文世濤 代琳心 劉杏娥 馬建鋒

(國際竹藤中心 竹藤科學與技術重點實驗室 北京 100102)

依據(jù)化學組成和微纖絲取向差異，植物細胞通常分為胞間層、初生壁和次生壁，其中次生壁是細胞力學承載的主體(Gibson，2012)。當植物細胞完成次生壁骨架結構組裝后，便從胞間層區(qū)域開始其木質化過程，木質素沿初生壁向細胞腔方向逐漸沉積(Higuchi，1990；Donaldson，2001)。伴隨著木質化過程的進行，相鄰細胞通過胞間層區(qū)域(細胞角隅胞間層和復合胞間層)相互黏連在一起形成木質部、韌皮部和維管束等植物組織(Grünwaldetal.，2002)。研究表明，當木、竹、藤材作為工程材料使用時，其力學失效往往發(fā)生在胞間層與次生壁連接區(qū)域(Qinetal.，2018；Wangetal.，2018)；在制漿造紙過程中，胞間層區(qū)域木質素的濃度和組成直接影響造紙工藝的選擇(Zhaoetal.，2018；Jinetal.，2019)。因此，胞間層區(qū)域的微納結構及化學組成對天然纖維原料實現(xiàn)高效利用具有重要影響。但受研究手段限制，學者們主要關注胞間層區(qū)域木質素濃度及其組成結構單元差異，而該區(qū)域的超微結構及多糖組成鮮見報道(Kimetal.，2015；Mellerowiczetal.，2001)。

目前，關于棕櫚藤微觀結構的研究主要聚焦于其解剖結構(組織比量、維管束分布、微纖絲取向)和超微結構(細胞次生壁分層結構、壁層厚度)隨藤種、生長周期、藤莖高度等因子的變異規(guī)律方面(Bhatetal.，1993；Schmittetal.，1995；Abasoloetal.，2000)，僅見劉杏娥等(2017)利用分子光譜成像技術分析了黃藤(Daemonoropsmargaritae)材細胞壁木質素分布，國內外未有關于藤材細胞間層超微結構及多糖組成的相關報道。鑒于此，本研究以我國重要商業(yè)藤種——單葉省藤(Calamussimplicifolius)為研究對象，采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)和共聚焦顯微拉曼光譜技術，對酸性亞氯酸鈉溶液處理的藤莖橫切面切片進行成像研究，分析不同類型細胞間層的微納結構特征及多糖組成特點，旨在深入理解藤材細胞壁生物合成規(guī)律和力學失效機制，為藤材增韌改性以及高性能藤基復合材料開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

多年生單葉省藤采自廣西憑祥熱帶林業(yè)實驗中心林場。從基部至梢部第5節(jié)節(jié)間截取完整藤莖，利用單面刀片切取靠近藤皮部分0.5 cm(長)×0.5 cm(寬)×1.0 cm(高)的樣品塊，使用滑走式切片機(Leica RM 2010R)切取15 μm厚樣品橫切面切片，保存于去離子水中供共聚焦顯微拉曼光譜成像用。

1.2 試樣制備

切取0.2 cm(長)×0.2 cm(寬)×1.0 cm(高)的藤莖置于0.5 mol·L-1亞氯酸鈉溶液中，75 ℃水浴鍋內處理1.0 h，15 μm厚樣品橫切面切片在相同條件下進行脫木質素處理。反應結束后，小心取出藤莖和切片，用去離子水反復沖洗至中性備用。

1.3 試樣觀測

1.3.1 透射電子顯微鏡(TEM)成像 部分脫除木質素的藤莖經無水乙醇梯度脫水后，采用Spurr低黏度樹脂逐級滲透，經100%樹脂滲透5 h的樣品條置于包埋板中，70 ℃烘箱固化24 h。頂端修整為梯形的包埋塊，使用超薄切片機(Leica EM-UC6)切取90 nm厚切片撈于覆膜銅網上備用，切片用鉆石刀為Diatome-Ultra 45°。室溫下用質量分數(shù)2%的檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾對切片染色5 min，蒸餾水反復沖洗3遍后自然晾干。利用JEM-1230透射電子顯微鏡在80 kV工作電壓下成像。

1.3.2 共聚焦顯微拉曼光譜成像 將15 μm厚樣品橫切面切片置于載玻片上，用無污染的勾線筆將切片平整展開，吸水紙吸取切片周圍多余水分，重新滴一滴去離子水，蓋玻片封片。采用共聚焦顯微拉曼光譜(LabRAM HR Evolution，HORIBA Jobin Yvon)進行光譜采集和成像，激發(fā)波長選擇532 nm，到達樣品的激光功率8 mW，測試光柵300 mm-1，狹縫寬度100 μm，掃描步距0.5 μm，單點光譜采集時間1 s，光譜測定范圍3 100～300 cm-1，光譜分辨率2 cm-1。為得到較高的空間分辨率，采用100倍油鏡(MPlan 100×Oil,NA=1.40；Olympus，Tokyo，Japan)進行顯微成像。利用LabSpec6軟件進行數(shù)據(jù)整體基線校正和光譜去卷積處理，并對特征峰峰面積進行成像分析。

2 結果與分析

2.1 藤材細胞間層的超微結構

TEM成像發(fā)現(xiàn)，單葉省藤材細胞具有類似于禾本科(Poaceae)毛竹(Phyllostachysedulis)的細胞超微結構特點(馮龍等，2020)，也可分為胞間層、初生壁和次生壁，其纖維細胞(圖1a)和薄壁細胞(圖1b)的角隅胞間層(cell corner middle lamella，ccml)和復合胞間層(compound middle lamella，cml，由初生壁和胞間層共同構成)均呈現(xiàn)較高的電子密度，主要源于雙染色劑與高濃度木質素特異性結合。從圖1a 和1c可以看出，木質素脫除存在明顯的選擇性，相較于cml區(qū)域，高度木質化ccml區(qū)域的木質素更易脫除。木質素脫除亦受細胞類型影響，與相鄰纖維細胞間的角隅胞間層(cell corner middle lamella among adjacent fibers，ff-ccml)和復合胞間層(compound middle lamella among adjacent fibers，ff-cml)相比，纖維細胞與薄壁細胞構成的角隅胞間層(cell corner middle lamella between fiber and parenchyma，fp-ccml)和復合胞間層(compound middle lamella between fiber and parenchyma，fp-cml)區(qū)域的木質素更難脫除。部分脫除木質素后，ff-ccml和ff-cml暴露出相互交聯(lián)的多孔纖絲狀網絡結構(圖1d箭頭所指區(qū)域)，部分纖維細胞中初生壁與次生壁之間發(fā)生層狀剝離，暴露出疏松的纖絲狀結構(圖1e)，而在其他區(qū)域整個間層完整剝離出來(圖1f)。同樣，在木、竹材的胞間層區(qū)域也具有類似的多孔結構，且孔隙間距受區(qū)域微纖絲致密程度影響(Suzukietal.，2001；Kimetal.，2015)。與纖維細胞不同，薄壁細胞間層則發(fā)生明顯潤脹和形變(圖1c)。

圖1 藤莖橫切面TEM圖像Fig.1 TEM image of cross section of rattan stema:對照組纖維細胞；b:薄壁細胞；c、d、e、f:脫除木質素樣品。ff-ccml：纖維細胞間角隅胞間層；pp-ccml：薄壁細胞間角隅胞間層；fp-ccml：纖維和薄壁細胞間角隅胞間層；ff-cml：纖維細胞間復合胞間層；pp-cml：薄壁細胞間復合胞間層；fp-cml：纖維和薄壁細胞間復合胞間層;f-s：纖維細胞次生壁；p-s：薄壁細胞次生壁；pw：初生壁。下同。a:Control fiber;b:Parenchyma;c,d,e,f:Delignified sections of rattan cane.ff-ccml:Cell corner middle lamella among adjacent fibers;pp-ccml:Cell corner middle lamella among adjacent parenchyma;fp-ccml:Cell corner middle lamella between fiber and parenchyma;ff-cml:Compound middle lamella among adjacent fibers;pp-cml:Compound middle lamella among adjacent parenchyma;fp-cml:Compound middle lamella between fiber and parenchyma;f-s:Fiber secondary wall;p-s:Parenchyma secondary wall;pw:Primary wall.The same below.

2.2 藤材細胞間層拉曼光譜分析

圖2a為藤材纖維和薄壁細胞不同形態(tài)區(qū)域的拉曼光譜，可以看出藤材細胞角隅胞間層(ccml)、復合胞間層(cml)和次生壁(secondary wall，s)拉曼光譜特征峰主要出現(xiàn)在2 942 cm-1(纖維素、半纖維素及木質素C—H非對稱伸縮振動)、2 897 cm-1(碳水化合物C—H、H—C—H伸縮振動)、1 598 cm-1(木質素芳香環(huán)對稱伸縮振動)、1 094 cm-1(纖維素C—O—C非對稱伸縮振動)、854 cm-1(果膠)、380 cm-1(纖維素O—H振動)等處(Agarwaletal.，1986；Bocketal.，2020；Gierlingeretal.，2012；Gierlinger，2018；Synytsyaetal.，2003)，多糖及木質素特征峰歸屬見表1。

表1 細胞壁多糖及木質素拉曼特征峰歸屬Tab.1 Raman band assignments of cell wall polysaccharides and lignin

對比不同形態(tài)區(qū)域與多糖相關的拉曼特征峰可以看出，纖維細胞次生壁(fiber secondary wall，f-s)和薄壁細胞次生壁(parenchyma secondary wall，p-s)存在較明顯的纖維素(380 cm-1)信號，而薄壁細胞間角隅胞間層(cell corner middle lamella among adjacent parenchyma，pp-ccml)和薄壁細胞間復合胞間層(compound middle lamella among adjacent parenchyma，pp-cml)存在較強的果膠類物質(854 cm-1)信號。1 247 cm-1和1 318 cm-1為木聚糖特征峰(Agarwaletal.，1997；Kaurkovetal.，1999)，對1 210～1 510 cm-1進行光譜去卷積處理，可以清楚區(qū)分出1 318 cm-1木聚糖特征峰，1 247 cm-1因與相鄰1 268 cm-1特征峰峰位具有較多重疊難于區(qū)分(圖2b)。

圖2 細胞壁不同形態(tài)區(qū)域拉曼光譜(a)及纖維細胞次生壁光譜去卷積(b)Fig.2 Average Raman spectra extracted from various cell wall layers (a)and deconvoluted spectra from fiber secondary wall (b)

2.3 藤材細胞間層拉曼光譜成像分析

2.3.1 細胞間層形態(tài)成像 藤材纖維細胞壁具有典型的胞間層和次生壁分層結構，且次生壁呈現(xiàn)出寬窄交替的同心層狀結構(厚度0.3～0.4 μm)(圖3a、b)。對碳水化合物及木質素C—H伸縮振動特征峰區(qū)域(2 789～3 000 cm-1)進行積分發(fā)現(xiàn)，纖維細胞、薄壁細胞以及細胞不同形態(tài)區(qū)域(ccml、cml、f-s和p-s)清晰可見(圖3c)。

圖3 藤材纖維細胞(a)和薄壁細胞(b)TEM圖像及細胞形態(tài)顯微拉曼光譜成像(c)Fig.3 TEM images showing wall ultrastructure of rattan fiber (a)and parenchyma (b)as well as Raman image showing the morphology of fiber and parenchyma (c)

2.3.2 細胞間層組分成像 作為細胞壁主要組分之一，木質素賦予了植物組織優(yōu)良的力學強度。對木質素芳香環(huán)伸縮振動特征峰區(qū)域(1 540～1 700 cm-1)進行積分，可以觀察到2種類型細胞壁層木質素不均一地脫除，細胞間層區(qū)域的木質素移除程度高于次生壁(圖4a)。對纖維素—OH特征峰區(qū)域(334～404 cm-1)進行積分，可以觀察到纖維素在細胞間層區(qū)域濃度較低，主要均一地分布于細胞次生壁中(圖4b)。對木聚糖特征峰區(qū)域(1 301～1 328 cm-1)進行積分，可以觀察到木聚糖主要沉積于纖維細胞次生壁(f-s)、薄壁細胞次生壁(p-s)和角隅胞間層(ccml)中(圖4c)，角隅胞間層區(qū)域木聚糖的沉積主要歸因于木聚糖的生物合成起始于初生壁以及次生壁外側臨近角隅胞間層的區(qū)域(Kimetal.，2010；Mortimeretal.，2015)，次生壁中高濃度木聚糖主要是由于半纖維素與木質素間存在復雜的酯鍵和醚鍵連接，酯鍵在酸性條件下很難斷裂，進而保留了部分木聚糖(Terrettetal.，2019)。對果膠類物質特征峰區(qū)域(830～860 cm-1)進行積分，可以觀察到果膠類物質在薄壁細胞次生壁(p-s)和薄壁細胞間復合胞間層(pp-cml)中廣泛分布(圖4d)，這些區(qū)域果膠的存在有利于細胞壁延展特性的維持(Cosgroveetal.，2018)。

圖4 藤材纖維細胞和薄壁細胞木質素(a)、纖維素(b)、木聚糖(c)及果膠類物質(d)顯微拉曼光譜成像Fig.4 Raman images showing the lignin (a),cellulose (b),xylan (c)and pectin (d)distribution within the fiber and parenchyma wall

3 結論

整合TEM與共聚焦顯微拉曼光譜成像技術，能夠成功揭示出藤材纖維細胞和薄壁細胞壁間層的超微結構特征及多糖組成特點。部分脫除木質素后，纖維細胞間的角隅胞間層呈現(xiàn)交聯(lián)的纖絲狀網絡結構，而薄壁細胞間層區(qū)域發(fā)生潤脹，細胞間隙增大?；瘜W成像進一步證實細胞間層區(qū)域中富含果膠類物質和少量木聚糖，而纖維素較為均一地分布于細胞次生壁中。