朱麗媛，彭朝蕊，周木艷，趙 興，陳光明

(云南新興職業(yè)學院 藥學院，云南 昆明 651500)

紫丹參系唇形科鼠尾草屬植物云南鼠尾草(Salvia yunnanensis C.H.Wright)的干燥根及根莖[1]，又名云南鼠尾草、小丹參、滇丹參等[2]，彝族語音譯名為呆乃色[1]。它與著名中藥丹參同屬于唇形科鼠尾草屬植物，且具有與丹參相似的藥理活性[3]，往往作為丹參的替代品使用[4]。但紫丹參與丹參還是存在明顯區(qū)別，從分布區(qū)域到化學成分中的主要成分含量、藥理作用程度等都有所不同，固不可將二者混為一談[5-9]。

紫丹參主要分布于云南、四川、貴州等省，主要來自于野外，一直作為云南地方習用藥材，用藥歷史悠久[10]。民間主要將紫丹參用于治療婦科和骨傷科疾病，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀生新、鎮(zhèn)靜止痛、除煩安神、活血通經(jīng)等功效[1-2，11-14]。云南鼠尾草藥材曾在云南大理州年產(chǎn)達 10000 kg 以上，行銷華北、華中、中南和華南等各省區(qū)[15]，在大理民間常與馬廠當歸配伍使用[16]。紫丹參療效廣泛，含有丹參酮類、酚酸類等成分，近年來因?qū)ζ淇寡“寰奂⒎乐喂谛牟〉痊F(xiàn)代藥理作用的深入研究而日益受到重視[17-18]。以紫丹參為處方主藥被國家標準收載的中藥制劑多達10個，其中丹莪婦康煎膏、紫燈膠囊、紫丹活血片等均療效顯著[19-20]。目前，已有學者對紫丹參資源、化學成分、藥理作用、提取工藝等方面進行了研究[17-21]，但對紫丹參的提取工藝只停留在對其水溶性或脂溶性各成分單獨研究[22-25]，暫未見其脂溶性及水溶性總成分的提取工藝。本研究以丹酚酸 B 和丹參酮 IIA 總含量為指標，通過對紫丹參的提取次數(shù)、時間、料液比以及溶劑(乙醇)濃度進行單因素考察，采取回流提取法，采用正交試驗設計法優(yōu)選紫丹參提取工藝，為充分利用該藥提供重要的依據(jù)與參考。

1 儀器與材料

1.1 藥材來源

紫丹參藥材購自云南省宣威市羊場鎮(zhèn)，經(jīng)云南新興職業(yè)學院藥學院楊艷娟副教授鑒定為唇形科鼠尾草屬植物云南鼠尾草(Salvia yunnanensis C.H.Wright)的干燥根及根莖。

1.2 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國Agilent)；BT25S分析天平(賽多利斯儀器有限公司)；CP124C-OHAUS電子天平(奧豪斯儀器常州有限公司)；JP-1500B高速多功能粉碎機(永康市久品工貿(mào)有限公司)；SK3300超聲機(上?？茖С晝x器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯制儀器有限公司)；EYELA N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)。

1.3 試劑

丹酚酸B對照品(批號: 20120901，森嵐科技有限公司，含量：91.04%)；丹參酮IIA對照品(批號: 19032005，森嵐科技有限公司，含量：94.55%)。 無水乙醇(分析純，天津市致遠化學試劑有限公司)；乙腈(色譜純，德國MERCK)；甲醇(分析純，利安隆博華醫(yī)藥化學有限公司)；磷酸(分析純，廣東光華科技股份有限公司)；純凈水(濟南哇哈哈恒楓飲料有限公司)。

2 方法與結果[26]

2.1 建立紫丹參丹酚酸 B 和丹參酮IIA測定方法

2.1.1 色譜條件

Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱：中譜科技RD-C18(5 μm, 4.6×250 mm)。流動相：乙腈(A)— 0.1% 磷酸溶液(B)，梯度洗脫，0～5 min，30%～35% A; 5～10 min，35% A; 10～20 min，35%～75% A; 20～25 min，75%～80% A;25～30 min，80%～85% A;30～35 min，85%～5% A;35～40 min,5% A。流速：1 mL/min。檢測波長：丹酚酸 B 286 nm，丹參酮IIA 270 nm。柱溫：30 ℃。進樣量：1 μL。對照品和待測樣品的色譜圖見圖1。

圖1 混標(A)和紫丹參樣品(B)的HPLC色譜圖

2.1.2 標準曲線繪制

精密稱取丹酚酸B和丹參酮IIA對照品若干，溶于甲醇制成混合對照品母液，將母液逐級稀釋成各成分質(zhì)量濃度0.31～10.03 mg/mL、0.06～2.07 mg/mL 的混合對照品溶液，按上述色譜條件測定峰面積，以縱坐標為峰面積，橫坐標為對照品的質(zhì)量濃度(mg/mL)制作標準曲線，擬合回歸方程，結果見表1。

表1 丹酚酸 B 和丹參酮IIA的線性回歸方程與相關系數(shù)及線性范圍

2.1.3 供試品溶液制備

精密稱定紫丹參粉末 5 g，按正交試驗安排表進行試驗，合并濾液濃縮至 25 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，混勻，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.4 方法學考察

精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液 1 μL，連續(xù)進樣 6 次，記錄色譜圖。丹酚酸B 和丹參酮IIA的RSD分別為0.17 % 和 0.33 %，表明儀器精密度好。

重復性試驗 精密稱定紫丹參粉末 5 g，按照供試品溶液制備方法制備，并連續(xù)進樣 6 次，記錄色譜圖。丹酚酸B和丹參酮IIA的RSD分別為0.68 %和1.55 %，表明重復性良好。

穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別在 0、2、4、6、8、12 h 進行測定，記錄色譜圖。丹酚酸B和丹參酮IIA的RSD分別為0.44 %和1.72 %，表明供試品溶液在 12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗 取已知含量的6個供試品溶液，加入一定量的丹酚酸B、丹參酮ⅡA對照品，按制備方法制備，測定制備含量，計算平均回收率。丹酚酸B和丹參酮IIA的平均加樣回收率分別為101.47%和98.71%，RSD分別為2.40%和2.06%。

2.2 紫丹參提取工藝研究

2.2.1 單因素考察

以乙醇作為提取溶媒，對料液比、乙醇分數(shù)、提取時間進行單因素考察。

1)料液比考察。準確稱取紫丹參粉末5份，每份 5 g，分別以料液比1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10(g/mL)加入 70% 乙醇，于 80 ℃ 水浴回流提取 1 h，過濾，濾液濃縮至 25 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，混勻，測定丹酚酸B、丹參酮ⅡA的質(zhì)量分數(shù)，結果見表2。

表2 料液比考察結果

2)乙醇考察。準確稱取紫丹參粉末5份，每份 5 g，分別加入8倍量(40 mL)的50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇，于 80 ℃ 水浴回流提取 1 h，過濾，濾液濃縮至 25 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，混勻，測定丹酚酸B、丹參酮ⅡA含量，結果見表3。

表3 乙醇濃度考察結果

3)提取時間考察。準確稱取紫丹參粉末5份，每份 5 g，分別加入8倍量(40 mL)的70%乙醇 80 ℃ 水浴加熱回流提取 30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，過濾，濾液濃縮至 25 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，混勻，測定丹酚酸B、丹參酮ⅡA含量，結果見表4。

表4 提取時間考察結果

2.2.2 正交試驗方案及結果分析

在單因素試驗考察的基礎上，根據(jù)正交試驗設計原理，以丹酚酸B、丹參酮ⅡA質(zhì)量分數(shù)為評價指標，選擇料液比(g/mL) (A)、乙醇體積分數(shù)(B)、提取時間(C)進行考察，采用L9(34)正交試驗設計優(yōu)選紫丹參水溶性及脂溶性成分提取工藝，因素水平見表5。丹酚酸B及丹參酮ⅡA質(zhì)量分數(shù)各占50%進行綜合評分，結果見表6，方差分析結果見表7。

表5 正交試驗因素水平表

表6 正交試驗設計及直觀分析表

表7 正交試驗方差分析表

直觀分析可知，影響丹酚酸B、丹參酮ⅡA兩種成分質(zhì)量分數(shù)總和的因素大小順序為：提取時間>乙醇體積分數(shù)>料液比，且提取時間、乙醇體積分數(shù)在提取過程中起重要作用(P<0.05)，確定最佳提取參數(shù)為A2B2C3，即加入 8倍量的75%乙醇在 80 ℃ 水浴加熱回流提取 120 min。

2.3 驗證試驗

根據(jù)正交試驗結果篩選的工藝條件進行3組驗證試驗，結果見表8。以優(yōu)化工藝作為標準進行紫丹參提取，其提取液中丹酚酸B和丹參酮IIA的含量都較高，達到 31.73 mg/g。試驗表明，所優(yōu)化的提取工藝合理可行，且結果穩(wěn)定可靠。

表8 驗證試驗結果

3 討論

本研究選擇丹酚酸 B 和丹參酮 IIA 作為評價指標，因其為紫丹參的主要有效成分，在治療心血管疾病中有很好的治療作用，含量較其他成分高，也是水溶性成分和脂溶性成分的代表性成分，可以更全面地反映出紫丹參的提取效果。丹酚酸 B 成分遇熱不穩(wěn)定，為盡量減少由于干燥時丹酚酸 B 成分的損耗導致含量測定中的其提取的量降低[22]，故將樣品濃縮后進行定容。

本研究中，首先采用單因素試驗考察了紫丹參中丹酚酸 B 和丹參酮 IIA的提取次數(shù)、料液比、乙醇濃度、提取時間，在此基礎上，采用 L9(34)正交試驗設計優(yōu)選紫丹參的提取工藝。結果顯示，紫丹參中丹酚酸 B 和丹參酮 IIA提取效率的主要影響因素為乙醇，其次是提取次數(shù)，得到最佳提取工藝為：8倍量(40 mL)的75%乙醇在 80 ℃ 水浴加熱回流提取 120 min。重復驗證最佳工藝實驗提取的丹酚酸 B 和丹參酮 IIA的總含量為 31.73 mg/g。表明該方法提取效率較高，重現(xiàn)性好，同時操作簡便，可為紫丹參的進一步開發(fā)利用提供可靠依據(jù)。