陳朝黎 余 紐 李榮生 鄒文濤 董明亮 朱茂成 楊錦昌

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所 廣州 510520； 2.南京林業(yè)大學(xué) 南京 210037)

萜類化合物是自然界中迄今為止種類最多的次生代謝產(chǎn)物(Ashouretal.，2018)，在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的生理生態(tài)作用。萜類可以幫助植物抵御外界干擾，也能促進(jìn)植物與其他生物群體互利共生(Tetali，2019)，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、園藝和香料(Wright，2005；Jenneweinetal.，2001；Ajikumaretal.，2010;C?retal.，2018)。鑒于萜類具有重要的開發(fā)利用價值，許多學(xué)者對萜類化合物生物合成的分子機(jī)制進(jìn)行了較深入的探索，以期通過分子生物學(xué)手段調(diào)控萜類化合物的產(chǎn)量。萜類合成酶(terpenoid synthases，TPS)是萜類化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，是影響萜類合成的重要因素。近年來國內(nèi)外已對多種植物的TPS基因進(jìn)行了鑒定和功能分析(Yahyaaetal.，2015；Martinetal.，2004)，其中研究最為廣泛的是擬南芥(Arabidopsisthaliana)。基于TPS的基因組測序，發(fā)現(xiàn)了40個擬南芥AtTPS基因家族(Aubourgetal.，2002)。通過對云杉屬(Picea)中多個種TPS基因家族的全基因組分析，已發(fā)現(xiàn)其中含69種特異性TPS基因(Keelingetal.，2011)。除此之外，許多學(xué)者還對其他植物進(jìn)行了TPS全基因組分析，如：葡萄(Vitisvinifera)(Martinetal.，2010)、番茄(Solanumlycopersicum)(Zhou，2020)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)(Yangetal.，2013)、毛果楊(Populustrichocarpa)(Irmischetal.，2014)、大麻(Cannabissativa)(Boothetal.，2020)及紅藻類(Rhodophyta)(Weietal.，2019)。

油楠(Sindoraglabra)為云實(shí)亞科(Caesalpinioideae)油楠屬(Sindora)高大喬木，也是國家二級重點(diǎn)保護(hù)野生植物，天然分布于我國海南島的陵水縣、保亭縣、五指山、樂東縣、東方市、昌江縣、白沙縣等地。自1981年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)油楠樹干可分泌出柴油狀的樹脂油后(黃全，1981)，有關(guān)油楠泌油特性及其機(jī)制的研究逐步深入。吳忠鋒等(2014)研究了油楠的泌油特征，發(fā)現(xiàn)油楠年泌油量因不同徑級和個體而差異較大，其變化幅度為0～3 L；陸碧瑤等(1982)分析了吊羅山油楠樹脂油的化學(xué)組分，初步檢測出11種倍半萜組分，其含量占總揮發(fā)油含量的95%以上；楊錦昌等(2016)對尖峰嶺7份油楠樹脂油的化學(xué)成分進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)油楠樹脂油中含有19種倍半萜，其平均含量占樹脂油的76.88%；Yu等(2020)對海南吊羅山、尖峰嶺等4個分布區(qū)的油楠樹脂油化學(xué)組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)樹脂油含有86%以上的倍半萜類，且其化學(xué)組分和含量在不同分布區(qū)存在較大差異。為探究油楠樹脂油富含倍半萜的成因，Yu等(2018)針對油楠成年植株開展了莖部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，挖掘獲得油楠倍半萜類生物合成關(guān)鍵基因SgSTPS1和SgSTPS2(Yuetal.，2018)。由于油楠莖部萜類化合物種類較多，其生物合成的關(guān)鍵基因仍有待進(jìn)一步解析。本研究在Yu等(2018)已獲得油楠倍半萜類生物合成關(guān)鍵基因的基礎(chǔ)上，以不同年齡油楠植株為研究對象，分離克隆出油楠樹脂油中倍半萜合成的關(guān)鍵基因SgSTPS3，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時在體外對該基因編碼的蛋白進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，并通過GC-MS鑒定其酶反應(yīng)產(chǎn)物，再通過熒光定量PCR等技術(shù)分析該基因在油楠不同年齡、不同器官中的表達(dá)情況，以及激素誘導(dǎo)下的表達(dá)變化，以全面解析SgSTPS3在萜類合成途徑中的生物學(xué)功能，為闡明油楠倍半萜類化合物的分子形成機(jī)制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

油楠幼株種植于中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所溫室，成年植株來自于該所后山。2019年12月，分別在4種不同株齡(0.5、1.5、15、30年生)的植株上采集根、韌皮部、木質(zhì)部、老葉、嫩葉5種器官。2020年6月，對2年生油楠幼株進(jìn)行激素誘導(dǎo)處理，分別于0、6、12、24、48、72 h采集葉片。

1.2 油楠SgSTPS3基因的克隆

根據(jù)已有油楠轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的序列信息，設(shè)計開放閱讀框兩端的引物SgSTPS3 F/R(表1)。用RNA提取試劑盒(TIANGEN，DP441)提取成年油楠植株莖部的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TARAKA，6110A)合成cDNA。以cDNA為模板通過高保真酶(TOYOBO，KOD-401)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶進(jìn)行純化回收(TIANGEN，DP209)。與pEASYBlunt Zero(TransGen，CB501)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆菌落，菌液PCR檢測后，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，提取重組質(zhì)粒。

1.3 生物信息學(xué)分析

通過NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST在線分析，找到與該基因相似性高的同源序列，初步判斷基因的類型。通過軟件DNAman與油楠倍半萜合成酶SgSTPS1、SgSTPS2基因序列進(jìn)行序列比對。ORF finder翻譯出該基因所編碼的氨基酸序列，通過在線軟件ProtParam分析氨基酸序列的相對分子量、等電點(diǎn)、分子式等理化性質(zhì)；使用軟件Protscale對氨基酸序列的親疏水性進(jìn)行分析；利用 NetPhos3.1server對SgSTPS3基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析；使用軟件TMpred對氨基酸序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；使用軟件Signal P4.1 Server分析相應(yīng)蛋白的信號肽；用TargetP和Uniprot對該蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；使用在線軟件SOPMA對蛋白質(zhì)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；在線軟件SWISS-MODEL進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。使用軟件Jalview進(jìn)行氨基酸序列同源性分析；通過在線軟件InterPro分析蛋白的結(jié)構(gòu)域；軟件MAGE 7 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

以pET-30a為表達(dá)載體，提取質(zhì)粒。選擇合適的限制性酶切位點(diǎn)BamHⅠ、XhoⅠ，設(shè)計表達(dá)引物SgSTPS3-BamHⅠ及SgSTPS3-XhoⅠ (表1)，將基因克隆獲得的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測后純化回收，將pET30a載體質(zhì)粒與目的片段同時進(jìn)行雙酶切后連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10感受態(tài)中，檢測篩選出陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證。將pET-30a-SgSTPS3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21，熱激后涂布在含Kan抗生素的LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后挑取單克隆到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約為0.6，添加誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，分別置于20 ℃條件下培養(yǎng)16 h、37 ℃條件下培養(yǎng)4 h，以未添加誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)皿為陰性對照。誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液離心，棄上清，收集菌體。將收集到的菌體加入PBS(pH7.4)中懸浮，使用超聲破碎儀使其充分溶解，離心。離心后的沉淀在緩沖液A(8 mol·L-1Urea、50 mmol·L-1Tris-HCl、300 mmol·L-1NaCl，pH8.0)中溶解，分別對上清和沉淀處理，制樣，SDS-PAGE 檢測。并將檢測后的菌液進(jìn)行大量表達(dá)。

1.5 原核蛋白純化

將大量表達(dá)的細(xì)胞菌體用緩沖液B(50 mmol·L-1Tris、300 mmol·L-1NaCl、0.2 mmol·L-1PMSF、0.1%TritonX-100，pH8.0)溶解、超聲破碎，離心收集上清粗蛋白。取5 mL Ni-NTA，用5倍柱床體積的緩沖液C (50 mmol·L-1Tris、300 mmol·L-1NaCl，pH8.0)清洗平衡柱，流速5 mL·min-1；將粗蛋白與平衡后的柱填料孵育1 h；將孵育后的產(chǎn)物上柱，收集流出；用結(jié)合緩沖液(50 mmol·L-1Tris、300 mmol·L-1NaCl，pH8.0)清洗平衡柱；用3種不同規(guī)格洗滌液(50 mmol·L-1Tris、300 mmol·L-1NaCl、20/50/500 mmol·L-1Imidazole)洗柱，并分別收集流出；對粗蛋白、洗雜流出、洗脫流出分別處理，制樣，準(zhǔn)備SDS-PAGE 檢測。將純度較好的組分透析到緩沖液D (50 mmol·L-1Tris、300 mmol·L-1NaCl，pH8.0)中，透析結(jié)束后用 PEG20000濃縮，0.45μm濾膜過濾后分裝，-80 ℃保存。

1.6 目的蛋白檢測

將純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測蛋白分子量；同時，將純化后的蛋白在250 mA恒流條件下冰上濕轉(zhuǎn)膜90 min，孵育抗體，一抗為兔抗His標(biāo)簽(Sangon Biotech，D110002)，二抗為羊抗兔IgG-HRP(Sangon Biotech，D110058)，隨后用TMB顯色試劑盒進(jìn)行顯色檢測；最后用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.7 體外酶活反應(yīng)及GC-MS分析

分別以法尼基焦磷酸(FPP)與香葉基焦磷酸(GPP)為底物，對純化蛋白SgSTPS3進(jìn)行體外表達(dá)鑒定(Yuetal.，2018)，反應(yīng)在含有3.5 μg純化蛋白和50 μmol·L-1GPP/FPP底物的500 μL測定緩沖液(5 mmol·L-1DTT，100 mmol·L-1KCl，5 mmol·L-1MgCl2，50%甘油，25 mmol·L-1Tris-HCl，pH7.4)中進(jìn)行。反應(yīng)體系置于2 mL的棕色玻璃瓶中，30 ℃水浴5 h。然后將樣品采用固相微萃取系統(tǒng)萃取30 min，并通過具有HP-5 MS色譜柱(30 m×0.25 mm)的氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)系統(tǒng)7890B-5977A(Agilent Technologies)進(jìn)行分析。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為He氣，流速為1.0 mL·min-1，電離能為70 eV，質(zhì)量掃描范圍為30～350 Amu，不分流進(jìn)樣。升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0 ℃，保持1 min，隨后以5 ℃·min-1的速率升溫至80 ℃，保持1 min，然后以10 ℃·min-1的速率升溫至220 ℃，持續(xù)10 min。通過NIST14質(zhì)譜庫數(shù)據(jù)庫檢索，并將樣品保留時間、質(zhì)譜與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，選擇匹配度大于90%的化合物進(jìn)行鑒定。

1.8 基因表達(dá)分析

為進(jìn)一步了解倍半萜合成酶基因SgSTPS3在油楠體內(nèi)的時間和空間表達(dá)模式，分別取0.5、1.5、15、30年生油楠植株的根部、韌皮部、木質(zhì)部、嫩葉、老葉，每個處理2個生物學(xué)重復(fù)，分析該基因在4個不同株齡5個不同器官中的表達(dá)狀況。分析SgSTPS3在同一株齡不同器官中的相對表達(dá)量時，以各自株齡基因表達(dá)量最低的器官為對照；分析SgSTPS3在不同株齡同一器官中的相對表達(dá)量時，以0.5年生的器官作為對照。為檢測該基因?qū)τ谕庠醇に氐捻憫?yīng)模式，通過水楊酸(SA，50 μmol·L-1)和茉莉酸甲酯(MeJA，100 μmol·L-1)以及混合激素SA(50 μmol·L-1)+MeJA(100 μmol·L-1)澆灌噴灑2年生油楠幼株誘導(dǎo)基因的表達(dá)，以不添加激素的溶液作為對照組(CK)。并在處理后的0、6、12、24、48、72 h取頂端以下成熟葉片2片，每個處理3個生物學(xué)重復(fù)，以0 h基因表達(dá)量作為對照。將以上樣品，提取其RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計基因序列熒光定量RT-PCR引物qSgSTPS3 F/R，以Actin-2作為內(nèi)參基因(引物信息見表1)，用SYBR Premix Ex Taq II(TARAKA，RR820A)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。實(shí)時熒光定量的反應(yīng)體系為20 μL，每個樣品3個技術(shù)重復(fù)，反應(yīng)過程在LightCycler96熒光定量PCR儀上進(jìn)行。用2-ΔΔCt法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表1 試驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in the test

2 結(jié)果與分析

2.1 SgSTPS3基因的克隆與生物信息學(xué)分析

以油楠木質(zhì)部cDNA模板，通過PCR擴(kuò)增獲得CDS片段 (圖1)，其開放閱讀框?yàn)? 701 bp，編碼566個氨基酸(GenBank登錄號：MW345633)。該基因與Yu等(2018)克隆的基因SgSTPS1(Cluster-32860.19290，編碼549個氨基酸)及SgSTPS2(Cluster-32860.116868，編碼577個氨基酸)的基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示與SgSTPS1間核酸序列相似性為58.17%，與SgSTPS2相似性為59.82%，本研究將其命名為SgSTPS3。SgSTPS3蛋白的理論分子量為64.82 kDa，等電點(diǎn)為5.43，分子式為C29H4502N770O867S14，不穩(wěn)定系數(shù)40.17，屬于不穩(wěn)定蛋白。該蛋白為親水性蛋白，含有51個可信度高的磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸24個、酪氨酸14個、蘇氨酸13個。其跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，有4個比較明顯的氨基酸跨膜區(qū)，由內(nèi)向外的區(qū)域位于第22-44位、412-436位，由外向內(nèi)的區(qū)域位于第294-312位和411-432位。該蛋白是一種非信號肽蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測該蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中。SgSTPS3中不存在信號肽切割位點(diǎn)，為非分泌蛋白；SgSTPS3二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，α螺旋結(jié)構(gòu)占比最多，為68.90%，無規(guī)則卷曲占比24.73%，延伸鏈占比3.89%，β卷曲占比2.47%。對油楠SgSTPS3編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，SgSTPS3蛋白為倍半萜烯合酶，序列一致性為40.15%。

圖1 SgSTPS3 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of SgSTPS3 PCR products

將SgSTPS3與其他物種同源蛋白進(jìn)行序列比對(圖2)，發(fā)現(xiàn)其與古巴香膠樹(Copaiferaofficenalis)CoTPS3和蘭氏香脂樹(Copaiferalangsdorffii)ClTPS3蛋白的同源性最高，均為87.68%，而與其他物種的同源性較低，其中與紅花車軸草(Trifoliumpretense)TpGDS-like蛋白的同源性為58.35%，與雞血藤(Spatholobussuberectus)SsTPS2的同源性為56.62%，與野大豆(Glycinesoja)GsTPS2和大豆(Glycinemax)GmTPS2的同源性均為56.83%。SgSTPS3蛋白與其他的TPS蛋白均含有萜類合成酶保守結(jié)構(gòu)域:DDXXD和RRX8W，及結(jié)構(gòu)域NSE/DTE和RXR，初步認(rèn)為該蛋白為萜類合成酶，屬于類異戊二烯生物合成ClassⅠ超家族。將SgSTPS3蛋白序列與其他物種TPS序列進(jìn)行進(jìn)化分析(圖3)：油楠SgSTPS3與古巴橡膠樹CoTPS3、蘭氏香脂樹ClTPS3親緣關(guān)系最近；與其他萜類合成酶相關(guān)蛋白的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。

圖2 油楠SgSTPS3氨基酸與其他物種氨基酸序列比對及結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Alignment and domain analysis of the amino acids blonging to Sindora glabra with other speciesClTPS3:蘭氏香脂樹Copaifera langsdorffii(AGW18160.1);CoTPS3:古巴香膠樹Copaifera officenalis (AGW18156.1);GmTPS2:大豆Glycine max(XP_025980989.1);TpGDS:紅花車軸草Trifolium pretense (PNY15989.1);SsTPS2:雞血藤Spatholobus suberectus (TKY49012.1);GsTPS2:野生大豆Glycine soja(XP_028189414.1).

圖3 不同植物TPS同源蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of TPS homologous protein sequences of different plantsJF449450.1 PtTPS1,JF449451.1 PtTPS2,JF449452.1 PtTPS3,JF449453.1 PtTPS4,KF776503.1 PtTPS5,KF776504.1 PtTPS6:毛果楊 Populus trichocarpa;JN408284.1 SlTPS3,JN408286.1 SlTPS5,KC331910.1 SlTPS1,KC331911.1 SlTPS2:番茄Solanum lycopersicum;KF218237.1 CoTPS1,KF218238.1 CoTPS2,KF218239.1 CoTPS3,KF218240.1 CoTPS4,KF218241.1 CoTPS5:古巴香膠樹 Copaifera officinalis;KF218242.1 ClTPS1,KF218243.1 ClTPS3,KF218244.1 ClTPS4-1,KF218245.1 ClTPS4-2:蘭氏香脂樹 Copaifera langsdorffii;NM001334832.1 AtTPS1,NM100521.3 AtTPS7,NM105697.4 AtTPS8,NM117886.3 AtTPS5:擬南芥 Arabidopsis thaliana.

2.2 SgSTPS3蛋白的功能分析

2.2.1 SgSTPS3蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá) 將成功構(gòu)建的原核表達(dá)載體SgSTPS3-pET30a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21中表達(dá)，結(jié)果顯示，在20 ℃條件下培養(yǎng)16 h時蛋白在上清液中表達(dá)量較高(圖4A)，該蛋白為可溶性蛋白。

2.2.2 重組蛋白純化與驗(yàn)證 SDS-PAGE分析如圖4B所示。當(dāng)使用50 mmol·L-1咪唑洗脫組分時，目的蛋白條帶清晰明亮，非特異性蛋白量較少，蛋白純度相對較高；使用20 mmol·L-1和500 mmol·L-1咪唑洗脫組分時，有少量非特異性蛋白與介質(zhì)結(jié)合。使用50 mmol·L-1洗脫緩沖液效果更佳。SDS-PAGE 電泳分析在理論分子量±5 kDa 相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶(圖4C)，可初步確定融合蛋白成功得到了純化。Western Blot驗(yàn)證結(jié)果顯示目的條帶大小與理論相一致(圖4D)，表明該蛋白為目的蛋白，測得蛋白濃度為0.33 mg·mL-1。

圖4 蛋白表達(dá)、純化與Western Blot分析Fig.4 Protein expression,purification and Western Blot analysis diagramA:融合蛋白表達(dá)SDS-PAGE分析圖(M:Protein marker;1:誘導(dǎo)前總蛋白;2:20 ℃上清;3:20 ℃沉淀;4:37 ℃上清;5:37 ℃沉淀);B:融合蛋白純化SDS-PAGE分析圖(1:上樣;2:流出;3:20 mmol·L-1 咪唑洗脫組分;4:50 mmol·L-1 咪唑洗脫組分;5:500 mmol·L-1 咪唑洗脫組分);C:SgSTPS3純化蛋白SDS-PAGE分析圖;D:SgSTPS3純化蛋白Western Blot分析圖。A:SDS-PAGE analysis diagram of fusion protein expression test(M:Protein marker;1:Total protein before induction;2:20 ℃ supernatant;3:20 ℃ precipitation;4:37 ℃ supernatant;5:37 ℃ precipitation);B:SDS-PAGE analysis diagram of fusion protein purification(1:Sample loading;2:Outflow;3:20 mmol·L-1 imidazole elution component;4:50 mmol·L-1 imidazole elution component;5:500 mmol·L-1 imidazole elution component);C:SDS-PAGE analysis diagram of SgSTPS3 purified protein;D:Western Blot analysis diagram of SgSTPS3 purified protein.

2.2.3 酶促反應(yīng)和GC-MS分析 對SgSTPS3進(jìn)行酶促反應(yīng)分析(圖5)顯示，SgSTPS3是一種多功能酶，在以FPP為底物時共產(chǎn)生11種倍半萜，包括：環(huán)苜蓿烯、可巴烯、β-欖香烯、β-依蘭烯、順式-β-可巴烯、異喇叭烯、γ-衣蘭油烯、大牛兒烯D、α-衣蘭油烯、廣藿香烯、γ-古蕓烯。其中環(huán)苜蓿烯、可巴烯及順式-β-可巴烯為主要產(chǎn)物，占比分別為27.94%、24.11%、27.03%。以GPP為底物時，酶促產(chǎn)物的GC-MS分析顯示主要形成單萜化合物芳樟醇，占比為12.90%。

圖5 SgSTPS3蛋白體外酶活性分析Fig.5 Analysis of enzyme activity of SgSTPS3 protein in vitro1,2,3,4,5,6,7分別為芳樟醇、環(huán)苜蓿烯、可巴烯、β-欖香烯、順式-β-可巴烯、γ-衣蘭油烯、α-衣蘭油烯。1,2,3,4,5,6 and 7 are linalool,cyclosativene,copaene,β-elemene,cis-β-copaene,γ-muurolene,α-muurolene,respectively.

2.3 SgSTPS3基因時空表達(dá)及激素響應(yīng)模式分析

2.3.1SgSTPS3基因時空表達(dá)特異性分析 由圖6可以看出，SgSTPS3基因表現(xiàn)出多樣化的表達(dá)模式，以各個年齡基因表達(dá)量最低的器官作為對照?；虮磉_(dá)量在0.5年生植株5個不同器官間差異顯著，根部表達(dá)量最高，木質(zhì)部表達(dá)量最低，根部為木質(zhì)部基因表達(dá)量的52.6倍。基因表達(dá)量在1.5年生植株韌皮部、嫩葉中與老葉間差異顯著。成年植株韌皮部表達(dá)量最高，其他4個器官間表達(dá)無顯著性差異；15年生植株木質(zhì)部表達(dá)量最低，韌皮部是木質(zhì)部的12.3倍，30年生植株老葉表達(dá)量最低，韌皮部是老葉的986倍。

圖6 油楠同齡植株不同組織中SgSTPS3基因表達(dá)量Fig.6 Gene expression of SgSTPS3 in different organs of S. glabra plant at the same age不同小寫字母表示統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.05)，下同。0.5年生植株基因相對表達(dá)量對照器官為木質(zhì)部，1.5年生為嫩葉，15年生為木質(zhì)部，30年生為老葉。Different lowercase lerrers indicate significant statistical differences (P<0.05),the same below.Relative gene expression control organs:0.5 years old for xylem,1.5 years old for tender leaves,15 years old for xylem,30 years old for old leaves.

為比較SgSTPS3在各器官在不同年齡中的相對表達(dá)量(圖7)，以0.5年生植株各器官為對照。根部、韌皮部、木質(zhì)部表達(dá)表現(xiàn)出清晰的規(guī)律，根部基因相對表達(dá)量隨株齡的增加顯著減小，木質(zhì)部中則隨株齡的增加而增大；0.5、15、30年生植株韌皮部基因表達(dá)量呈遞增趨勢，各株齡間差異顯著，且均高于1.5年生韌皮部，30年生為1.5年生基因表達(dá)量的303.5倍。此外，0.5年生和15年生嫩葉中基因表達(dá)量顯著高于1.5年生和30年生，3個較小年齡的老葉基因表達(dá)量顯著高于30年生老葉。

圖7 油楠植株不同株齡同一器官中SgSTPS3基因表達(dá)量Fig.7 Expression levels of SgSTPS3 in the same organs of S. glabra at different ages SgSTPS3基因在各器官中的相對表達(dá)量，以0.5年生相應(yīng)器官作為對照。The relative expression of SgSTPS3 in various organs was compared with the corresponding organs of 0.5 years old plant.

2.3.2SgSTPS3基因不同激素誘導(dǎo)下表達(dá)差異 分別檢測SgSTPS3基因在不同激素誘導(dǎo)下的響應(yīng)情況(圖8)，對照組基因表達(dá)量隨時間的推移無顯著變化。SA處理下，基因表達(dá)水平顯著上升，在處理12 h時SgSTPS3基因的表達(dá)量快速升高為0 h的35.1倍。MeJA誘導(dǎo)表達(dá)的效果呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制再促進(jìn)的趨勢，在6 h時升高為原來的7.3倍，在24 h時表達(dá)量下降為原來的0.1倍，隨后有小幅增加。SA+MeJA混合激素處理12 h時基因表達(dá)量升高至4.1倍。對照組與各激素處理24 h時，基因表達(dá)量均低于12 h，激素誘導(dǎo)可能對該基因具有先正調(diào)控后負(fù)調(diào)控的誘導(dǎo)機(jī)制，需通過進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖8 SgSTPS3基因在不同外源激素處理下在油楠葉片中的表達(dá)量Fig.8 Expression levels of SgSTPS3 in leaves of S. glabra with different exogenous hormone treatments以各處理下0 h時SgSTPS3的基因表達(dá)量作為對照。The SgSTPS3 gene expression level at 0 h under each treatment was used as a control.

3 討論

萜類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物的最大家族，本研究克隆了SgSTPS3并進(jìn)行表達(dá)量分析。生物信息學(xué)分析顯示該基因所編碼的蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，屬于ClassⅠ超家族。氨基酸序列具有萜類化合物保守結(jié)構(gòu)域DDXXD、RRX8W、RXR及NSE/DTE。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示與古巴香膠樹CoTPS3氨基酸序列相似性最高，為87.68%；根據(jù)已知CoTPS3編碼560個氨基酸，主要催化FPP產(chǎn)生倍半萜法尼醇和α-甜沒藥烯，為倍半萜合成酶(Joyce，2013)，推測SgSTPS3編碼蛋白為油楠的倍半萜類合成酶。

對SgSTPS3進(jìn)行酶促反應(yīng)顯示，以FPP為底物時，SgSTPS3與CoTPS3獲得產(chǎn)物不同，其催化產(chǎn)生了11種倍半萜，其中主要產(chǎn)物為環(huán)苜蓿烯、可巴烯及順式-β-可巴烯，也催化GPP產(chǎn)生單萜芳樟醇。目前已知的多數(shù)萜類合成酶都具有多底物催化功能(Chenetal.，2011)，如玉米(Zeamays)ZmTPS1，不僅可以催化產(chǎn)生倍半萜E-β-法尼烯和E,E-法尼醇，還可催化產(chǎn)生單萜橙花叔醇(Schneeetal.，2002)。金魚草(Antirrhinummajus)AmNES/LIS-1、AmNES/LIS-2蛋白都具有同時催化FPP和GPP的能力，可生成芳樟醇和橙花叔醇(Nagegowdaetal.，2008)。據(jù)報道，油楠倍半萜類合成酶SgSTPS1在以FPP為底物時，催化產(chǎn)生β-石竹烯以及少量的異丁子香烯和蛇麻烯，以GPP為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)時，產(chǎn)生少量的芳樟醇和香葉醇；SgSTPS2催化FPP產(chǎn)生12種倍半萜類化合物，主要產(chǎn)物為欖香烯、依蘭烯、β-蒎烯及大牛兒烯D，催化GPP產(chǎn)生3種單萜類：芳樟醇、香葉基甲基醚、香葉醇(Yuetal.，2018)。本文圖5顯示，SgSTPS3也是一種多功能酶，在以FPP為底物時共產(chǎn)生11種倍半萜，主要是環(huán)苜蓿烯、可巴烯及順式-β-可巴烯。環(huán)苜蓿烯具有抗氧化和抗癌的功能(Türkezetal.，2015)；可巴烯無毒性，能增加人體淋巴細(xì)胞的抗氧化性(Türkezetal.，2014)。不同油楠倍半萜類合成酶催化產(chǎn)物種類有較大差異，可能與其酶蛋白的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)(王凌健等，2013)。本研究唯一檢測到的單萜類為芳樟醇，研究表明天然芳樟醇具有抗菌消炎的作用，在醫(yī)療和食品領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛。因此，該研究為利用合成生物學(xué)方法生產(chǎn)藥用萜類化合物提供了重要的基因資源。

解析油楠中倍半萜的生物合成機(jī)制，重要的是探索這些物質(zhì)合成與積累的部位。Yu等(2018)的研究表明SgSTPS1、SgSTPS2基因在不同器官中表達(dá)水平不同，SgSTPS1在根中表達(dá)量最高，SgSTPS2在葉、韌皮部和根中均表達(dá)量高，且基因的表達(dá)模式與萜類化合物在油楠植株組織中的積累呈正相關(guān)。本研究對SgSTPS3進(jìn)行時空表達(dá)模式探索，發(fā)現(xiàn)該基因在0.5年生幼株根中表達(dá)最高，這與Yu等(2018)發(fā)現(xiàn)的2個基因在根中表達(dá)量豐富的結(jié)果比較一致；SgSTPS3基因在30年生植株的韌皮部表達(dá)量高，這可能與韌皮部主要負(fù)責(zé)同化物的裝載和運(yùn)輸且細(xì)胞代謝旺盛等特性有關(guān)；另外，SgSTPS3基因在木質(zhì)部的表達(dá)量隨株齡的增大而增加，這與野外油楠植株泌油特性比較吻合(吳忠鋒等，2014；Yuetal.，2020)，預(yù)示該基因的表達(dá)變化可能解釋油楠天然群體不同組織中一些萜類化合物含量的變化。根據(jù)對油楠成年植株樹干泌油特性的觀察，泌油僅發(fā)生在木質(zhì)部；而本研究發(fā)現(xiàn)15和30年生的成年植株SgSTPS3的表達(dá)量均是韌皮部高于木質(zhì)部，這與油楠樹干泌油規(guī)律(陸碧瑤等，1982；吳忠鋒等，2014)不一致；后期需要通過檢測不同年齡植株韌皮部和木質(zhì)部中萜類化合物含量，進(jìn)一步研究該基因的表達(dá)豐度，同時驗(yàn)證該基因是否具有指征油楠樹脂油中萜類化合物含量的潛在作用。

水楊酸和茉莉酸甲酯具有誘導(dǎo)植物次生代謝相關(guān)基因表達(dá)、促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物積累的作用，食草動物、病菌的侵襲及機(jī)械損傷有類似的誘導(dǎo)效果 (王煥，2015；Ozawaetal.，2000；Martinetal.，2003)。本研究中，激素對SgSTPS3基因表達(dá)有一定的調(diào)控作用，但調(diào)控效果不同，SA(50 μmol·L-1)的誘導(dǎo)水平強(qiáng)于MeJA(100 μmol·L-1)及SA(50 μmol·L-1)+MeJA(100 μmol·L-1)的混合液。前人對SA和MeJA誘導(dǎo)萜類合成相關(guān)基因在不同植物中的表達(dá)進(jìn)行了大量的研究。Shabani等(2010)用5種不同濃度的MeJA和SA處理洋甘草(Glycyrrhizaglabra)，檢測三萜角鯊烯合成酶(squalene synthase，SQS)和β-香樹脂醇(β-amyrin synthase，bAS)基因表達(dá)量的變化，不同濃度激素對萜類合成酶的基因表達(dá)誘導(dǎo)間存在差異：SQS基因在MeJA所有5個濃度誘導(dǎo)下均上調(diào)，但SA的誘導(dǎo)僅在濃度為0.1、1.0 mmol·L-1時為正調(diào)控；bAS基因在MeJA濃度為0.1、1.0 及2.0 mmol·L-1的誘導(dǎo)下表達(dá)量增加，僅在SA濃度為0.1、1 mmol·L-1處理時增加。Majdi等(2015)外施SA(1 mmol·L-1)和MeJA(100 μmol·L-1)于1月齡小白菊(Tanacetumparthenium)植株上，倍半萜類化合物小白菊內(nèi)酯含量表現(xiàn)出不同程度的增加。Chen等(2009)研究了古巴香膠樹幼苗體內(nèi)倍半萜的分布和揮發(fā)，發(fā)現(xiàn)未受傷的幼苗分泌極少量的倍半萜，而受到機(jī)械損傷的幼苗可以分泌大量的倍半萜。以上研究均表明，不同激素、不同激素濃度及機(jī)械損傷對基因表達(dá)、化合物的累積有一定的誘導(dǎo)作用。在今后的研究中，可通過對成年油楠植株噴施MeJA、水楊酸等激素或機(jī)械損傷的方式，檢測不同株齡油楠植株的不同組織器官在逆境和激素誘導(dǎo)下樹脂油的分泌狀況及基因表達(dá)特性，探究激素處理或受傷是否誘導(dǎo)植株中特定相關(guān)萜類合成酶基因的表達(dá)從而提高其產(chǎn)物得率，為調(diào)控油楠樹脂油萜類化合物的含量與組成提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆得到SgSTPS3基因并分析其表達(dá)模式。該基因?yàn)槎喙δ茌祁惡铣擅?，催化FPP主要產(chǎn)生倍半萜環(huán)苜蓿烯、可巴烯及順式-β-可巴烯，催化GPP主要產(chǎn)生單萜芳樟醇。SgSTPS3在0.5年生幼株根部表達(dá)量較高，在30年生植株韌皮部表達(dá)量較高，在木質(zhì)部的表達(dá)量隨株齡增大而增加。同時50 μmol·L-1SA可誘導(dǎo)其表達(dá)，MeJA(100 μmol·L-1)誘導(dǎo)效果次之。本研究為闡明林木萜類化合物的合成和調(diào)控提供一定的參考。