龔金玉 彭金根 謝利娟 張銀鳳 李朝嬋 王艷梅

(1.河南農(nóng)業(yè)大學林學院 鄭州 450002；2.深圳職業(yè)技術(shù)學院應用化學與生物技術(shù)學院 深圳 518055；3.貴州師范大學貴州省山地環(huán)境重點實驗室 貴陽 550001)

毛棉杜鵑(Rhododendronmoulmainense)為杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑花屬(Rhododendron)常綠灌木或小喬木，花期每年3—4月，花朵簇生，淡紫色或淺粉色，新梢無毛且多呈淺綠色，老梢多呈褐色或深褐色，常生長在海拔700～1 500 m的山林中，喜涼爽濕潤氣候，是較為稀缺的高山杜鵑品種，具有極高的觀賞和應用價值(景慧娟等，2018；康美麗等，2009；吳志等，2009)。毛棉杜鵑屬淺根系植物，根系多為須根，種子自然萌發(fā)困難，人工育苗存在移栽成活率較低、生長較差等問題。當前，毛棉杜鵑研究主要集中在花芽分化(謝利娟等，2009；2010)、抗熱性(王凱紅等，2011)、繁殖(熊友華等，2011)、菌根共生(洪文君等，2016)和光合特性(白宇清等，2017)等方面，關于毛棉杜鵑根際微生態(tài)的探索以及根際微生物多樣性的研究尚未見報道。

根際指受植物根系影響的微型區(qū)域(Hiltner，1904)，根際微生物指在該微型區(qū)域內(nèi)受植物根系影響的微生物，如細菌、真菌、放線菌等，對植物生長發(fā)育、土壤健康等具有重要作用。根際微生態(tài)系統(tǒng)包括土壤、植物根系和土壤微生物三大部分，是連接大氣、水體、土體、生物體碳流通的中間環(huán)節(jié)，是生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的關鍵部分，其穩(wěn)定性對植物健康生長十分重要(李繼光等，2019)。土壤微生物按其對植物的影響不同，可分為促進植物生長的有益微生物和抑制植物生長的致病菌等(Mendesetal.,2013)，且土壤微生物也是反映土壤養(yǎng)分狀況的重要指標(肖燁等，2015)。康捷等(2019)對麻山藥(Dioscoreaopposita)不同生長時期根際土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)特征研究表明，根際土壤優(yōu)勢微生物在植物不同生長時期變化顯著，推測與植物生長發(fā)育有關。楊瀟湘等(2019)基于高通量測序分析大豆(Glycinemax)和油菜(Brassicanapus)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異發(fā)現(xiàn)，根際土壤富含有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等可促進植物生長的生防菌。尤垂淮等(2015)對云南烤煙(Nicotianatabacum)根際微生態(tài)研究得出，烤煙連作會使根際病原微生物富集，引發(fā)根際微生態(tài)平衡失調(diào)，導致烤煙長勢變?nèi)?。于文喜?1998)研究落葉松枯梢病(Botryosphearialaricina)發(fā)病原理發(fā)現(xiàn)，病原菌侵染會使落葉松樹勢衰退，嚴重者甚至導致樹體死亡。桑娟萍等(2013)對小隴山林區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該林區(qū)林木病原菌種類豐富，可侵染寄主，引起葉部病害。

毛棉杜鵑是深圳梧桐山風景區(qū)的主要建群種，每年的“毛棉杜鵑花節(jié)”都會吸引大量市民上山賞花，毛棉杜鵑資源對梧桐山具有重要意義，已成為其閃亮的生態(tài)名片。梧桐山毛棉杜鵑現(xiàn)存在生長勢差、樹勢衰退現(xiàn)象，這是否與其根土壤際微生物有關？根際土壤微生物在毛棉杜鵑樹勢衰退過程中是否發(fā)生變化？鑒于此，本研究從毛棉杜鵑根際土壤入手，分析不同樹勢毛棉杜鵑根際土壤理化性質(zhì)和微生物多樣性，探明毛棉杜鵑樹勢退化與根際土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)間的關系，以期為保障梧桐山毛棉杜鵑種群更新和演替提供理論支撐。

1 研究區(qū)概況與研究方法

1.1 研究區(qū)概況 梧桐山風景區(qū)位于深圳市東部，屬亞熱帶濕潤氣候，年均降水量1 926.8 mm，平均氣溫22.4 ℃，全年溫和濕潤。土壤多為赤紅壤、山地黃壤等，含石英砂且呈弱酸性。區(qū)內(nèi)植被豐富，保護較好，主要建群種為毛棉杜鵑、浙江潤楠(Machiluschekiangensis)、亮葉冬青(Ilexnitidissima)等，景觀以闊葉景觀為主、針闊混交景觀為輔。

1.2 土壤樣品采集 采用抖落法采集不同樹勢(優(yōu)、中、劣)毛棉杜鵑根際土壤(Rileyetal.，1969)，分別記作AR、MR和DR(表1)。每種樹勢分別選取3塊標準地，每塊標準地內(nèi)毛棉杜鵑樣樹不少于5株，樹齡相近且營養(yǎng)管理水平一致。在每塊樣地內(nèi)利用五點取樣法挖取0～20 cm毛棉杜鵑細根(直徑D≤2 mm)，用無菌刷收集根際周圍2 mm范圍內(nèi)的土壤作為根際土壤，每塊樣地采集的根際土壤混為一個樣品，裝于無菌采樣袋內(nèi)用車載冰箱帶回實驗室，挑出其中的枯枝落葉并過2 mm篩(已提前殺菌)。將土壤樣品分為2份：一份用于測定土壤理化性質(zhì),一份用于高通量測序。

表1 不同樹勢樣地的植物生長統(tǒng)計①Tab.1 Statistics of plant growth in different tree potential plots

1.3 土壤理化性質(zhì)測定 土壤理化性質(zhì)測定參考魯如坤(2000)方法：采用酸度計法測定土壤pH；采用重鉻酸鉀容量法測定土壤有機質(zhì)含量；采用半微量凱氏定氮法測定土壤全氮含量；采用堿解擴散法測定土壤堿解氮含量；采用烘干法測定土壤含水量。

1.4 土壤DNA提取 土壤DNA提取采用NucleoSpin Soil kit (Macherey-Nagel)DNA土壤提取試劑盒，按說明書操作。PCR擴增用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和 ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴增真菌ITS1區(qū)；用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增細菌v3+v4區(qū)。細菌PCR反應條件為：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，50 ℃、30 s，72 ℃、60 s，共30循環(huán)，72 ℃反應5 min后將擴增產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳進行純化、回收。真菌PCR反應條件為：95 ℃、5 min，95 ℃、1 min，50 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共35循環(huán)，72 ℃反應7 min后將擴增產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳進行純化、回收。產(chǎn)物送至北京百邁客生物科技有限公司進行后續(xù)樣品建庫，并利用Illumina HiSeq平臺進行高通量測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析 高通量測序后得到的原始數(shù)據(jù)采用FLASHv1.2.11、Trimmomatic、UCHIME等工具進行拼接、過濾、去除嵌合體，基于97%的相似性對數(shù)據(jù)進行聚類，以測序得到所有序列數(shù)的0.005%為閾值過濾劃分OTU，再基于Silva(細菌16S)、Unite(真菌ITS)分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學統(tǒng)計。使用QIIME2軟件評估樣品的α多樣性，對樣本序列隨機取樣，構(gòu)建稀釋性曲線并統(tǒng)計多樣性指數(shù)等，比較不同樹勢樣本的真菌和細菌豐度和多樣性；使用QIIME軟件分析樣品的β多樣性；線性判別分析流程(LEfSe)在http:∥huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy網(wǎng)址中獲取。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析 根際土壤理化性質(zhì)分析結(jié)果(表2)表明，3種樹勢之間土壤理化性質(zhì)雖然有所不同，但無顯著差異(P>0.05)。

表2 不同樹勢土壤理化性質(zhì)分析Tab.2 Analysis of soil physicochemical properties of different potential trees

2.2 不同樹勢土壤樣品微生物測序序列處理及優(yōu)化分析 分析所有土壤樣品測序數(shù)據(jù)，其中真菌原始數(shù)據(jù)共718 760條，經(jīng)質(zhì)控、拼接后得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)712 423條，過濾后得到有效序列710 302條；細菌原始數(shù)據(jù)共719 088條，高質(zhì)量數(shù)據(jù)714 155條，有效序列681 807條(表3)。所有樣本的稀釋性曲線走向趨于平緩，樣本OTU特征數(shù)不會再隨測序條數(shù)增加急劇增加，表明測序深度已足夠反映樣品的物種多樣性(圖1)。

圖1 根際土壤細菌(a)、真菌(b)稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curve of the rhizosphere soil bacteria(a)and fungi(b)

表3 根際土壤樣品真菌和細菌測序結(jié)果統(tǒng)計Tab.3 Sequencing results of fungi and bacteria in the rhizosphere soil samples

2.3 α多樣性分析 α多樣性反映單個樣品的物種豐度和物種多樣性，主要包括Chao1、Ace、Shannon、Simpson、Coverage等指數(shù)。由表4可知，不同樹勢之間根際土壤真菌豐度MR最大，且與AR、DR差異顯著；細菌Ace、Chao1等指數(shù)呈DR>MR>AR的規(guī)律，且DR與AR的差異達到顯著水平(P<0.05)。所有樣本的Coverage指數(shù)均為1.00，說明樣本測序深度已達檢測要求，測序結(jié)果能夠代表樣本中微生物真實情況。

表4 根際土壤真菌和細菌α多樣性分析Tab.4 α diversity analysis of fungi and bacteria in the rhizosphere soil

2.4 微生物分類學水平分析 采用樸素貝葉斯分類器結(jié)合比對方法對特征序列進行分類學注釋，結(jié)果見表5。所有樣本共注釋真菌10門489種，細菌27門438種，不同樹勢樣本的真菌和細菌多樣性均極其豐富。

表5 根際微生物物種分類學統(tǒng)計Tab.5 Taxonomic statistics of rhizosphere microorganisms

圖2所示為根際細菌和真菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)特征(物種豐度前十且占比大于0.1%的門)。由圖2a可知，細菌豐度前十的物種分別為酸桿菌門(Acideobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微桿菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、WPS-2、厚壁菌門(Firmicutes),其中酸桿菌門、變形菌門、放線菌門三者豐度之和占比75%以上。由圖2b可知，真菌豐度前十的物種分別為擔子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、梳霉門(Kickxellomycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、毛霉門(Mucoromycota)，其中擔子菌門、子囊菌門、被孢霉門三者的豐度之和占比90%以上。

從圖3可看出，3種樹勢樣本中共有細菌OTU序列1 661個，占OTU總數(shù)的82.7%，共有真菌OTU序列387個，占OTU總數(shù)的34.3%，這說明根際細菌群落多樣性在3種樹勢之間具有高度相似性，而根際真菌OTU差異較大。

在目水平上(表6)，細菌豐度前十的物種分別為Solibacterales、酸桿菌目(Acidobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、Subgroup_2、uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、Betaproteobacteriales、Gammaproteobacteria_Incertae_Sedis、Elsterales、黏球菌目(Myxococcales)、SBR1031，其中Solibacterales、酸桿菌目、根瘤菌目、Subgroup_2和Gammaproteobacteria_Incertae_Sedis的豐度隨樹勢衰退不斷降低，而黏球菌目、SBR1031的豐度隨樹勢衰退逐漸增大；真菌豐度前十的物種分別為蠟殼耳目(Sebacinales)、散囊菌目(Eurotiales)、蘑菇目(Agaricales)、肉座菌目(Hypocreales)、被孢霉菌目(Mortierellales)、糞殼菌目(Sordariales)、盤菌目(Pezizales)、柔膜菌目(Helotiales)、糙孢孔目(Trechisporales)、古根菌目(Archaeorhizomycetales)，3種樹勢之間的優(yōu)勢真菌目差異不大，但優(yōu)勢樹與劣勢樹之間差異較大，尤其是盤菌目與柔膜菌目，其中柔膜菌目可侵染杜鵑根系形成菌根。

表6 土壤樣本細菌和真菌在目水平上各菌群相對豐度百分比①Tab.6 Percentage of relative abundance of bacteria and fungi(order)in soil samples at order level

2.5 β多樣性分析 由圖4可知，細菌β多樣性MR與DR、AR相交，說明MR與DR、AR存在相似性，而AR與DR之間微生物群落差異大；同理，MR在真菌β多樣性上與DR具有相似性，DR與AR之間真菌群落差異大。由圖5可知，細菌β多樣性AR、DR組間差異較小，土壤樣品聚為一類，但MR組內(nèi)差異較大，可能是因為中庸樹的根際微生物已發(fā)生改變，但其樹勢尚未有明顯變化；在真菌β多樣性上AR與MR之間差異較小，與DR存在組間差異。由此可知，不同樹勢毛棉杜鵑根際土壤微生物多樣性存在一定差異，且AR與DR在細菌和真菌上差異程度不同，AR與DR的真菌差異更大。與主坐標分析結(jié)果相同，樹勢相差越大，微生物差異也越大，其中真菌差異更大。

圖4 土壤樣品細菌(a)、真菌(b)主坐標分析Fig.4 Principle coordinate analysis of soil sample bacteria(a)and fungi (b)

圖5 細菌(a)、真菌(b)群落結(jié)構(gòu)UPGMA聚類樹Tig.5 UPGMA cluster tree of bacteria(a)and fungi(b)community structure

2.6 真菌組間差異顯著性分析 LEfSe進化分支圖可發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學差異的Biomarker，當選擇LDA score大于3.5時，代表Biomarker顯著差異。如圖6所示，紅色和綠色分別代表AR和DR，柱形寬度代表其LDA score，即不同組間物種差異影響程度，可以發(fā)現(xiàn)，主要差異真菌為Archaeorhizormyces屬、Phaeosphaeriaceae科、Helotiales(柔膜菌目)、Arthrobotrys屬、Pseudaleuria、Pyronemataceae科等。目前，Archaeorhizormyces屬的功能尚不可知，但已有研究表明其具有根系生長特異性(周攀，2015)。Phookamsak等(2014)研究發(fā)現(xiàn)，Phaeosphaeriaceae科是Pleosporales目中的一大科，同時也是經(jīng)濟作物上重要的植物病原體。馮歡(2017)研究發(fā)現(xiàn)，Leucoagaricus(白環(huán)蘑屬)對青楊(Populuscathayana)抗性具有一定促進作用。

圖6 根際真菌LEfSe分析的進化分支圖和LDA得分(LDA>3.5)Fig.6 Least discriminant analysis(LDA)effect size taxonomic and LDA score of the discriminants comparing rhizosphere fungi

3 討論

根際環(huán)境對植物生長具有重要作用，植物生長過程中也會不斷調(diào)節(jié)根際環(huán)境，改變根際微生態(tài)(王新洲等，2010；國輝等，2011；李繼光等，2019)。在根際微生物中，既包括通過養(yǎng)分競爭、拮抗作用和誘導系統(tǒng)抗性等機制抑制土壤病原菌，進而促進植物生長的根際“益生菌”，也包括抑制植物生長甚至導致植株死亡的根際“有害菌”，其中根際“益生菌”對植物生長發(fā)育和生理代謝至關重要(周文杰等，2016)。周文杰等(2015)研究根際優(yōu)勢細菌甜櫻桃(Cerasusspp.)幼樹光合及根系活力的影響，結(jié)果表明幼樹接種根際優(yōu)勢促生細菌提高了植株凈光合速率、水分利用率和根系活力。全妙華等(2018)探究最適宜栽培忽地笑(Lycorisaurea)的土壤時發(fā)現(xiàn),一些未分類的優(yōu)勢真菌與忽地笑鱗莖內(nèi)石蒜堿含量呈極顯著正相關。由于根際微生物的特殊功能，對其的研究越來越多，如彭政等(2020)研究指出，藥用植物和根際微生物的多樣性和豐度具有密不可分的關系。除此之外，植物土傳病病害發(fā)生與根際微生物也有著密切關系，多年生植物在長期生長過程中會通過分泌作用調(diào)節(jié)植物根系微生態(tài)的平衡(Zhangetal.,2013)，微生態(tài)的破壞會產(chǎn)生負面效應，導致植物根系發(fā)育不良、植株矮小、生長緩慢、抗性下降甚至植株死亡，嚴重的還會引起連作障礙(韋菊玲等，2019)。影響植物根際微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的原因很多，不同種植年限(納小凡等，2016)、生育時期(常穎萃等，2013)、海拔(徐佳欣等，2018)等的植物根際微生物均存在差異。劉宇等(2018)對海南鳳仙花(Impatienshainanensis)可培養(yǎng)根際微生物研究發(fā)現(xiàn)，根際微生物多樣性以及優(yōu)勢微生物種類隨海拔、季節(jié)變化均有差異。劉艷霞等(2016)對煙草根系分泌物研究得出，根系分泌物中的苯丙酸可促進病原菌生長、抑制拮抗菌生長。

利用高通量測序技術(shù)分析梧桐山不同樹勢毛棉杜鵑根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，注釋到根際真菌10門489種，其中優(yōu)勢真菌門為擔子菌門(49.3%～59.3%)、子囊菌門(32.0%～40.8%)和被孢菌門(1.7%～4.6%)等，與廖映輝等(2016)對海南霸王嶺毛棉杜鵑根際真菌檢測出的優(yōu)勢真菌相同；根際優(yōu)勢細菌門主要為酸桿菌門(36.3%～47.2%)、變形菌門(31.2%～32.0%)和綠彎菌門(3.0%～7.7%)，與方敏等(2019)對馬纓杜鵑(Rhododendrondelavayi)根際微生物檢測的優(yōu)勢細菌相同。從根際微生物α、β多樣性分析可看出，不同樹勢根際土壤微生物之間細菌差異性較小，但真菌差異性較大，尤其是AR與DR之間差異最大，其中主要差異真菌為Archaeorhizormyces屬、Phaeosphaeriaceae科、Helotiales(柔膜菌目)等，而子囊菌綱柔膜菌目已在澳州杜鵑 (Rhododendronlochiae)中證明為優(yōu)勢種群，且為菌根真菌類群(Bougoureetal.,2005)。3種樹勢毛棉杜鵑根際微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異，但目前僅為原位試驗，尚未進行控制試驗，差異微生物的功能和作用有待后續(xù)進一步研究。

在自然界中，杜鵑花科植物易受真菌侵染形成杜鵑花類菌根(Read，1996)，菌根形成會擴大根系與土壤的接觸面積，增加吸收土壤水分養(yǎng)分的能力。對此，有學者認為外生菌根形成利于杜鵑屬植物對不利環(huán)境的適應性，增加植物的脅迫抗性。歐靜等(2013)研究桃葉杜鵑(Rhododendronannae)外生菌根時發(fā)現(xiàn)，外生菌根形成不僅可促進其地上與地下生物量積累，而且還會促進某些激素分泌。因此，對毛棉杜鵑根際土壤的研究，利于探究毛棉杜鵑根際微生物群落結(jié)構(gòu)，探明影響其微生態(tài)平衡的關鍵因素，能夠為保障梧桐山毛棉杜鵑種群更新和演替提供一定理論支撐。

4 結(jié)論

不同樹勢毛棉杜鵑根際土壤理化性質(zhì)無顯著差異，土壤理化性質(zhì)不是樹勢衰退的主要影響因素，而不同樹勢之間根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著，且樹勢差異越大其真菌群落結(jié)構(gòu)差異越大，主要差異真菌為Archaeorhizormyces屬、Phaeosphaeriaceae科、Helotiales(柔膜菌目)等。