倪禮禮,姚 佳,汪學猛,杜 煜

(1.洛陽職業(yè)技術學院食品與藥品學院,河南 洛陽 471900;2.信陽職業(yè)技術學院藥學院,河南 信陽 464000)

腦外傷屬于臨床常見顱腦損傷類型之一,通常會造成患者行為、精神、記憶學習等方面功能障礙,具有較高的致死率和致殘率,嚴重影響患者生活質量[1]。 腦外傷機制較復雜,主要涉及神經損傷、腦水腫、血腦屏障等,目前尚未有統(tǒng)一定論。 一氧化氮(nitric oxide,NO)屬于神經介質,正常狀態(tài)下少量NO 可調節(jié)血流、擴張血管,而過量的NO 則會對神經細胞產生毒性[2]。 研究發(fā)現腦損傷后可激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)生成大量的NO,進而加重神經損傷[3]。 2,4-二胺-6-羥基嘧啶(2,4-diamino-6-hydroxypyrimidine,DAHP)為三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶 1 ( guanosine triphosphate cyclohydrolase 1,GCH1)抑制劑,可通過抑制GCH1的合成進而降低誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達,影響NO 的合成,然而其在腦損傷中的作用研究不多[4]。 本研究通過復制腦外傷模型大鼠,并給予DAHP 干預,旨在探究其對腦外傷大鼠的神經保護作用及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

70 只SPF 級SD 健康大鼠,雄性,8 周齡,體重(200±20)g,由河南環(huán)宇康禾生物科技有限公司提供[SCXK(豫)2020-0004],動物飼養(yǎng)在洛陽職業(yè)技術學院食品與藥品學院實驗室[SYXK(豫)2020-0027],濕度(40±10)%,溫度(22±3)℃,采用晝夜交替12 h 光照,期間大鼠自由飲食、飲水,一周后用于造模,實驗遵循3R 原則。 本研究經洛陽職業(yè)技術學院倫理委員會批準(LDS2020024)。

1.2 主要試劑與儀器

DAHP(購自美國Cayman 公司,批號:81260-1);四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)(購自美國MCE 公司,批號:HY-107383);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(購自碧云天生物技術有限公司,批號:C0105);Tunel 細胞凋亡檢測試劑盒(購自美國ROCHE 公司,批號:11684817910);NO 檢測試劑盒(購自美國Solarbio 公司,批號:BC147);BCA 蛋白檢測試劑盒(購自美國Thermo Scientific 公司,批號:23225);兔抗鼠神經型一氧化氮合酶(nNOS)、iNOS、β-肌動蛋白(β-actin)一抗(購自美國Sigma公司,批號:SAB4502010、SAB4502012、A5441);兔抗鼠核因子-κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(TNFα)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)一抗(購自美國R&D 公司,批號:MAB5078、AF-425-PB、AF4198);兔抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B 淋巴細胞瘤-2 基因(Bcl-2)一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(購自英國Abcam 公司,批號:ab179517、ab185002、ab10032);光學顯微鏡(購自日本奧林巴斯公司,型號:IX51);熒光顯微鏡(購自舜宇光學科技集團有限公司,型號:CX40);酶標儀(購自美國BioTek 公司,型號:Synergy NEO2);凝膠成像儀(購自德國Royal 公司,型號:Gel IX Imager)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備

隨機挑選58 只大鼠進行造模,另選取12 只大鼠作為假手術組,參照改良Feeney 法制備腦挫傷大鼠[5],自制打擊器,將打擊器在大鼠腦表面上方垂直固定,將打擊器沿著金屬套管自30 cm 高度垂直落下打擊大鼠頭部,造成右側腦半球腦挫裂傷。 造模后2 h,待大鼠清醒后根據Longa 等[6]神經功能缺損評定標準對大鼠神經功能進行評定,將評分2~3 分大鼠納入模型,剔除操作不當、未成功大鼠,造模成功大鼠48 只。 假手術組僅打開骨窗不采取打擊器打擊。

1.3.2 動物分組與給藥

將造模成功大鼠隨機分為模型組、DAHP 組、NOS 激活劑組(BH4 組)、DAHP+BH4 組,每組12只。 DAHP 組:造模后2 h 尾靜脈注射0.5 g/kg 的DAHP[7];BH4 組:造模后2 h 尾靜脈注射0.3 mg/kg 的BH4[8],DAHP+BH4 組:造模后2 h 尾靜脈注射0.5 g/kg 的DAHP 與0.3 mg/kg 的BH4;假手術組、模型組均注射等量生理鹽水;注射體積均為10 mL/kg,各組每天給藥1 次,連續(xù)處理1 周。

1.3.3 定位航行、空間探索實驗評估大鼠行為學

末次處理后,評估大鼠行為學。 將水池4 象限中點作為入水點,將大鼠從隨意象限放入水池面對池壁,記錄大鼠尋找逃避平臺的時間,為逃避潛伏期。 撤去逃避平臺,將大鼠從原平臺對側放入水池中,連續(xù)記錄游泳120 s 內在各象限所用時間,計算原平臺象限游泳時間與逃避潛伏期比例,即為空間探索時間比例。

1.3.4 HE 染色觀察大鼠腦組織形態(tài)學變化

行為學評估結束后,將大鼠處死,獲取全腦組織,在4%多聚甲醛中過夜固定后,取損傷區(qū),制備腦組織石蠟切片,厚度為3 μm,參考HE 染色試劑盒對切片進行染色,經乙醇脫水、二甲苯透明、樹膠封片后,在光學顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)學變化。

1.3.5 Tunel 染色觀察腦組織細胞凋亡

制備腦組織冰凍切片,添加蛋白酶K 溶液室溫下孵育10 min,清洗后,添加TdT 緩沖液孵育20 min,避光添加Tunel 工作液孵育1 h,清洗后封片,置于熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況。 用Image-Pro 軟件定量分析腦組織細胞凋亡率=綠色熒光細胞數/細胞總數×100%。

1.3.6 腦組織中NO 水平的測定

將腦組織剪切為碎塊后,添加9 倍體積生理鹽水,置于勻漿器內勻漿,采用Griess 法檢測腦組織NO 水平。

1.3.7 免疫印跡法檢測腦組織中蛋白表達

TRIzol 法提取腦組織總蛋白,BCA 法檢測蛋白含量,統(tǒng)一定量30 μg 進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,將蛋白轉移至PVDF 膜上,經5%脫脂奶粉封閉后加入nNOS、iNOS、NF-κB、TNF-α、COX-2、 Caspase-3、 Bcl-2、 β-actin 一 抗(均 為1 ∶1000),4℃過夜孵育后,用HRP 標記二抗(1 ∶5000)37℃孵育膜2 h,添加ECL 顯色液曝光后,用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,以β-actin 作為內參,定量評估各蛋白相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行數據統(tǒng)計分析,計量資料以平均數±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學比較

與假手術組相比,模型組逃避潛伏期延長,空間探索時間比例降低(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組逃避潛伏期縮短,空間探索時間比例升高,BH4 組逃避潛伏期延長,空間探索時間比例降低(P<0.05);DAHP+BH4 組逃避潛伏期短于BH4 組,空間探索時間比例高于BH4 組(P<0.05)。 見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期、空間探索時間比例比較(±s,n=12)Table 1 Comparison of escape latency and proportion of space exploration time of rats in each group

表1 各組大鼠逃避潛伏期、空間探索時間比例比較(±s,n=12)Table 1 Comparison of escape latency and proportion of space exploration time of rats in each group

注:與假手術組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP < 0.05. Compared with DAHP group, cP < 0.05.Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups逃避潛伏期(s)Escape latency空間探索時間比例(%)Proportion of space exploration time假手術組Sham operation group 37.47±4.64 58.65±4.51模型組Model group 61.64±8.75a 37.18±3.46a DAHP 組DAHP group 45.24±4.68ab 44.89±3.42ab BH4 組BH4 group 72.16±7.43abc 29.87±3.41abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 62.58±8.13acd 36.11±4.38acd

2.2 DAHP 對大鼠腦組織形態(tài)學的影響

假手術組腦組織神經細胞形態(tài)正常,排列有序,細胞核著色均勻;模型組神經細胞發(fā)生腫脹、變形、細胞核固縮,著色加深,壞死細胞增多,伴有炎性細胞浸潤;與模型組相比,DAHP 組神經細胞組織形態(tài)得到一定緩解,壞死細胞減少,炎性浸潤程度減輕,BH4 組壞死神經細胞數量增多,細胞核固縮,染色變深,損傷程度加重,DAHP+BH4 組細胞形態(tài)變化不顯著。 見圖1。

圖1 HE 染色檢測腦組織形態(tài)學變化Note. A, Sham operation group. B, Model group. C, DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 1 HE staining was used to detect the morphological changes of brain tissue

2.3 DAHP 對大鼠腦組織細胞凋亡的影響

與假手術組相比,模型組大鼠腦組織細胞凋亡率升高(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組大鼠腦組織細胞凋亡率降低,BH4 組大鼠腦組織細胞凋亡率升高(P<0.05);DAHP+BH4 組大鼠腦組織細胞凋亡率低于BH4 組(P<0.05)。 見圖2 和表2。

圖2 Tunel 染色檢測腦組織細胞凋亡情況Note. A, Sham operation group. B, Model group. C, DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 2 Tunel staining was used to detect apoptosis in brain tissue

表2 各組大鼠腦組織細胞凋亡率比較(±s,n=12)Table 2 Comparison of apoptosis rate of brain tissue in each group

表2 各組大鼠腦組織細胞凋亡率比較(±s,n=12)Table 2 Comparison of apoptosis rate of brain tissue in each group

注:與假手術組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP < 0.05. Compared with DAHP group, cP < 0.05.Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups 凋亡率(%)Apoptosis rate假手術組Sham operation group 0模型組Model group 38.19±4.36a DAHP 組DAHP group 27.87±3.64ab BH4 組BH4 group 47.64±4.97abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 38.73±4.13acd

2.4 DAHP 對大鼠腦組織NOS 通路的影響

與假手術組相比,模型組大鼠腦組織nNOS、iNOS 蛋白表達、NO 水平升高(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組大鼠腦組織nNOS、iNOS 蛋白表達、NO 水平降低,BH4 組大鼠腦組織nNOS、iNOS 蛋白表達、NO 水平升高(P<0.05);DAHP+BH4 組大鼠腦組織nNOS、iNOS 蛋白表達、NO 水平低于BH4 組(P<0.05)。 見圖3 和表3。

圖3 免疫印跡法檢測大鼠腦組織中nNOS、iNOS 蛋白表達Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 3 Western blot was used to detect the protein expression of nNOS and iNOS in rat brain

表3 各組大鼠腦組織中nNOS、iNOS、NO 水平比較(±s,n=12)Table 3 Comparison of nNOS, iNOS and NO levels in brain tissue of rats in each group

表3 各組大鼠腦組織中nNOS、iNOS、NO 水平比較(±s,n=12)Table 3 Comparison of nNOS, iNOS and NO levels in brain tissue of rats in each group

注:與假手術組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP<0.05. Compared with DAHP group, cP<0.05. Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups nNOS/β-actin iNOS/β-actin NO(μmol/L)假手術組Sham operation group 0.19±0.03 0.21±0.04 1.03±0.03模型組Model group 0.38±0.05a 0.82±0.08a 1.64±0.11a DAHP 組DAHP group 0.26±0.04ab 0.51±0.05ab 1.39±0.05ab BH4 組BH4 group 0.51±0.06abc 1.04±0.13abc 1.92±0.07abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 0.40±0.05acd 0.79±0.08acd 1.62±0.12acd

2.5 DAHP 對大鼠腦組織炎性因子NF-κB、TNFα、COX-2 的影響

與假手術組相比,模型組大鼠腦組織NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達升高(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組大鼠腦組織NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達降低,BH4 組大鼠腦組織NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達升高(P<0.05);DAHP+BH4 組大鼠腦組織NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達低于BH4組(P<0.05)。 見圖4 和表4。

圖4 免疫印跡法檢測腦組織中NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 4 Western blot was used to detect the protein expression of NF-κB, TNF-α and COX-2 in brain tissue

表4 各組大鼠腦組織中NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達比較(±s,n=12)Table 4 Comparison of protein expression of NF-κB, TNF-α and COX-2 in brain tissue of rats in each group

表4 各組大鼠腦組織中NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達比較(±s,n=12)Table 4 Comparison of protein expression of NF-κB, TNF-α and COX-2 in brain tissue of rats in each group

注:與假手術組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP<0.05. Compared with DAHP group, cP<0.05. Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups NF-κB/β-actin TNF-α/β-actin COX-2/β-actin假手術組Sham operation group 0.16±0.03 0.15±0.03 0.16±0.03模型組Model group 0.95±0.09a 0.61±0.07a 0.66±0.09a DAHP 組DAHP group 0.33±0.04ab 0.28±0.05ab 0.43±0.08ab BH4 組BH4 group 1.14±0.11abc 0.89±0.12abc 0.87±0.07abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 0.97±0.07acd 0.63±0.09acd 0.68±0.06acd

2.6 DAHP 對大鼠腦組織凋亡蛋白表達的影響

與假手術組相比,模型組大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達升高,Bcl-2 蛋白表達降低(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組大鼠腦組織Caspase-3 蛋白表達降低,Bcl-2 蛋白表達升高,BH4 組大鼠腦組織Caspase-3 蛋白表達升高,Bcl-2 蛋白表達降低(P<0.05);DAHP+BH4 組大鼠腦組織Caspase-3 蛋白表達低于BH4 組,Bcl-2 蛋白表達高于BH4 組(P<0.05)。 見圖5 和表5。

圖5 免疫印跡法檢測大鼠腦組織中凋亡蛋白表達情況Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 5 Western blot was used to detect the expression of apoptotic protein in rat brain

表5 各組大鼠腦組織中Caspase-3、Bcl-2 蛋白表達比較(±s,n=12)Table 5 Comparison of Caspase-3 and Bcl-2 protein expression in brain tissue of rats in each group

表5 各組大鼠腦組織中Caspase-3、Bcl-2 蛋白表達比較(±s,n=12)Table 5 Comparison of Caspase-3 and Bcl-2 protein expression in brain tissue of rats in each group

注:與假手術組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP < 0.05. Compared with DAHP group, cP < 0.05.Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups Caspase-3/β-actin Bcl-2/β-actin假手術組Sham operation group 0.25±0.03 1.25±0.15模型組Model group 0.63±0.08a 0.41±0.06a DAHP 組DAHP group 0.45±0.05ab 0.55±0.05ab BH4 組BH4 group 0.78±0.06abc 0.22±0.03abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 0.61±0.09acd 0.42±0.05acd

3 討論

繼發(fā)性腦損傷后短時間內,腦組織中會出現的大量炎性細胞浸潤,組織中炎癥反應會進一步加重腦損傷程度,此外腦損傷后腦組織出現缺血、缺氧,造成細胞代謝異常,引發(fā)組織病理損傷,加速神經元死亡[9]。 本研究采用改良Feeney 法制備腦外傷模型大鼠,經定位航行與空間探索實驗發(fā)現模型組大鼠逃避潛伏期要顯著長于假手術組,而空間探索時間比例明顯低于假手術組,提示腦外傷導致大鼠記憶功能障礙,神經功能受損。 HE 染色發(fā)現,模型組大鼠腦組織神經細胞發(fā)生腫脹、變形、細胞核固縮,著色加深,壞死細胞增多,伴有炎性細胞浸潤,說明模型大鼠腦組織出現炎性損傷,神經細胞受損,這與以往腦外傷模型動物特征相似[10],提示模型大鼠腦組織受損,神經功能發(fā)生障礙,腦外傷大鼠模型制備成功。

NOS 信號通路與腦損傷的發(fā)生密切相關,其通過催化形成NO,發(fā)揮對腦組織神經的保護或損傷作用。 機體中的NOS 主要包括內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、iNOS 及nNOS,過往研究發(fā)現在腦損傷早期eNOS 表達較高,通過催化生成NO 發(fā)揮對腦組織的神經保護作用,而在腦損傷中、后期nNOS、iNOS 大量表達則會釋放對腦神經有害的NO[11]。Yong 等[12]研究發(fā)現缺血再灌注損傷大鼠腦組織中eNOS 水平降低,iNOS 水平升高,給予電針治療后,能夠顯著上調eNOS,下調iNOS 水平,緩解神經功能缺損、神經元凋亡。 川芎嗪類似物CXC195 通過抑制NADPH 氧化酶和iNOS 的表達,發(fā)揮對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[13]。 本研究發(fā)現,與假手術組相比,模型組大鼠腦組織中nNOS、iNOS 蛋白表達、NO 水平升高,提示NOS 信號通路的激活與腦外傷的發(fā)生相關。

BH4 為炎性因子及神經遞質合成的輔助因子,而GCH1 為BH4 合成主要限速酶,二者與神經損傷、疼痛的發(fā)生相關。 DAHP 為GCH1 抑制劑,可通過抑制GCH1 的合成進而降低BH4 合成,研究發(fā)現采用DAHP 能夠抑制GCH1 的表達,進而降低iNOS的表達,影響NO 的合成[14]。 近期有研究顯示DAHP 能夠通過下調iNOS 表達,進而降低腦缺血再灌注損傷大鼠梗死面積,減輕腦水腫,發(fā)揮對腦組織的保護作用[15]。 Li 等[16]研究發(fā)現DAHP 通過抑制凋亡和激活磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路對發(fā)揮對局灶性腦缺血的保護作用[16]。 本研究發(fā)現采用BH4 處理模型大鼠后,逃避潛伏期延長,空間探索時間比例降低,腦組織損傷程度加重;而采用BH4 聯合DAHP 處理模型大鼠后,與BH4 組比較,大鼠逃避潛伏期縮短,空間探索時間比例升高,腦組織損傷程度有所緩解,提示DAHP 可通過抑制iNOS 信號通路的表達,進而緩解腦外傷大鼠腦組織神經損傷。 在腦損傷后過量炎癥反映會導致COX-2、iNOS 表達升高,過往研究發(fā)現在腦損傷后24 h 內,COX-2 達到最大值,其水平與病情嚴重程度密切有關[17]。 此外腦損傷后NF-κB 表達大量升高,進一步刺激iNOS 合成大量的NO,上調促炎癥因子TNF-α 表達,加重炎癥損傷[18]。 本研究發(fā)現模型組大鼠腦組織中COX-2、NF-κB、TNF-α 蛋白表達明顯升高,給予BH4 后能夠進一步升高上述炎癥因子的表達,聯合DAHP 后則能抑制上述炎癥因子的表達,提示DAHP 可能通過抑制NOS 表達進而緩解對腦外傷大鼠炎癥損傷。

神經細胞凋亡參與腦損傷的發(fā)生、發(fā)展過程,細胞凋亡數量的多少,與損傷嚴重程度密切相關[19]。 本研究通過Tunel 染色檢測發(fā)現,模型組大鼠腦組織中神經細胞凋亡率明顯升高,給予BH4 處理后細胞凋亡加重,聯合DAHP 處理后細胞凋亡降低,提示DAHP 可通過減輕神經細胞凋亡,保護腦組織。 Caspase-3 是細胞死亡的最終執(zhí)行者,而Bcl-2 作為抗凋亡蛋白能夠抑制Caspase-3 激活,阻斷Bax 等凋亡蛋白的激活,研究發(fā)現腦損傷后24 h Caspase-3 表達達到最高峰,而Bcl-2 表達則最低[20]。 本研究發(fā)現模型組大鼠腦組織中Caspase-3蛋白表達升高,Bcl-2 蛋白表達降低,給予BH4 后能夠Caspase-3 蛋白表達進一步升高,Bcl-2 蛋白表達進一步降低,聯合DAHP 后Caspase-3 蛋白表達降低,Bcl-2 蛋白表達升高,提示DAHP 可能通過抑制凋亡蛋白激活,發(fā)揮抗凋亡作用,保護腦外傷大鼠神經功能。

綜上所述,DAHP 能夠緩解腦外傷大鼠腦組織神經細胞凋亡,降低炎性損傷,緩解神經功能障礙,其機制可能與抑制iNOS 信號通路有關。 然而本研究也存在不足,腦外傷機制較復雜,DAPH 是否還通過其他途徑發(fā)揮對腦組織神經保護作用,尚待后續(xù)深入探究。