劉 琳,王硯明?,趙惠民,賈東輝,劉 昱

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071001;2.保定市第一醫(yī)院胸外科,河北 保定 071066;3.保定市第二醫(yī)院胸外科,河北 保定 071051)

失血性休克是一種外科常見的急危重癥,是由于急性失血量超過機(jī)體總循環(huán)血量的20%(五分之一)而引起血液灌流減少,導(dǎo)致細(xì)胞功能所需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)輸送不足,它是創(chuàng)傷病例中最常見的死亡原因,也是全球總壽命損失的主要原因[1-3]。在過去的幾十年中,人們已經(jīng)做了大量的努力來闡明與嚴(yán)重出血相關(guān)的病理生理機(jī)制,已經(jīng)建立了各種各樣的實(shí)驗(yàn)條件,使研究人員能夠研究低血容量性休克的影響,并評估各種治療方案的潛在益處[4-8]。 然而,將這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的治療仍是一個(gè)挑戰(zhàn),部分原因可能是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)中使用的動物模型[9-16]。 目前失血性休克的研究主要采用三種基本模型:定容出血模型、定壓出血模型和非控制性出血模型[17-20]。 這些模型至少有兩個(gè)缺點(diǎn)。 首先,廣泛的血壓波動導(dǎo)致了人們對實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和重復(fù)性的考量;第二,短期嚴(yán)重低血壓很難引起組織損傷。 為了引起可靠的組織損傷,平均動脈壓(MAP)必須維持在一個(gè)較低的水平,并持續(xù)較長時(shí)間。 大量失血導(dǎo)致心臟供血迅速減少,引發(fā)高死亡率。 因此,在目前的模型中,出血發(fā)作時(shí)間通常太短(少于90 min),無法誘導(dǎo)組織損傷。 例如,Carrillo 等[21]、Capone 等[22]表明,在40 mm Hg 的MAP 下持續(xù)60 min 或30 mm Hg 的MAP 下持續(xù)45 min 的失血性休克不會對術(shù)后存活的大鼠造成細(xì)微的功能或組織學(xué)腦損傷,而將MAP 控制在30 mm Hg 的水平有可能導(dǎo)致心臟驟停。 此外,低血壓發(fā)作時(shí)間較短的動物模型顯然不能很好地模擬某些嚴(yán)重失血性休克患者持續(xù)出現(xiàn)的輕微神經(jīng)行為缺陷的臨床表現(xiàn)[23]。 因此,我們開發(fā)了一種新型的大鼠失血性休克模型,可以克服這些缺點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級雄性SD 大鼠30 只,體重250~300 g,8~10 周齡,均購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]。 將所有大鼠飼養(yǎng)在溫度22℃~25℃和濕度55%~65%的控制室內(nèi),光照和黑暗條件12 h 交替循環(huán),適應(yīng)環(huán)境一周,期間可自由飲水和進(jìn)食。 大鼠無菌手術(shù)實(shí)驗(yàn)操作與組織取材均在河北醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價(jià)研究中心設(shè)施內(nèi)進(jìn)行[SYXK(冀)2018-005]。 本研究方案已通過河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院機(jī)構(gòu)動物保護(hù)和使用委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號SM20171)。 并按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

異氟烷、小動物麻醉機(jī)(深圳瑞沃德公司);肝素鈉注射液(江蘇萬邦公司);BL-420F 信號采集和分析系統(tǒng)(成都泰盟公司);血?dú)夥治鰞x(ABL80 Flex,丹麥RADIOMETER)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 注射器儲血庫的連接方法

血液儲存裝置(注射器儲血庫)連接方法如圖1所示。 10 mL 注射器用作血液儲存器,將注射器固定在墻壁上,在外科手術(shù)板上方47.58 cm 處有0.0 mL 標(biāo)記。 注射器血液儲存器回路用肝素溶液(12 000 U/mL)沖洗,防止凝血。

圖1 注射器儲血庫的連接Note. A, Syringe(10 mL). B, Baxter non-DEHP high-flow rate extension set(or 1.5-meter-long PE-190 tubing). C, Three-way stopcock. D, Connector to blood pressure transducer. E, 20-gauge needle. F, 20-gauge needle cap protector. G, 20 cm PE-50 tubing.The total prime volume in the circuit was approximately 2 mL.Figure 1 Connection of the syringe blood reservoir

1.3.2 模型制備

將大鼠麻醉,根據(jù)動物失去腳蹬反射(捏腳趾)證實(shí)麻醉狀態(tài)。 在整個(gè)休克期間,仔細(xì)監(jiān)測動物,如果有任何醒來的跡象,則加大麻醉氣體流量,重復(fù)麻醉。 監(jiān)測大鼠的直腸溫度,并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中用手術(shù)燈加熱保持直腸溫度在(37±1)℃。 在無菌條件下,通過局部切口剝離右側(cè)股動脈,將PE-50管插入右側(cè)股動脈。 每只大鼠通過股動脈注射500 U/kg 肝素。 將PE-50 管進(jìn)一步推進(jìn)腹主動脈(從腹股溝韌帶到管尖端約1 cm 長),從腹主動脈導(dǎo)出血液到注射器血庫中來誘導(dǎo)休克,當(dāng)血壓下降到所需水平時(shí)記錄出血性休克開始時(shí)間。 在休克期間,目標(biāo)MAP 為35 mm Hg。 在失血性休克期間,必須上下移動注射器,使其與目標(biāo)MAP 對應(yīng)高度處的血液水平相匹配。 從理論上講,47.58 cm 高度處的血液水平在地球重力(1 mm Hg ≈1.3595 mm H2O)下產(chǎn)生35 mm Hg 壓力。 注射器儲血器內(nèi)的血液作為反饋機(jī)制,有助于控制動脈血壓恒定,即當(dāng)大鼠血壓升高時(shí),它會自動放血到注射器儲液器中,當(dāng)大鼠血壓下降時(shí),它會自動回輸血液,以此維持整個(gè)休克發(fā)作期間的血壓穩(wěn)定。

1.3.3 觀察指標(biāo)

在實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)監(jiān)測EKG。 將血壓傳感器連接到三通旋塞以測量血壓。 使用BL-420F 信號采集和分析系統(tǒng)獲得血壓和心率。 記錄最大失血量和最終失血量,即在3 h 休克期間注射器儲血庫中達(dá)到的最高血液水平和在失血性休克結(jié)束時(shí)的血液水平。 使用ABL80 Flex 血?dú)夥治鰞x檢測出血前和休克結(jié)束后的酸堿度(pH 值)、乳酸(Lac)、氧分壓(PaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2)、血紅蛋白(Hct)。病理檢測:大鼠處死后,所有大鼠灌流10%福爾馬林緩沖液,在室溫下收集并固定大腦一周,石蠟包埋切片(4 μm)用蘇木精-伊紅染色,研究人員用雙盲法評估海馬神經(jīng)元的組織病理學(xué)變化。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)分組

2 只大鼠進(jìn)行假手術(shù)處理,僅測量股動脈血壓和心率,未引起失血性休克。 將剩余28 只大鼠隨機(jī)分為4 組(如表1),每組中的大鼠都經(jīng)歷3 h 的失血性休克。 選擇這種失血性休克發(fā)作時(shí)長,是據(jù)報(bào)道提示短期和不太嚴(yán)重的失血性休克不會引起明顯的組織損傷[21-23]。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對所有大鼠實(shí)施安樂死,在正常體溫下腹腔注射200 mg/kg 戊巴比妥鈉。

表1 實(shí)驗(yàn)分組(n=7)Table 1 Experimental grouping

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。 所有變量均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用單因素方差分析,如若存在差異,則兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。 在應(yīng)用方差分析之前,使用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)評估數(shù)據(jù)分布。 結(jié)果表明,所有參數(shù)數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布。 采用Kaplan-Meier 生存分析和log-ran檢驗(yàn)分析RN、RB、RR 組的大鼠生存時(shí)間。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(雙尾)。 樣本量根據(jù)Capone 等[23]的研究中的失血性休克模型和Charan等[24]的動物數(shù)量計(jì)算方法計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 存活率

使用注射器儲血庫建立的大鼠失血性休克動物模型,在3 h 休克結(jié)束后所有大鼠均能存活(各組存活率100%)。 復(fù)蘇期斷開注射器血庫后,RB 組和RR 組復(fù)蘇后大鼠均能存活3 h。 然而,在RN 組中,存活率顯著降低(約14%,P<0.05),7 只大鼠中有6 只在失血性休克后25、28、45、50、60 和120 min死亡。 大鼠死亡定義為血壓低于15 mm Hg、呼吸喪失或心臟驟停。

2.2 血壓和心率

兩只接受假手術(shù)的大鼠,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,血液MAP 保持在110~125 mm Hg 之間,心率 保 持 在 260 ~ 276 bpm 之 間。 在 休 克 前(Baseline)或休克期間,實(shí)驗(yàn)組之間的MAP 和心率沒有顯著差異。

所有組測得的血壓和心率值見表2 和表3。 在血液達(dá)到注射器的0.0 mL 標(biāo)記后5 min 內(nèi),MAP 從基線下降到目標(biāo)血壓。 在手術(shù)臺上方47.58 cm 處保持注射器儲血庫內(nèi)的血液水平,HS、RN、RB、RR組的MAP 分別保持在(31.1±2.9)、(34.6±2.1)、(35.3±3.2)、(33.8±1.5)mm Hg(與休克前相比,P<0.05)。 失血性休克還導(dǎo)致各組心率顯著降低(與休克前相比,P<0.05)。

表2 平均動脈壓Table 2 Mean arterial blood pressure

表3 心率值Table 3 Heart rate

在沒有復(fù)蘇的情況下,當(dāng)注射器儲血庫的血液通道關(guān)閉時(shí),MAP 逐漸下降到0.0 mm Hg,導(dǎo)致7只大鼠中有6 只死亡。 對于一只存活的大鼠,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)MAP 非常低,約20 mm Hg(RN 組)。 在休克結(jié)束后,血液再輸注復(fù)蘇使得MAP 顯著增加至(90±21.2)mm Hg(RB 組)。 乳酸林格氏液復(fù)蘇后,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)血壓僅為(35.5±10.2)mm Hg。 復(fù)蘇RB 組MAP 值和心率顯著高于RR 組(P<0.05)。

2.3 血?dú)?、乳酸和血紅蛋白濃度(Hct)

血?dú)狻⑷樗岷虷ct 數(shù)據(jù)見表4。 失血性休克后各組血pH 值和Hct 值均較休克前(Baseline)顯著降低(P<0.05),血乳酸值顯著升高(P<0.05),而PO2和PCO2均保持在正常范圍,與休克前相比無太大變化。

表4 血?dú)夂腿樗岷縏able 4 Blood gas and lactate

2.4 失血量

體重和失血量數(shù)據(jù)見表5。 失血性休克后20~30 min 出現(xiàn)最大失血量。 失血性休克期間最大失血量和最終失血量非常相接近。 以注射器中的出血量加上血液回路中的血液量(2 mL)計(jì)算失血量。

表5 體重和失血量Table 5 Body weight and blood loss

2.5 病理學(xué)評價(jià)

HE 染色后,光鏡觀察結(jié)果顯示,假手術(shù)的大鼠海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞排列規(guī)則,結(jié)構(gòu)清楚,細(xì)胞層次豐富,神經(jīng)元膜完整,細(xì)胞核形態(tài)正常。 失血休克(HS)組海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞排列較規(guī)則,細(xì)胞層次減少,部分神經(jīng)元胞膜破裂,細(xì)胞萎縮。 未灌注(RN)組海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞排列較規(guī)則,細(xì)胞層次減少,大量神經(jīng)元胞膜破裂,細(xì)胞萎縮。 血液灌注(RB)組海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞排列較規(guī)則,細(xì)胞層次減少,全部神經(jīng)元胞膜破裂,細(xì)胞嚴(yán)重萎縮。乳酸林格氏液灌注(RR)組海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞排列不規(guī)則,細(xì)胞層次嚴(yán)重減少,全部神經(jīng)元胞膜破裂,細(xì)胞嚴(yán)重萎縮。 (如圖2)。

圖2 大鼠海馬CA1 區(qū)蘇木精-伊紅染色Note. Twenty-eight rats were randomly divided into 4 groups. All groups were subjected to hemorrhagic shock for 3 hours (n=7 in each group). A, Rat that underwent the sham procedure with normal pyramidal cells. B, HS group. C, RN group. D, RB group.E, RR group. HS, Hemorrhagic shock for 3 hours. RN, Recovery by nothing. RB, Resuscitation by blood infusion. RR,Resuscitation by Ringer’s solution. Pyknotic hippocampal pyramidal neurons were shrunken with condensed and deeply stained nuclear chromatin (arrows).Figure 2 HE staining of rat hippocampus samples taken from the CA1 region

3 討論

Lamson 等[25]和Vivaldi 等[26]在20 世紀(jì)40 年代建立了一種能精確控制血壓的犬失血性休克模型。 然而,這種有價(jià)值的技術(shù)在很大程度上被忽視了。 值得注意的是,與使用大型動物相比,嚙齒動物的使用具有許多倫理和經(jīng)濟(jì)上的優(yōu)勢。 本研究應(yīng)用這種儲血技術(shù)來克服模擬失血性休克的嚙齒動物模型研究中的技術(shù)缺陷:血壓波動范圍大,并且難以維持長時(shí)間的嚴(yán)重失血性休克以誘發(fā)可靠的組織損傷。

在傳統(tǒng)的休克模型中,給動物放血直到動脈壓力達(dá)到預(yù)定水平,然后在必要時(shí)通過反復(fù)出血或輸液來手動維持壓力[27]。 然而,通常很難確定何時(shí)以及在多大程度上輸注或抽出血液。 手動控制血壓會導(dǎo)致顯著的血壓波動。 因此,傳統(tǒng)的“定壓”模型并沒有真正表現(xiàn)出定壓,因?yàn)槿狈τ行У募夹g(shù)來控制廣泛的血壓波動。 在定容出血模型中,在不同的實(shí)驗(yàn)中,30%~60%的估計(jì)血容量被放出,并且低血壓的程度沒有被正確定義。 大鼠失血量隨體重和每只大鼠的Hct 而變化[28]。 在計(jì)算休克時(shí)間之前,出血時(shí)間也因動物而異。 因此,目前的失血性休克模型總是遇到標(biāo)準(zhǔn)化和再現(xiàn)性的問題。 大量失血導(dǎo)致心臟供血迅速減少,導(dǎo)致高死亡率,從而顯著地限制了休克的持續(xù)時(shí)間。 為了在實(shí)驗(yàn)中引起可靠的組織損傷,MAP 必須在一定時(shí)間內(nèi)保持在較低的水平。 Stein 等[29]報(bào)告稱,持續(xù)不到20 min 的25~30 mm Hg MAP 不會對大鼠造成危及生命的器官損傷。 Hoppen 等[30]報(bào)告,45 mm Hg 的MAP 持續(xù)60 min 不會對大鼠造成嚴(yán)重?fù)p害。 此外,研究表明,在40 mm Hg 的MAP 下持續(xù)60 min 或30 mm Hg 的MAP 下持續(xù)45 min 的失血性休克不會導(dǎo)致輕微的功能或組織學(xué)腦損傷[21-23]。

通過新設(shè)計(jì)的注射器儲血庫裝置,能夠準(zhǔn)確地控制血壓而無波動。 在3 h 失血性休克發(fā)作期間,MAP 準(zhǔn)確地維持在31~35 mm Hg 左右(表2)。 休克發(fā)作時(shí),只需監(jiān)測注射器血庫內(nèi)的血液水平,并上下移動注射器,使血液水平高于大鼠身體(心臟位置)47.58 cm。 理論上,由于重力作用,大鼠身體上方47.58 cm 處的血液水平產(chǎn)生了35 mm Hg 的壓力。 根據(jù)預(yù)先確定的血壓自動調(diào)節(jié)輸注或輸出。因此,血壓波動很小。 從技術(shù)上講,可能會出現(xiàn)輕微的血壓波動,但只有在延遲移動注射器以使儲液器內(nèi)的血液水平較長時(shí)間保持高于大鼠身體上方47.58 cm 時(shí)才會發(fā)生。 恒定的MAP 保證了基本的心臟供血,失血性休克期可輕松維持3 h,PO2和PCO2保持也在正常范圍內(nèi)(表4)。 鑒于血液再輸注后MAP 恢復(fù)到(90±21.2)mm Hg(RB 組,表2),因此認(rèn)為在該模型中心肺功能相對保持或有恢復(fù)的潛力。 很可能我們的注射器血庫抵消了血壓下降,從而阻止了冠狀動脈血流的顯著減少。 在整個(gè)3 h 的休克過程中,最大失血量和最終失血量非常接近,大約在9.2~9.4 mL 之間。 大鼠血流量約為50~70 mL/Kg[30]。 對于體重約250 g 的大鼠,該模型中的失血量至少相當(dāng)于循環(huán)血流量的60%。 因此,該模型不僅是定壓模型,而且是定容模型。 經(jīng)過如此長時(shí)間的嚴(yán)重失血性休克后,能夠在所有的實(shí)驗(yàn)組中發(fā)現(xiàn)明顯的腦損傷。 海馬組織對缺血缺氧比較敏感,其損傷時(shí)的特征是大量的神經(jīng)元固縮,如圖2 所示。 失血性休克3 h 導(dǎo)致該模型嚴(yán)重乳酸酸中毒(表4,顯著降低血pH 值和乳酸升高)。7 只未復(fù)蘇的大鼠中有6 只在3 h 失血性休克發(fā)作后120 min 內(nèi)死亡(RN 組),但所有失血后經(jīng)過液體復(fù)蘇的大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間均可存活(RB 組和RR組)。 這意味著盡管有嚴(yán)重的出血,這個(gè)模型依然是可以救治的。

總之,利用注射器血庫建立的高重復(fù)性失血性休克模型可以成為研究失血性休克的病理生理變化、器官、組織損傷和治療效果的非常有用的工具。