邵玉普,劉 斌,李偉明,邵喜靈,陳巧格

(1.河南醫(yī)學高等?？茖W校 基礎醫(yī)學實驗中心,河南 新鄭 451191;2.河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院 腫瘤科,鄭州 450008;3.河南醫(yī)學高等專科學校 護理系實訓中心,河南 新鄭 451191;4.河南醫(yī)學高等?？茖W校人體解剖學教研室,河南 新鄭 451191)

胃癌是一種與環(huán)境、飲食生活、基因遺傳等多種因素有關的消化道惡性腫瘤,在我國的發(fā)病率僅次于肺癌,死亡率僅次于肝癌和肺癌[1]。 胃癌患者早期通常表現(xiàn)為非特異性的消化道癥狀,隨病情惡性進展,可出現(xiàn)上腹疼痛、食欲下降、吞咽困難、消瘦等,臨床主要采用手術聯(lián)合化療[2]。 然而,胃癌患者術后易發(fā)生復發(fā)和轉移,且長期化療的毒副作用較多,部分患者往往因無法耐受化療而被迫終止治療,嚴重影響了治療的效果[3]。 尋找新的有效藥物,輔助臨床治療,受到了研究者們的廣泛關注。去氫木香內酯(dehydrocostus lactone,DHCL)來源于天然植物藥物菊科云木香屬植物木香Aucklandia lappa Decne.的干燥根,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生物學活性[4]。 既往研究顯示,DHCL 可以抑制喉癌[5]、膠質瘤[6]、肺癌[7]等多種腫瘤細胞的增殖活性,誘導腫瘤細胞凋亡,有望應用于臨床抗腫瘤治療。 但DHCL 對胃癌細胞的作用尚不明確,且其具體的作用機制尚不清楚。 因此,本研究探討了DHCL 對胃癌細胞自噬、凋亡和氧化應激的影響,以期了解DHCL 可能的抗胃癌作用機制,為臨床治療提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

30 只雄性BALB/C 裸鼠,SPF 級,鼠齡4~5 周,體重(20±2)g,均購自河南省實驗動物中心[SCXK(豫)2017-0001]。 飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學實驗動物中心[SYXK(豫)2020-0004]。 所有實驗動物均遵循3R 原則,經動物實驗倫理審查通過(審批號IACUC-20200703)。

1.1.2 細胞

人胃癌SGC-7901 購自美國典型物種保藏中心。

1.2 主要試劑與儀器

DHCL 購自南京春秋生物工程有限公司,質量分數≥98%,批號20191206;DCFH-DA 探針購自北京百奧萊博科技有限公司;胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基均購自上海滬震生物科技有限公司(批號分別為20200508 和20190704);CCK-8 檢測試劑盒購自上海經科化學科技有限公司,批號20200915;兔抗人LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1、自噬相關蛋白7(autophagy associated protein 7,ATG7)、p62、B 細胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2 相關X 蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、BH3 相互作用域死亡激動劑(BH3 interaction domain death agonist,Bid)、截短型Bid(truncated Bid,tBid)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(Caspase-8)、Caspase-9、Caspase-3、裂 解 的 Caspase-8 ( cleaved Caspase-8)、 cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、β-actin 單克隆抗體購自美國CST 公司(批號分別為20200812、20200612、20200615、 20191215、 20200624、 20200815、20200621、 20200704、 20200715、 20200902、20191118、 20191215、 20200713、 20200714、20200812、20200905);辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)標記羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋生物技術公司, 批號101964; 二喹啉甲酸(bicinchoninic acid disodium,BCA)蛋白定量試劑盒和Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號分別為20191116 和20191205);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司(批號分別為20200712、20200916、20200608)。

實驗儀器IX73 型熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司;多功能酶標檢測儀(iMark680)購自美國Bio-Rad 公司;DXFLEX 流式細胞檢測儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CCK8 實驗篩選DHCL 劑量

將胃癌細胞SGC-7901 接種于含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液,培養(yǎng)過夜。 取培養(yǎng)至對數生長期的細胞制成單細胞懸液,調整細胞密度為5×104/mL,繼續(xù)培養(yǎng),加入100 μL 不同濃度的DHCL(終濃度分別為0、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L),孵育24 h 后,嚴格按照試劑盒說明采用CCK-8 法檢測細胞的增殖活性,檢測450 nm波長下的吸光度值,計算細胞的存活率。 根據細胞的增殖曲線,設置DHCL 0 μmol/L 組、DHCL 10 μmol/L 組、DHCL 20 μmol/L 組和DHCL 40 μmol/L 組。

1.3.2 Western blot 檢測細胞自噬相關蛋白表達的影響

取各組與相應濃度藥物孵育24 h 的細胞,提取總蛋白并且進行蛋白定量,經電泳、轉膜、室溫封閉2 h,加一抗p62(1 ∶1000)、Beclin1(1 ∶1000)、LC3Ⅱ(1 ∶1000)、LC3 Ⅰ(1 ∶1000)、ATG7(1 ∶1000),βactin(1 ∶500)為內參,4℃孵育過夜,洗膜加二抗(1 ∶5000)室溫孵育2 h,顯影,分析各蛋白相對內參的表達量。

1.3.3 免疫熒光檢測細胞自噬活性

取各組與相應濃度藥物孵育48 h 的細胞,棄培養(yǎng)基,采用質量分數為4%的甲醛固定10 min,加入200 μL 的Triton-X 作用30 min,采用3%牛血清蛋白封閉,加入LC3 一抗孵育過夜,加入熒光耦聯(lián)二抗,37℃孵育1 h 后封片,熒光顯微鏡下觀察LC3 熒光斑點數。

1.3.4 流式細胞儀分析細胞凋亡

取各組與相應濃度藥物孵育48 h 的細胞,調整細胞濃度約為1×105個/孔,預冷PBS 洗滌2 次,嚴格按照凋亡試劑盒說明采用Annexin V-FITC/PI 雙染法進行染色,上流式細胞儀分析細胞的凋亡率。

1.3.5 Western blot 檢測Bax、Bcl-2、Bid、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3 蛋白表達

取各組與相應濃度藥物孵育24 h 的細胞,檢測

Bax(1 ∶1000)、Bcl-2(1 ∶1000)、Bid(1 ∶1000)、tBid(1∶1000)、Caspase-8(1 ∶1000)、cleaved Caspase-8(1 ∶1000)、Caspase-9(1 ∶1000)、cleaved Caspase-9(1 ∶1000)、Caspase-3(1 ∶1000)和cleaved Caspase-3(1 ∶1000)蛋白表達,具體方法同1.3.2。

1.3.6 ELISA 法檢測細胞上清液中氧化應激因子水平

取各組與相應濃度藥物孵育24 h 的細胞,離心(2000 r/min,2 min),取上清,采用ELISA 法檢測細胞上清液中SOD、GSH-Px 和MDA 水平,嚴格按試劑盒說明操作。

1.3.7 DCFH-DA 探針檢測細胞內ROS 水平

取各組與相應濃度藥物孵育24 h 的細胞,以1×105個/孔接種于24 孔板,PBS 洗3 次,加入DCFH-DA 探針,37℃孵育1 h,PBS 洗3 次,加入新鮮培養(yǎng)基,熒光顯微鏡下觀察ROS 水平。

1.3.8 裸鼠移植瘤模型建立

30 只裸鼠預飼養(yǎng)7 d,隨機分為對照組和DHCL組,每組15 只。 所有裸鼠均采用背部尾側皮下種植0.2 mL 對數生長期SGC-7901 細胞懸液每毫升1×107個復制移植瘤模型,肉眼可見皮下成瘤,即為造模成功。 造模第2 天,DHCL 組腹腔注射20 mg/(kg·d) DHCL,連續(xù)注射2 周,對照組腹腔注射等體積生理鹽水。 末次給藥后第2 天,迅速處死大鼠,剝離移植瘤組織并稱重。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 進行統(tǒng)計學數據處理,滿足正態(tài)分布且方差齊的計量資料均以平均數±標準差(±s)表示,采用兩樣本獨立t檢驗比較兩組間差異,單因素方差分析比較多組間差異性,SNK-q比較多組內兩兩間差異,P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DHCL 抑制SGC-7901 細胞增殖

CCK-8 結果顯示(圖1),DHCL 對胃癌細胞的抑制作用呈藥物濃度依賴性,隨著DHCL 濃度增加,DHCL 濃度≥20 μmol/L 時,細胞存活率下降(P<0. 05)。 因此設置DHCL 低劑量、中劑量、高劑量組的濃度分別為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L。 DHCL 40 μmol/L 組 和DHCL 20 μmol/L 組細胞存活率低于DHCL 0 μmol/L 組(P<0. 05)。

圖1 DHCL 抑制SGC-7901 細胞增殖Note. Compared with 0 μmol/L DHCL, aP<0.05.Figure 1 DHCL inhibited the proliferation of SGC-7901 cells

2.2 DHCL 促進SGC-7901 細胞自噬相關蛋白表達

Western blot 結果顯示(圖2),DHCL 40 μmol/L組和DHCL 20 μmol/L 組細胞p62 蛋白表達低于DHCL 0 μmol/L 組(P<0.05),Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和ATG7 蛋白表達高于DHCL 0 μmol/L 組(P<0.05)。

圖2 DHCL 促進SGC-7901 細胞自噬相關蛋白表達Note. Ⅰ, Expression of autophagy-related proteins in each group. Ⅱ, Relative protein level of autophagy-related proteins. Compared with DHCL 0 μmol/L group, aP<0.05.Figure 2 DHCL promoted the expression of autophagy-related proteins in SGC-7901 cells

2.3 DHCL 增強SGC-7901 細胞自噬活性

免疫熒光實驗檢測結果顯示(圖3),DHCL 40 μmol/L 組和DHCL 20 μmol/L 組細胞LC3 熒光斑點數高于DHCL 0 μmol/L 組。

圖3 DHCL 增強SGC-7901 細胞自噬活性Figure 3 DHCL enhanced autophagy activity of SGC-7901 cells

2.4 DHCL 促進SGC-7901 細胞凋亡

流式細胞儀檢測結果顯示(圖4),DHCL 40 μmol/L 組和DHCL 20 μmol/L 組細胞凋亡率高于DHCL 0 μmol/L 組(P<0.05)。

2.5 DHCL 促進SGC-7901 細胞凋亡相關蛋白表達

Western blot 檢測結果顯示(圖5),DHCL 40 μmol/L 組和DHCL 20 μmol/L 組細胞Bax/Bcl-2、tBid/Bid、 cleaved Caspase-8/Caspase-8、 cleaved Caspase-9/Caspase-9 和cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達高于DHCL 0 μmol/L 組(P<0.05)。

圖5 DHCL 促進SGC-7901 細胞凋亡相關蛋白表達Note. Ⅰ, Protein expression detected by Western blot. Ⅱ, Relative protein level. Compared with DHCL 0 μmol/L group, aP<0.05.Figure 5 DHCL promoted the expression of apoptosis-related proteins in SGC-7901 cells

2.6 DHCL 抑制SGC-7901 細胞抗氧化酶表達

ELISA 檢測結果顯示(圖6),DHCL 40 μmol/L組和DHCL 20 μmol/L 組細胞SOD 和GSH-Px 水平低于DHCL 0 μmol/L 組(P<0.05),MDA 水平高于DHCL 0 μmol/L 組(P<0.05)。

圖6 DHCL 抑制SGC-7901 細胞抗氧化酶表達Note. Ⅰ, SOD. Ⅱ, GSH-Px. Ⅲ, MDA. Compared with DHCL 0 μmol/L group, aP<0.05.Figure 6 DHCL inhibits the expression of antioxidant enzymes in SGC-7901 cells

2.7 DHCL 促進SGC-7901 細胞內ROS 生成

DCFH-DA 探針檢測結果顯示(圖7),DHCL 40 μmol/L 組和DHCL 20 μmol/L 組細胞內ROS 水平高于DHCL 0 μmol/L 組。

圖7 DHCL 促進SGC-7901 細胞內ROS 生成Figure 7 DHCL promotes ROS production in SGC-7901 cells

2.8 DHCL 抑制裸鼠移植瘤生長

裸鼠移植瘤結果顯示(圖8),DHCL 組裸鼠移植瘤的質量低于對照組(P<0.05)。

圖8 DHCL 抑制裸鼠移植瘤生長Note. Compared with DHCL 0 mg/kg group, aP<0.05.Figure 8 DHCL inhibited the growth of xenograft tumor in nude mice

3 討論

木香是一種草本植物藥材,味苦,性溫,歸脾及胃,常用于治療腹脹、消化不良、嘔吐腹瀉等消化道疾病[8]。 DHCL 是從云木香根中分離的一種天然倍半萜類化合物,具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、改善胃腸道功能等多種生物學作用,可以抑制多種腫瘤細胞的生長,發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。 本研究探討了DHCL 對胃癌細胞生長的影響,發(fā)現(xiàn)DHCL 對SGC-7901 細胞的抑制作用呈藥物濃度依賴性,且當DHCL 濃度≥20 μmol/L 時,SGC-7901 細胞存活率明顯下降,提示DHCL 可以以濃度依賴性的方式抑制SGC-7901 細胞增殖。 本研究中,DHCL 40 μmol/L 組和DHCL 20 μmol/L 組細胞p62 蛋白表達低于DHCL 0 μmol/L 組,Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和ATG7蛋白表達和LC3 熒光斑點數高于DHCL 0 μmol/L組。 Beclin1 是一種自噬相關的抑癌基因,在自噬啟動階段發(fā)揮重要作用,在Bcl-2 等多種細胞因子作用下,可以與磷脂酞肌醇3 激酶結合,促進初期自噬吞噬小泡的形成[10]。 ATG7 具有泛素E1 樣酶活性,可以參與形成前自噬體結構,還可以活化LC3-I,并將其轉運至ATG3,催化形成LC3-II[11]。 LC3是一種自噬體標志蛋白,當細胞自噬發(fā)生時,LC3-I經過細胞內經泛素樣加工修飾,再與磷脂酞乙醇胺結合,可以形成LC3-II,其LC3-II/LC3-I 比值可以敏感反映細胞的自噬活性[12],提示DHCL 可以呈劑量依賴性的增強SGC-7901 細胞自噬活性。 p62 是自噬過程的特異性降解底物,當細胞發(fā)生自噬時,p62 可以結合泛素化蛋白,再與膜LC3-II 蛋白結合形成復合物,最終通過自噬溶酶體途徑降解,其表達水平與自噬活性呈反比[13]。 已有多項研究顯示[14-15],自噬參與了腫瘤形成和死亡的各個階段,早期自噬可以通過降解細胞內蛋白質和細胞器為腫瘤細胞提供能量資源,但持續(xù)增強的自噬可以抑制腫瘤細胞增殖,誘導細胞死亡,提示DHCL 可能通過增強SGC-7901 細胞自噬活性,發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究中,DHCL 40 μmol/L 組和DHCL 20 μmol/L 組細胞凋亡率高于DHCL 0 μmol/L 組,Bax/Bcl-2、 tBid/Bid、 cleaved Caspase-8/Caspase-8、cleaved Caspase-9/Caspase-9 和cleaved Caspase-3/Caspase-3 蛋白表達高于DHCL 0 μmol/L 組,且高劑量DHCL 誘導的細胞凋亡率略高于低劑量。 Bax/Bcl-2 是一組調控線粒體凋亡途徑的蛋白,生理狀態(tài)下,Bcl-2 位于線粒體膜表面,一旦細胞接收到凋亡信號刺激,細胞內的Bax 會轉位至膜上與Bcl-2 結合,破壞線粒體結構,導致線粒體細胞色素C 釋放入胞漿,激活Caspase 凋亡級聯(lián)反應[16]。 tBid/Bid是一組連接內源性和外源性凋亡途徑的凋亡蛋白。Caspase-8 主要調節(jié)外源性細胞凋亡途徑,Caspase-9主要介導內源性細胞凋亡途徑,均可以激活細胞凋亡效應蛋白Caspase-3 入核,降解細胞內的關鍵蛋白,誘導細胞凋亡[17]。 Huang 等[18]研究顯示,外源性凋亡途徑激活Caspase-8 后,活化的Caspase-8 可以促進Bid 剪切裂解為tBid,tBid 可以移位到線粒體中調節(jié)細胞色素C 釋放,參與線粒體途徑促進細胞凋亡,提示DHCL 可以以劑量依賴性的方式,調節(jié)細胞凋亡相關蛋白的表達,誘導胃癌細胞凋亡。

本研究中,DHCL 40 μmol/L 組和DHCL 20 μmol/L 組細胞SOD 和GSH-Px 水平低于DHCL 0 μmol/L 組,MDA 和ROS 水平高于DHCL 0 μmol/L組。 SOD 和GSH-Px 是細胞內重要的抗氧化酶,可以清除過多的ROS,維持細胞內氧化/抗氧化系統(tǒng)平衡[19]。 MDA 是脂質過氧化的中間產物,可以反映細胞內ROS 水平[20]。 ROS 是細胞內的一類具有高度氧化作用的小分子量物質,具有細胞毒性,可以破壞線粒體膜結構,激活Bax/Bcl-2 介導的線粒體凋亡途徑,誘導腫瘤細胞凋亡[21]。 已有大量研究顯示[22-23],線粒體內大量的ROS 還可以激活自噬,促進自噬活性,誘導Beclin1 表達,此外細胞內大量的ROS 還可以通過調節(jié)mTOR、MAPK 等信號通路表達,調節(jié)自噬過程,誘導腫瘤細胞的自噬性死亡。Cai 等[24]研究顯示,DHCL 可以增加ROS 的產生,破壞線粒體膜結構,誘導人慢性髓系白血病細胞凋亡和自噬,提示DHCL 可能通過促進SGC-7901 細胞氧化應激活性,誘導胃癌細胞自噬和凋亡。 本研究中,DHCL 組裸鼠移植瘤的質量低于對照組,提示DHCL 可以抑制胃癌移植瘤的生長,發(fā)揮抗腫瘤作用。 Chen 等[25]研究顯示,天然的生物活性化合物Celastrol 可以在體內外增加ROS 水平,導致癌細胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用。 Zhang 等[26]研究發(fā)現(xiàn),DHCL 可以誘導喉癌細胞凋亡,對人正常喉上皮細胞HBE 的毒性作用較小,且在裸鼠體內器官未見明顯毒性跡象。 結合本研究結果說明,DHCL 可能通過抗氧化作用,降低胃癌細胞ROS 水平,誘導胃癌細胞的凋亡,有望應用于臨床治療。

綜上所述,DHCL 可以呈劑量依賴性的抑制SGC-7901 細胞增殖,促進細胞內ROS 產生,誘導細胞自噬性死亡和凋亡,抑制胃癌移植瘤的生長,有望應用于臨床胃癌患者的治療。 然而本研究尚處于基礎研究階段,尚需大量的臨床試驗來驗證。