性遺傳規(guī)律揭示、雜交育種等方面未見系統(tǒng)性報(bào)道。鑒于此，本研究以短枝木麻黃(Casuarinaequisetifolia)20個(gè)種源為試驗(yàn)材料，對(duì)小枝中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等酶活力以及可溶性糖、葉綠素、總酚、類黃酮含量8個(gè)生理生化性狀進(jìn)行檢測(cè)與分析，研究不同種源短枝木麻黃對(duì)青枯病的生理生化響應(yīng)，篩選和挖掘木麻黃抗青枯病優(yōu)良種源，以期為木麻黃抗病育種材料的選育和推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)地概況與研究方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于廣東省徐聞縣湛江國(guó)營(yíng)防護(hù)林場(chǎng)，地理位置 20°28′20″N，110°31′41″E。屬熱帶海洋性季風(fēng)氣候，全年陽光充足，年平均氣溫23.3 ℃，年平均降水量1 364 mm，全年無霜凍。土壤為濱海沙土，肥力較低。試驗(yàn)地前茬為木麻黃無性系林，青枯病暴發(fā)后砍伐清理。

種源試驗(yàn)林營(yíng)建于2014年4月，涉及21個(gè)種源，采用行列設(shè)計(jì)，每行1個(gè)種源，15株小區(qū)，6次重復(fù)(區(qū)組)。國(guó)際種源種子由澳大利亞種子中心提供，國(guó)內(nèi)種源種子由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所提供。本研究選擇試驗(yàn)林中20個(gè)種源開展試驗(yàn)，具體信息見表1。

表1 參試短枝木麻黃種源信息Tab.1 Origins of C． equisetifolia provenances and families

1.2 取樣方法

2019年8月于試驗(yàn)林內(nèi)取樣，鑒于試驗(yàn)林每個(gè)重復(fù)中種源保存率差異較大，取樣時(shí)單個(gè)小區(qū)各種源隨機(jī)選擇10株單株，6個(gè)小區(qū)選擇其中4個(gè)作為重復(fù)，每株選擇長(zhǎng)約40 cm的1年生小枝水培接種青枯菌；對(duì)選擇的10株單株，每株選擇直徑3 mm左右的當(dāng)年生褐梗小枝(當(dāng)年生小枝分為嫩枝、綠梗小枝和褐梗小枝，其中嫩枝和綠梗小枝尚未木質(zhì)化，不能反映材料的抗病或感病特性；褐梗小枝為木質(zhì)化程度較高的枝條，能反映出明顯的抗病或感病特征)截取2 cm，液氮保存，4次重復(fù)。

1.3 性狀測(cè)定與數(shù)據(jù)處理

水培小枝接種青枯菌(許秀玉，2017)，待處理間出現(xiàn)明顯差異時(shí)(約接種1個(gè)月)，調(diào)查接種青枯菌后木麻黃枝條萎蔫情況，計(jì)算植株的相對(duì)病害強(qiáng)度(relative disease intensity,RDI)，對(duì)枝條不同萎蔫程度進(jìn)行病情指數(shù)分析(郭權(quán)等，1986)。相對(duì)病害強(qiáng)度越低，植株受損越少，抗性強(qiáng)度越高，而病情指數(shù)越低，抗性強(qiáng)度越高。參考郭權(quán)等(1986)的木麻黃抗病性標(biāo)準(zhǔn)，以幼苗萎蔫數(shù)量替代死亡數(shù)量，將侵染后的木麻黃劃分為6個(gè)等級(jí)：0級(jí)，完全無萎蔫現(xiàn)象；1級(jí)，參試種源中<20%幼苗(株數(shù))出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象；2級(jí)，20%～40%幼苗出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象；3級(jí)，40%～60%幼苗出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象；4級(jí)，>60%幼苗出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象；5級(jí)，完全萎蔫或死亡。相對(duì)病害強(qiáng)度和病情指數(shù)計(jì)算公式如下：

相對(duì)病害強(qiáng)度(RDI)=萎蔫分枝數(shù)/分枝總數(shù)；

(1)

病情指數(shù)=∑(各級(jí)萎蔫株數(shù)×該萎蔫級(jí)值)/

(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值)×100。

(2)

式中：最高級(jí)值為病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中的最大值，即5級(jí)。

參考陳建勛等(2002)方法提取并測(cè)定各樣品生理性狀，包括超氧化物歧化酶(SOD,U·g-1)、過氧化氫酶(CAT，U·g-1)、過氧化物酶(POD,U·g-1)、苯丙氨酸解氨酶(PAL,U·g-1)等酶活力以及可溶性糖(mg·g-1)、葉綠素(mg·g-1)含量；參考王翠穎等(2012；2015)方法提取并測(cè)定總酚[mg·(100 g)-1FW]和類黃酮[mg·(100 g)-1FW]含量。各性狀重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

性狀間相關(guān)系數(shù)計(jì)算公式為：

(3)

利用SPSS和EXCEL軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan多重比較法對(duì)各種源進(jìn)行多重比較。方差分析模型為：

Yij=Bi+Pj+Eij。

(4)

式中：Bi為區(qū)組效應(yīng)；Pj為種源效應(yīng)；Eij為誤差項(xiàng)效應(yīng)。

基于測(cè)定的SOD、CAT、PAL等8個(gè)生理生化性狀均值對(duì)參試的木麻黃種源進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，指數(shù)選擇函數(shù)公式為：

(5)

式中：I為選擇指數(shù)值；wi為i性狀的評(píng)價(jià)權(quán)重；ui為i性狀的表型值。

通過主成分分析法計(jì)算生理生化性狀在綜合評(píng)價(jià)中所占權(quán)重(汪小欽等,2020)。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種青枯菌后種源病情特征分析

接種青枯菌后，各種源表現(xiàn)出不同的病情特征。有些種源(如18269、18119等)萎蔫枝條多，甚至植株完全死亡；有些種源(如18142、18403等)小枝生長(zhǎng)正常，顏色無顯著變化，僅少數(shù)小枝出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象。20個(gè)種源(圖1)病情特征結(jié)果表明，小枝接種青枯菌后病情指數(shù)和相對(duì)病害強(qiáng)度在種源間存在極顯著差異(P<0.01)，其中病情指數(shù)在種源間變幅為2.13～74.89，相對(duì)病害強(qiáng)度在種源間變幅為10.64%～93.62%。

圖1 各種源病情特征差異Fig.1 Variation of disease characteristics in provenances

2.2 種源間生理生化性狀變異分析

對(duì)各生理生化性狀進(jìn)行方差分析(表2)發(fā)現(xiàn)，PAL活力在種源間呈顯著差異，SOD、CAT、POD活力以及可溶性糖、葉綠素、總酚和類黃酮含量在種源間均呈極顯著差異。這表明參試種源性狀變異幅度大，具有較強(qiáng)選擇潛力。

木麻黃各種源SOD、CAT、POD、PAL活力以及可溶性糖、葉綠素、總酚、類黃酮含量的總平均值(表2)分別為335.19 U·g-1、16.84 U·g-1、49.05 U·g-1、179.93 U·g-1、19.67 mg·g-1、1.60 mg·g-1、945.45 mg ·(100 g)-1和111.33 mg ·(100 g)-1，變異系數(shù)分別為17.75% 、27.72%、64.31%、38.65%、25.31%、16.63%、44.00%和29.50%，性狀均值最大種源分別為最小種源的1.61、2.74、13.75、2.46、2.43、1.98、2.93和2.59倍。這進(jìn)一步說明種源間的變異幅度大，有必要進(jìn)行種源間選擇。

表2 種源間生理生化性狀的多重比較分析①Tab.2 Multiple comparative analysis of physiological and biochemical traits among provenances

2.3 生理生化性狀間及與病情特征相關(guān)分析

木麻黃20個(gè)種源生理性狀間相關(guān)性分析(表3)表明，SOD活力與CAT活力、總酚含量、類黃酮含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.233～0.330，與POD活力、葉綠素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。CAT活力與PAL活力、可溶性糖含量、總酚含量和類黃酮含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.319～0.466,與POD活力和葉綠素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。總酚含量與類黃酮含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.722?？梢?，SOD、CAT、PAL活力以及可溶性糖、總酚和類黃酮含量增加對(duì)POD活力和葉綠素含量會(huì)產(chǎn)生一定抑制作用。

表3 8個(gè)生理生化性狀間相關(guān)性分析①Tab.3 Correlation analysis among eight physiological and biochemical traits

木麻黃20個(gè)種源生理生化性狀與病情特征相關(guān)性分析(表4)表明，生理生化性狀與病情特征間均達(dá)到顯著或極顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)程度。SOD和CAT活力等6個(gè)生理生化性狀與病情特征間呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.823～-0.418，其中類黃酮含量與相對(duì)病害強(qiáng)度間的負(fù)相關(guān)程度最高，相關(guān)系數(shù)為-0.823，POD活力和葉綠素含量與病情特征間呈極顯著或顯著正相關(guān)。這表明生理生化性狀和病情特征可能受相同或類似的調(diào)控機(jī)制控制，SOD活力和類黃酮含量等生理生化性狀表現(xiàn)越強(qiáng)，植物病害程度越低。

表4 生理生化性狀與病情特征間相關(guān)性分析①Tab.4 Correlation analysis among physiological and biochemical traits and disease index

2.4 優(yōu)良種源選擇

將數(shù)據(jù)按極差法標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，SOD、CAT、POD、PAL活力及可溶性糖、葉綠素、總酚、類黃酮含量8個(gè)生理生化性狀的權(quán)重分別為0.095 5、0.125 2、0.087 5、0.140 7、0.136 5、0.090 3、0.147 6和0.176 6，根據(jù)選擇指數(shù)排序，按照30%的入選率篩選出18144、18142、18135、18355、18128和18122共6個(gè)優(yōu)良種源，其SOD、CAT、PAL活力以及可溶性糖、總酚和類黃酮含量均值比總體均值分別高1.35%、25.32%、13.19%、19.69%、32.52%和32.24%；相對(duì)地，入選種源的POD活力和葉綠素含量均值比總體均值分別低42.91%和26.37%(表5)。

表5 優(yōu)良種源篩選及各性狀表現(xiàn)Tab.5 Selection of superior provenances and families and their traits

3 討論

3.1 優(yōu)良種源的篩選

為篩選出適宜病害區(qū)推廣的種質(zhì)材料，應(yīng)從盡可能大的區(qū)域范圍內(nèi)收集種源，并結(jié)合抗病特性與生理生化性狀比較不同種源間的差異。本研究基于不同國(guó)家和地區(qū)的20個(gè)種源，通過分析不同種源短枝木麻黃對(duì)青枯病的生理生化響應(yīng)開展優(yōu)良種源篩選，充分挖掘了短枝木麻黃的優(yōu)良種源及其育種潛力。

短枝木麻黃接種青枯菌后各種源病情特征存在顯著差異，生理生化性狀變異幅度較大，具有較強(qiáng)選擇潛力。基于生理生化性狀進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，按照30%的入選率篩選出6個(gè)優(yōu)良種源，優(yōu)良種源的生理生化性狀表現(xiàn)與小枝接種青枯菌后的病情特征基本相符，病情指數(shù)和相對(duì)病害強(qiáng)度較低，萎蔫枝條少，生長(zhǎng)基本正常，這表明根據(jù)生理生化性狀篩選的優(yōu)良種源抗病性較強(qiáng)，可作為進(jìn)一步遺傳改良的材料。

3.2 防御酶系統(tǒng)的變異

植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，體內(nèi)一系列防御酶會(huì)發(fā)生廣泛的生理響應(yīng)，產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，其中關(guān)注較多的主要有SOD、CAT、POD和PAL等幾大類酶，如樟樹通過提高CAT含量抵御脅迫，桉樹通過SOD和POD增強(qiáng)抗性響應(yīng)脅迫，木荷(Schimasuperba)則在防御酶調(diào)節(jié)下體現(xiàn)其抗性(張海娜等，2019)。可溶性糖和葉綠素含量也是植物防御系統(tǒng)的重要評(píng)價(jià)性狀，種培芳等(2015)研究紅砂(Reaumuricasoongorica)對(duì)干旱脅迫的生理響應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉片和根系中可溶性糖等物質(zhì)含量變幅較大，與植物抗逆性密切相關(guān)，能夠在一定程度上反映出植物的抗性強(qiáng)弱；此外，葉綠素含量也是品種選育過程中的重要參考性狀(馬劍英等，2007)。本研究短枝木麻黃接種青枯菌后，SOD、CAT、POD活力以及可溶性糖和葉綠素含量在種源間差異達(dá)到極顯著水平，反映出短枝木麻黃不同種源間存在極為豐富的遺傳變異基礎(chǔ)，可為抗性種源選擇提供充足的材料保障。

掌握生理生化性狀間的相關(guān)關(guān)系，能夠大大縮短育種時(shí)間，降低遺傳改良成本，對(duì)于優(yōu)良種源選育工作具有重要指導(dǎo)意義。本研究不同種源短枝木麻黃生理生化性狀相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，POD活力與SOD、CAT、PAL活力呈極顯著負(fù)相關(guān)，可能是因?yàn)橹参锓烙赶到y(tǒng)發(fā)生生理響應(yīng)時(shí)SOD、CAT、PAL大量合成，活力較高，為避免抗氧化酶物質(zhì)積累過多對(duì)植株本身造成不良影響，POD含量降低，以維持防御酶系統(tǒng)的相對(duì)穩(wěn)定性，與郭祖國(guó)等(2018)研究結(jié)果相一致；同時(shí)，SOD、CAT和PAL活力與相對(duì)病害強(qiáng)度和病情指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，POD活力與相對(duì)病害強(qiáng)度和病情指數(shù)呈極顯著正相關(guān)，推測(cè)防御酶的調(diào)控機(jī)制與病害進(jìn)程協(xié)同進(jìn)行，選擇其中一種性狀會(huì)導(dǎo)致其他性狀同增或同減，這在遺傳改良過程中可充分利用。

3.3 次生代謝物質(zhì)在種質(zhì)材料間的差異

總酚和類黃酮是植物次生代謝物質(zhì)的重要組成部分，是植物正常生長(zhǎng)發(fā)育過程中必不可少的物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，核桃(Juglansregia)感染黑斑病(Xanthomonasjuglandis)后其總酚類物質(zhì)含量顯著升高，且早期變化與抗病性強(qiáng)弱呈顯著正相關(guān)，抗病性越強(qiáng)的無性系其積累量越高，可作為檢測(cè)抗病性的候選參考指標(biāo)(蔣時(shí)姣，2019)。不同地理種源紅松(Pinuskoraiensis)的總酚和黃酮含量差異顯著，受到病蟲危害后紅松次生代謝物質(zhì)呈上升趨勢(shì)(左彤彤等，2019)。韓晉等(2019)根據(jù)銀杏(Ginkgobiloba)葉片和花粉中總黃酮含量篩選出3個(gè)優(yōu)良單株，說明總黃酮在銀杏單株間也存在顯著或極顯著差異，具有極大選擇潛力。當(dāng)林木含水量高時(shí)，生理代謝旺盛，抗性強(qiáng)，如抗黑斑病(Marssoninabetulae)樺樹(Betulaspp.)葉片含水量顯著高于感病樺樹，且高抗植株中的苯丙氨酸解氨酶活性強(qiáng)、酚類物質(zhì)含量多(Green etetal.,2007)，與本研究結(jié)果一致。本研究不同種源短枝木麻黃總酚和類黃酮含量在種源間均達(dá)到極顯著差異，選擇次生代謝物質(zhì)含量高的種質(zhì)材料，可在一定程度上提高林木抗性，對(duì)林木抗性育種開展具有重要參考價(jià)值。

已有研究表明，許多植物體內(nèi)總酚和類黃酮物質(zhì)含量與抗病性相關(guān)，但這些次生代謝物質(zhì)參與抗病防御的具體作用機(jī)制尚未完全明確(Hassaneinetal.，2016)。因此，利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，包括多組學(xué)分析，揭示木麻黃響應(yīng)青枯菌的分子機(jī)制是木麻黃抗病育種的重要方向，尋找可能參與植物防御反應(yīng)的相關(guān)基因和代謝途徑，如感病后不同種質(zhì)材料內(nèi)類黃酮合成通路中關(guān)鍵酶或基因的變化規(guī)律，將有助于獲得抗病材料。

4 結(jié)論

接種青枯菌后，不同種源短枝木麻黃病情指數(shù)和相對(duì)病害強(qiáng)度差異顯著，保護(hù)酶系統(tǒng)和次生代謝物等性狀在種源間均呈顯著或極顯著差異，具有較強(qiáng)選擇潛力。根據(jù)生理生化性狀篩選出的6個(gè)抗病種源，可作為進(jìn)一步遺傳改良的材料。