林曉靜,趙臻怡,陳舒雅,方 琴,王季石?

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,四川 南充 637000;2.貴州省血液病研究所,貴陽 550004;

3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院,貴陽 550004)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一類造血干/祖細(xì)胞惡性克隆性疾病,以血液和骨髓中髓系原始細(xì)胞的擴(kuò)增為特征[1]。 隨著化療及造血干細(xì)胞移植的進(jìn)展,顯著提高了AML 的治療效果,但成人AML 的生存率仍然很低,5 年無病生存率僅為20%~30%[2-4]。 而AML 的預(yù)后主要依賴于其細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的改變[5],因此尋找AML 標(biāo)志性分子學(xué)研究成為探索靶向治療的熱點(diǎn)之一。

血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是血紅素分解代謝過程中的限速酶,是機(jī)體重要的氧化調(diào)節(jié)酶之一。 正常生理?xiàng)l件下,HO-1 主要參與鐵的循環(huán)利用和維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。 在疾病或應(yīng)激條件下,HO-1 具有抗凋亡、促增殖及減輕炎癥反應(yīng)的作用[6-7]。 目前已經(jīng)明確HO-1 在多種實(shí)體腫瘤中異常高表達(dá),且與腫瘤發(fā)生及發(fā)展相關(guān)[7]。 在血液疾病腫瘤中,有研究證實(shí),與健康供者CD34+細(xì)胞相比,72%的AML 患者CD34+細(xì)胞中HO-1 的表達(dá)顯著升高。 亞組分析發(fā)現(xiàn)急性單核細(xì)胞白血病(acute monocytic leukemia,French-American-British classification M5)患者中HO-1 的表達(dá)水平更高,與正常人相比,其表達(dá)可增加8~10 倍[8]。 進(jìn)一步的研究顯示,在AML 患者中,HO-1 的表達(dá)與危險(xiǎn)分層呈正相關(guān),與生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[9]。 另外體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)下調(diào)HO-1 的表達(dá)能夠抑制AML 細(xì)胞株的增殖、促進(jìn)其凋亡,且能增強(qiáng)阿糖胞苷等化療藥物的敏感性[8,10-12]。 由此可見,HO-1 有望成為AML 的潛在治療靶點(diǎn)之一,尤其是M5 亞型,但針對(duì)這一亞型,目前尚缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

本研究擬通過慢病毒轉(zhuǎn)染沉默U937 細(xì)胞中HO-1 的表達(dá),建立M5 小鼠模型,探索沉默HO-1 的表達(dá)對(duì)M5 小鼠白血病疾病的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性NOD/SCID 小鼠40 只,體重18~20 g,6~8 周齡,購買于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2020-0004],飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房SPF 層流柜[SYXK(黔)2018-0001]。 含復(fù)合維生素B 的標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、飲水、墊料及一切與鼠接觸的物品經(jīng)滅菌處理,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度保持在25℃左右,相對(duì)濕度保持在40%~70%,每日光照12 h,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。 實(shí)驗(yàn)方案符合3R 原則并通過貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)(IACUC)審批(2015-046)。

1.1.2 細(xì)胞株

人AML 細(xì)胞株U937(急性單核細(xì)胞白血病,t(10;11)(p13;q14))購買于美國菌種保藏中心。 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素及100 mg/mL 鏈霉素的PRMI-1640 培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱,細(xì)胞懸浮生長(zhǎng),根據(jù)生長(zhǎng)情況每2~3 d 傳代一次。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco 公司);青霉素-鏈霉素雙抗、BCA 蛋白濃度試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)、anti-human CD13-PE、antihuman CD15-FITC、anti-human CD14-APC、antihuman CD64-FITC 及anti-human CD45-PE-CY(美國eBioscience);HO-1 與β-actin 抗體(美國Cell Signaling Technology 公司);CO2培養(yǎng)箱(美國Forma公司);流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter 公司,型號(hào)CytoFLEX);Western bot 電泳儀(美國BIO-RAD公司,型號(hào)164-5070)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 重組慢病毒的轉(zhuǎn)染

重組慢病毒包括沉默HO-1 表達(dá)的pRNAi-U6.2/Lenti-EGFP-siHO-1 和空載體pRNAi-U6.2/Lenti-EGFP 構(gòu)建及包裝由中國南通百奧邁科公司完成。 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2.5×105個(gè)/孔的密度接種于12 孔培養(yǎng)板中,以感染復(fù)數(shù)(MOI)為10 的標(biāo)準(zhǔn)加入慢病毒上清和聚凝胺(10 μg/mL)。37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h,用不含聚凝胺的完全培養(yǎng)基補(bǔ)液。 感染后的72 h,收集部分細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察綠色熒光。

1.3.2 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集不同處理組的U937 細(xì)胞,PBS 洗滌2 次,每106個(gè)細(xì)胞加100 μL 裂解液,冰上裂解30 min,12000 r/min 4℃離心10 min,取上清,BCA 法測(cè)定蛋白濃度,按照30 μg/20 μL 的體系加入蛋白及上樣緩沖液,沸水浴變性10 min。 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白,將分離的蛋白進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上后,5%脫脂奶粉封閉2 h。 然后孵育一抗2 h,回收一抗,TBST 洗滌3 次,每次10 min,室溫孵育二抗1 h,TBST 洗膜3 次。 將ECL 試劑盒中的A、B 液按照1 ∶1的比例進(jìn)行配制,均勻地侵潤(rùn)在PVDF 膜上,在顯影儀上顯影。

1.3.3 小鼠造模

NOD/SCID 小鼠隨機(jī)分4 組,每組10 只,將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同組U937 細(xì)胞(每只小鼠5×106個(gè)細(xì)胞)經(jīng)皮下注射到小鼠的腋下。 具體分組如下:空白組—皮下注射生理鹽水;U937 組—皮下注射U937 細(xì)胞;沉默HO-1 組—皮下注射轉(zhuǎn)染siHO-1慢病毒的U937 細(xì)胞;空載體組—皮下注射轉(zhuǎn)染空載體的U937 細(xì)胞。

1.3.4 小鼠腫瘤體積的測(cè)量

接種處理后,密切觀察并記錄小鼠皮下包塊體積的變化,如出現(xiàn)皮下包塊,采用游標(biāo)卡尺每5 d 檢測(cè)1 次,計(jì)算腫瘤體積,公式為:π/6 長(zhǎng)×寬2。

1.3.5 小鼠生存時(shí)間的記錄

記錄小鼠的死亡時(shí)間,采用Kaplan-Meier 繪制生存曲線。

1.3.6 小鼠外周血常規(guī)及血涂片檢測(cè)

分別于皮下注射前、注射后的第10、20、30、40、50 天經(jīng)尾靜脈取外周血約100 μL,收集于EDTA 抗凝管中,進(jìn)行血常規(guī)檢查計(jì)數(shù)白細(xì)胞、血紅蛋白含量和血小板。 另外,若發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞升高,取外周血行吉姆薩-瑞氏染色后,油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),并以空白組小鼠作對(duì)照。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937 細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞數(shù)至(0.5~1)×106/mL,加入人源單克隆抗體,避光15 min 后上機(jī)檢測(cè)。 另外將出現(xiàn)白細(xì)胞升高的實(shí)驗(yàn)組及同一時(shí)間段的空白組小鼠,經(jīng)過尾靜脈取外周血100 μL,并將上述小鼠各處死一只,取其肱骨樣本,收集用生理鹽水沖出的骨髓液50 μL。 細(xì)胞數(shù)調(diào)至(0.5 ~ 1) ×106/mL,各加入5 μL CD45-PE-CY、CD13-PE、CD14-APC、CD64-FITC,避光15 min 后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.8 病理組織學(xué)檢查

死亡或處死后的各組小鼠,取其皮下包塊,生理鹽水沖洗,在4%甲醛固定24 h,包埋在石蠟里面做成蠟塊,進(jìn)行切片、鋪片和烘片,后采用蘇木素-伊紅(HE)染色法染色,顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 23.0 軟件。 以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較,符合正態(tài)分布采用t檢驗(yàn),不符合采用非參數(shù)檢驗(yàn)。 Kaplan-Meier 繪制生存曲線,并采用log-rank test 分析結(jié)果。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染率及轉(zhuǎn)染效果

Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)U937 細(xì)胞中HO-1 在蛋白水平呈高表達(dá),故轉(zhuǎn)染慢病毒沉默HO-1 的表達(dá)。轉(zhuǎn)染72 h 后熒光顯微鏡觀察顯示U937 細(xì)胞的綠色熒光明顯增強(qiáng),陽性轉(zhuǎn)染率在95%以上(圖1)。 同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了siHO-1 慢病毒的U937 細(xì)胞中HO-1呈低表達(dá),而空載體組HO-1 的表達(dá)無明顯變化,從而提示轉(zhuǎn)染成功(圖2)。

圖1 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)染率Note. A, siHO-1 group. B, Vehicle group.Figure 1 Positivity of lentivirus transfections observed by fluorescence microscopy

圖2 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HO-1 的表達(dá)水平Figure 2 Expression of HO-1 after transfections was detected by Western blot

2.2 M5 小鼠模型的鑒定

與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)腋下包塊(圖3),并且白細(xì)胞數(shù)明顯升高(表1),同時(shí)外周血涂片查見白血病細(xì)胞(圖4)。 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)U937 細(xì)胞表達(dá)CD13、CD14、CD64,而與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓液中有一群細(xì)胞表達(dá)CD13、CD14、CD64(圖5)。 上述結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建了急性單核細(xì)胞白血病小鼠模型。

圖3 空白組及實(shí)驗(yàn)組腋下包塊的比較Note. A, Blank group. B, U937 group. C, siHO-1 group. D,Vehicle group.Figure 3 Comparison of axillary mass between blank group and experimental group

圖4 空白組及實(shí)驗(yàn)組外周血涂片(吉姆薩-瑞氏染色)Note. A, Blank group. B, U937 group. C, siHO-1 group. D,Vehicle group.Figure 4 Morphology of leukemia cells in the peripheral blood of blank group and experimental group(Wright Giemsa staining)

圖5 小鼠骨髓流式細(xì)胞圖Figure 5 Flow cytometric analysis of the mouse bone marrow cells

2.3 M5 小鼠模型的腫塊形成

沉默HO-1 組小鼠出現(xiàn)皮下腫塊所需的平均時(shí)間明顯長(zhǎng)于U937 組及空載體組(32.6±4.87 d vs 18.3±2.82 d vs 19.4±2.93 d)(圖6)。 在腫塊形成后的相同時(shí)間點(diǎn),與U937 組及空載體組相比,沉默HO-1 組小鼠的腫塊體積明顯縮小(圖7)。 形成腫塊后第20 天處死小鼠,病理結(jié)果證實(shí)U937 及空載組小鼠瘤組織重度生長(zhǎng),浸潤(rùn)周圍橫紋肌,橫紋肌重度變性、壞死,而沉默HO-1 組小鼠瘤組織中度生長(zhǎng),浸潤(rùn)周圍橫紋肌,橫紋肌中度變性、壞死(圖8)。

圖6 M5 小鼠模型成瘤的時(shí)間Figure 6 Tumor formation time in M5 xenograft mouse model

圖7 M5 小鼠模型成瘤后的腫瘤體積Note. Compared with the siHO-1 group, ?P<0.05.Figure 7 Tumor volume after tumor formation in M5 xenograft mouse models

圖8 M5 小鼠模型的皮下腫塊病理形態(tài)Note. A1, U937 group. A2, U937 group. B1, siHO-1 group. B2, siHO-1 group. C1, Vehicle group. C2, Vehicle group.Figure 8 Pathological morphology of subcutaneous mass in M5 xenograft mouse models

2.4 M5 小鼠模型的血細(xì)胞計(jì)數(shù)

與空白組相比,第30 天,U937 組及空載體組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高,且隨著時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)行性上升,而第50 天,才發(fā)現(xiàn)沉默HO-1 組小鼠白細(xì)胞數(shù)升高(表1)。 相反,第30 天,高表達(dá)HO-1 組小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)明顯下降,隨著時(shí)間延長(zhǎng),下降更明顯,而沉默HO-1 組卻第50 天才下降(表2)。 與空白組相比,第50 天,U937 組及空載體組小鼠外周血血紅蛋白的含量明顯下降,但沉默HO-1組血紅蛋白未見顯著變化(表3)。 U937 組及空載體組組間比較,白細(xì)胞數(shù)、血小板計(jì)數(shù)及血紅蛋白含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化(±s,×109/L,n=6)Table 1 Changes in peripheral blood white blood cell counts of mice in each group

表1 各組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化(±s,×109/L,n=6)Table 1 Changes in peripheral blood white blood cell counts of mice in each group

注:與空白組比較,?P<0.05,??P<0.001。Note. Compared with the blank group, ?P<0.05,??P<0.001.

組別Groups注射前Before第10 天10th day第20 天20th day第30 天30thday第40 天40th day第50 天50th day空白組Blank group 2.94±0.85 2.90±0.53 3.11±0.51 2.95±0.73 3.15±0.61 3.04±0.47 U937 組U937 group 3.07±0.63 2.94±0.55 3.32±0.41 4.56±0.53? 9.12±1.09?? 14.31±2.27??沉默HO-1 組siHO-1 group 2.80±0.68 2.98±0.57 2.95±0.79 3.01±0.62 3.09±0.68 4.24±0.71?空載體組Vehicle group 2.91±0.73 3.06±0.69 2.93±0.73 4.15±0.58? 9.51±1.51?? 15.75±1.55??

表2 各組小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)的變化(±s,×109/L,n=6)Table 2 Changes of peripheral blood platelets counts in each group

表2 各組小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)的變化(±s,×109/L,n=6)Table 2 Changes of peripheral blood platelets counts in each group

注:與空白組比較,?P<0.05,??P<0.001。Note. Compared with the blank group, ?P<0.05,??P<0.001.

組別Groups注射前Before第10 天10th day第20 天20th day第30 天30thday第40 天40th day第50 天50th day空白組Blank group 509.50±93.65 521.23±69.81 508.34±62.44 514.51±93.14 503.50±76.85 517.17±69.75 U937 組U937 group 504.67±73.71 512.83±78.65 518.68±85.67 333.76±74.15? 289.83±57.76? 181.17±55.15??沉默HO-1 組siHO-1 group 511.83±73.90 505.01±63.12 499.00±74.09 501.83±60.84 496.10±79.22 376.67±68.38?空載體組Vehicle group 499.67±70.14 515.33±88.98 495.67±50.84 378.35±67.75? 310.41±49.30? 173.03±58.59??

表3 各組小鼠外周血血紅蛋白的變化(±s,g/L,n=6)Table 3 Changes of peripheral blood hemoglobin in each group

表3 各組小鼠外周血血紅蛋白的變化(±s,g/L,n=6)Table 3 Changes of peripheral blood hemoglobin in each group

注:與空白組比較,?P<0.05。Note. Compared with the blank group, ?P<0.05.

組別Groups注射前Before第10 天10th day第20 天20th day第30 天30thday第40 天40th day第50 天50th day空白組Blank group 143.16±13.75 145.96±16.08 139.35±18.98 150.87±19.61 136.48±13.41 140.20±15.29 U937 組U937 group 141.40±16.55 150.84±19.29 143.06±19.45 139.14±17.27 123.86±16.13 112.56±14.89?沉默HO-1 組siHO-1 group 140.10±22.20 146.32±18.70 149.28±16.50 142.94±20.67 133.85±18.75 127.44±19.30空載體組Vehicle group 145.40±19.61 149.54±22.73 143.25±19.85 131.64±18.42 127.38±14.39 120.39±18.60?

2.5 M5 小鼠模型的生存情況

成瘤后的小鼠逐漸出現(xiàn)翹毛、弓背、萎靡少動(dòng)等表現(xiàn),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、瀕死。 與U937 組及空載體組相比,沉默HO-1 組小鼠的生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P= 0.004),但U937 組與空載體組相比,兩組模型小鼠的生存時(shí)間差異無顯著學(xué)意義(P= 0.1836)(圖9)。

圖9 各組小鼠的生存曲線Figure 9 Survival curves of mice in each group

3 討論

先前的研究表明HO-1 在M5 患者中的表達(dá)水平更高[8-9],且我們課題組前期已經(jīng)證實(shí)M5 細(xì)胞株U937 及THP-1 中HO-1 在mRNA 及蛋白水平的表達(dá)均顯著高于Kasumi-1、HL-60 及NB4 等其它AML亞型的細(xì)胞株[8,13]。 在體外實(shí)驗(yàn)中,已經(jīng)證實(shí)HO-1能夠抑制U937 細(xì)胞的凋亡及促進(jìn)其增殖,且與化療藥物耐藥有關(guān)[8,12]。 但由于體內(nèi)受細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等微環(huán)境的影響,HO-1 是否影響M5 疾病的進(jìn)展,這就需要建立動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證。 故本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染U937 細(xì)胞株沉默HO-1 的表達(dá),并采用不同處理組的U937 細(xì)胞皮下注射至NOD/SCID 小鼠的腋下,建立M5 小鼠模型,進(jìn)一步探索沉默HO-1 的表達(dá)對(duì)M5 小鼠模型白血病疾病的影響。

目前國內(nèi)大多采用SCID 及NOD/SCID 小鼠建立動(dòng)物腫瘤模型[14-15],本實(shí)驗(yàn)使用NOD/SCID 小鼠進(jìn)行造模,不但發(fā)現(xiàn)接種U937 細(xì)胞的NOD/SCID小鼠成瘤率為100%,而且外周血查見白血病細(xì)胞,同時(shí)小鼠骨髓液中發(fā)現(xiàn)一群異常細(xì)胞,其抗原表達(dá)與U937 細(xì)胞相似,證實(shí)M5 小鼠模型構(gòu)建成功,這與之前的報(bào)道一致[16]。 NOD/SCID 小鼠成瘤率高,小鼠的發(fā)病率穩(wěn)定,是因?yàn)樵撔∈蠹缺Ａ袅薙CID小鼠T、B 淋巴細(xì)胞功能缺陷的特點(diǎn),同時(shí)還具有NK 細(xì)胞活性很低、無循環(huán)補(bǔ)體、巨噬細(xì)胞和APC 細(xì)胞功能損害的特性,而且這種小鼠很少出現(xiàn)淋巴細(xì)胞免疫功能恢復(fù)[17-19]。

與U937 及空載體組,也就是高表達(dá)HO-1 組相比,沉默HO-1 組的M5 小鼠模型出現(xiàn)皮下腫瘤所需時(shí)間明顯延長(zhǎng)、腫瘤生長(zhǎng)較緩慢、腫瘤體積較小、腫瘤對(duì)周圍組織的浸潤(rùn)程度較輕、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高及血小板下降的速度更慢,且小鼠的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng),這些數(shù)據(jù)表明沉默HO-1 可抑制M5 小鼠模型白血病的進(jìn)展,進(jìn)一步證實(shí)了HO-1 在AML 中體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[8,13],HO-1 有望成為M5 的潛在治療靶點(diǎn)之一。 HO-1 藥物抑制劑的研發(fā)早已成為了熱點(diǎn),其中鋅原卟啉-IX(Zinc protoporphyrin-IX,ZnPPIX)的有效性已經(jīng)在動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證,如能顯著抑制肝癌大鼠模型、肉瘤及肺癌小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)[20-21]。 由于ZnPPIX 不能被生理鹽水溶解,這就需要研發(fā)新的水溶性HO-1 抑制劑,如聚乙二醇-共軛ZnPPIX(Polyethyleneglycol-conjugated ZnPPIX,PEG ZnPPIX)。 PEG-ZnPPIX 的血藥濃度約為非聚乙二醇化ZnPPIX 的40 倍,更重要的是,它選擇性地抑制腫瘤中HO-1 的活性[22]。 更加鼓舞人心的是發(fā)現(xiàn)PEG-ZnPPIX 可以抑制CD34+AML 祖細(xì)胞的增殖,并在小鼠模型中得到證實(shí)[23]。 由此可見,HO-1 抑制劑有望運(yùn)用于AML 患者中,尤其是M5 這一亞型中。

U937 細(xì)胞僅是M5 細(xì)胞株的一種,并不能完全代表M5 疾病的發(fā)展,這就需要采用多種細(xì)胞株建立小鼠模型驗(yàn)證,最好建立人源腫瘤異種移植模型(Patient-Derived tumor Xenograft,PDX)[24],此為本研究的不足之處,擬下一步構(gòu)建PDX 模型進(jìn)一步驗(yàn)證,并進(jìn)行機(jī)制研究。

綜上所述,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)HO-1 的高表達(dá)加速了M5 小鼠模型的白血病進(jìn)展,相反沉默HO-1 的表達(dá)可減緩白血病疾病的進(jìn)展,進(jìn)一步為M5 靶向治療提供了一定的理論依據(jù)。