劉 波,苗佳寧,張斯萌,李志杰?

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心,沈陽 110004;2.遼寧省環(huán)境與代謝疾病動物模型研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽 110004)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma,NB)是兒童常見的一種交感神經(jīng)系統(tǒng)的惡性胚源性腫瘤,其起源于神經(jīng)嵴,惡性度極高,預(yù)后極差,但具有自行消退和體外誘導(dǎo)分化成熟的特點(diǎn)[1-2]。 如何治愈NB 是目前腫瘤界研究的焦點(diǎn)問題,而動物模型是腫瘤疾病臨床前研究的重要組成部分,其中小鼠移植瘤模型可模擬人腫瘤自然生長過程,是目前主流的研究NB的動物模型。 移植瘤模型可分為異位移植和原位移植模型,約60%的NB 原發(fā)于腹膜后,來源于腎上腺髓質(zhì)或交感神經(jīng)節(jié),因此異位移植瘤模型并不能完全模擬NB 的生物學(xué)行為,而原位移植瘤模型在生物學(xué)特性上更貼近臨床實(shí)際[3-4]。 本文旨在研究腎上腺原位移植NB 動物模型的造模方法及特點(diǎn),對進(jìn)一步研究NB 發(fā)生、發(fā)展及治療奠定了良好的科研基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物選用SPF 級SCID-Beige 免疫缺陷小鼠,雌性,5 周齡,體重14~16 g,30 只購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]。 無菌手術(shù)在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心動物實(shí)驗(yàn)室屏障動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK(遼)2017-0004],本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研與新技術(shù)倫理委員會批準(zhǔn)(2014PS48K),并按動物實(shí)驗(yàn)使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 細(xì)胞

應(yīng)用神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-BE2(BE2)細(xì)胞系進(jìn)行造模(BE2 細(xì)胞系由美國國立衛(wèi)生研究院-國家癌癥研究所-分子細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)室Dr.Carol.J.Thiele博士惠贈)。 用含10%胎牛血清、2 mmol/L 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液,培養(yǎng)于37℃、5% CO2的孵箱內(nèi),2~3 d 傳代一次,取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)[5]。

1.2 主要試劑與儀器

10%胎牛血清、2 mmol/L 谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液(以色列BI 公司);體式顯微鏡(寧波永新光學(xué)股份有限公司, 型號:NSZ-608T);小動物呼吸麻醉機(jī)(美國MATRX, 型號:MODLE3000)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 注射細(xì)胞準(zhǔn)備

腫瘤細(xì)胞接種實(shí)驗(yàn)當(dāng)天將BE2 細(xì)胞用胰酶消化后,按照PBS ∶基質(zhì)膠=1 ∶1的比例稀釋BE2 細(xì)胞,制成2×106/50 μL 的細(xì)胞懸液用于腫瘤細(xì)胞接種。

1.3.2 NB 細(xì)胞接種

30 只SCID-Beige 小鼠隨機(jī)分為兩組,A 組為皮下異位移植組,B 組為腎上腺原位移植組,皮下異位移植瘤組9 只,原位移植瘤組21 只,標(biāo)記編號并稱量體重。 A 組動物在無菌條件下,將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液抽取50 μL 經(jīng)皮下注射到小鼠右側(cè)腋下位置,注射完畢后放回飼養(yǎng)籠內(nèi)正常飼養(yǎng)。 B 組動物氣體誘導(dǎo)麻醉后,小鼠右側(cè)下肋部及上腹部備皮消毒,開腹后暴露右側(cè)腎上腺及周圍脂肪層,將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液抽取50 μL,體式顯微鏡下注射到腎上腺周圍脂肪層內(nèi),關(guān)腹,免拆縫合線縫合并消毒創(chuàng)口,待小鼠蘇醒后放回飼養(yǎng)籠內(nèi)正常飼養(yǎng)[6-8]。

1.3.3 術(shù)后觀察

BE2 腫瘤細(xì)胞接種后第2 天開始每天記錄小鼠體重變化。 接種腫瘤細(xì)胞后第14、21、28 天比較A、B 兩組成瘤情況及腫瘤大小。 腫瘤大小測量:記錄腫瘤最長徑a 和最短徑b,采用公式V=a×b2/2 計算腫瘤體積,皮下異位移植瘤腫瘤大小每周測量3 次,腎上腺原位移植瘤腫瘤大小測量取材后腫瘤組織大小。 組織形態(tài)學(xué)檢查:A 組取完整腫瘤標(biāo)本、B 組將腫瘤、左腎及腎周脂肪一并取出,于4%多聚甲醛內(nèi)固定,行HE 染色,觀察鏡下病理改變[9]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用軟件GraphPad Prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計分析。 計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間均數(shù)比較使用t檢驗(yàn);成瘤率采用Fisher 檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)母細(xì)胞瘤腎上腺原位移植模型建立

無菌條件下使用異氟烷,通過小動物呼吸麻醉機(jī)誘導(dǎo)麻醉并將流量控制在氧氣流量200 mL/min,異氟烷濃度3%持續(xù)麻醉,常規(guī)備皮消毒后的左側(cè)上腹部隱約可見小鼠脾位置,在脾尾端及肋緣下部交界處橫向行0.5~1 cm 切口并逐層切開至腹腔,鏡下用無損顯微鑷輕柔的將脾撥向頭側(cè)并在皮層擠壓下固定脾,暴露手術(shù)所需視野,此時可見脾覆蓋下的左側(cè)腎上級部分,用無菌棉簽將腎輕柔向小鼠尾側(cè)撥動,此時將暴露腎上腺及周圍脂肪層,將準(zhǔn)備好的NB 細(xì)胞懸液50 μL 抽入針尖型號為28 G的注射器內(nèi),鏡下左手用棉簽固定腎上腺脂肪位置,右手持注射器,在腎上腺周圍脂肪處盡量平行進(jìn)針,注意針尖不可觸碰到腎上腺,針尖不可穿透脂肪層,確定針尖斜面全部進(jìn)入脂肪層后緩慢注射細(xì)胞懸液,注射后可見脂肪層快速形成丘狀隆起,確認(rèn)細(xì)胞懸液全部注射入脂肪層后快速拔出注射器的同時左手棉簽抵住入針位置1~2 min 避免漏液。 而后恢復(fù)脾位置,逐層縫合肌肉層及皮層,縫合處消毒并停止異氟烷麻醉,待小鼠蘇醒后放回飼養(yǎng)籠內(nèi)正常飼養(yǎng)[10-13]。 (圖1)

圖1 神經(jīng)母細(xì)胞瘤腎上腺原位移植動物模型的制作Note. A, Fix the mouse supine and prepare the skin for the operation. B, Make the incision on the skin. C, Expose the left adrenal gland and the surrounding fat pad. D, Stab into the fat pad. E,Inject the neuroblastoma cells. F,Appearance after injection finished.Figure 1 Establishment of the orthotopic neuroblastom xenograft model

2.2 腎上腺原位移植瘤與皮下異位移植瘤組間成瘤情況比較

在接種相同數(shù)量腫瘤細(xì)胞的情況下,分別在14、21、28 d 比較兩組小鼠的成瘤率(表1)、平均腫瘤體積(表2)及腫瘤生長情況(圖2)。 如表1 所示,接種相同數(shù)量腫瘤細(xì)胞后,原位移植瘤與皮下異位移植瘤成瘤率相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.0114)。 結(jié)果提示,原位移植瘤的成瘤率高,且成瘤明顯早于皮下異位移植瘤。 28 d 內(nèi)動態(tài)觀察并記錄腫瘤大小。 皮下異位移植瘤組共9 只小鼠,分別在14、21、28 d 時測量腫瘤大小;腎上腺原位移植瘤組共21 只小鼠,分別在14、21、28 d 各處死7 只,取出腫瘤組織測量腫瘤大小。 如表2 所示,與皮下移植瘤相比,原位移植瘤生長速度更快,腫瘤體積更大,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(14 d 時P<0.05,21 d及28 d 時P<0.001)。

圖2 兩種不同成瘤方式腫瘤生長情況Note. A, Tumor formed by ectopic xenograft. B,Tumor formed in situ by ectopic xenograft. C,High magnification for the tumor formed by ectopic xenograft. D, Tumor formed by orthotopic xenograft, with reference to the bilateral adrenal glands. E, Tumor formed in situ by orthotopic xenograft, the arrow pointed to the position of the tumor formed. F, High magnification for the tumor formed by ectopic xenograft.Figure 2 Situation of tumor growing by the orthotopic xenograft and ectopic xenograft

表1 皮下異位移植瘤組和腎上腺原位移植瘤組接種腫瘤細(xì)胞后各時間點(diǎn)的成瘤率比較(%)Table 1 Tumor formation rate by the orthotopic xenograft and ectopic xenograft at the different time points

表2 皮下異位移植瘤組和腎上腺原位移植瘤組腫瘤細(xì)胞接種后不同時間點(diǎn)腫瘤體積比較Table 2 Volume of tumor formed by the orthotopic xenograft and ectopic xenograft at the different time points

2.3 兩種不同成瘤方式腫瘤組織病理特點(diǎn)

與皮下異位移植瘤相比,接種細(xì)胞后相同時間點(diǎn)的腎上腺原位移植瘤的腫瘤體積更大(圖3A、3D)。HE 染色可見,原位移植瘤的腫瘤細(xì)胞相比與皮下異位移植瘤腫瘤細(xì)胞略顯致密,細(xì)胞分布更均勻(圖3B、3E)。 原位移植瘤腫瘤細(xì)胞的形態(tài)與皮下異位移植瘤腫瘤細(xì)胞形態(tài)相同,呈均質(zhì)藍(lán)染(圖3C、3F)。

圖3 兩組不同成瘤方式腫瘤組織形態(tài)及組織學(xué)形態(tài)照片Note. A, Gross appearance of the tumors formed by the ectopic xenograft. B, HE staining of the tumors formed by the ectopic xenograft. C, HE staining of the tumors formed by the ectopic xenograft. D,gross appearance of the tumors formed by the orthotopic xenograft. E,HE staining of the tumors formed by the orthotopic xenograft. F, HE staining of the tumors formed by the orthotopic xenograft.Figure 3 Gross appearance and the histology of the tumors formed by the orthotopic xenograft and ectopic xenograft

3 討論

NB 是一種起源于神經(jīng)嵴的兒童顱外惡性實(shí)體腫瘤,大部分發(fā)生于腹部,最常見于腎上腺,也可發(fā)生于交感神經(jīng)系統(tǒng)存在的任何部位,包括脊柱旁的交感神經(jīng)節(jié),是兒童腫瘤死亡的最主要原因之一。高危的NB 細(xì)胞具有高致瘤性和侵襲性,早期轉(zhuǎn)移多,約60%~70%的病例發(fā)生轉(zhuǎn)移,成為神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的主要死因[3,6,14]。 因此,NB 的動物模型制備對研究NB 的發(fā)生、發(fā)展及治療奠定了良好的科研基礎(chǔ),NB 動物移植瘤模型是NB 研究不可或缺的工具。 NB 皮下異位移植瘤動物模型因其操作簡單易行,廣泛用于NB 的研究,但有其局限性,臨床中約有60%的NB 原發(fā)于腹膜后,來源于腎上腺髓質(zhì)或交感神經(jīng)節(jié),原位移植瘤動物模型的生物學(xué)特性更貼近臨床實(shí)際[15]。 目前腎上腺原位移植瘤模型越來越多地成為主流的NB 移植瘤形式,但未見詳細(xì)的操作流程作為方法學(xué)方面的指導(dǎo),常規(guī)建立標(biāo)準(zhǔn)的NB 移植瘤模型較為困難。 本文詳細(xì)介紹了NB 腎上腺原位移植瘤動物模型的造模方法,為今后更加準(zhǔn)確、高效的復(fù)制此動物模型提供細(xì)致和標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)方案。 對未來進(jìn)一步研究NB 發(fā)生、發(fā)展及治療提供了科學(xué)的研究工具。

我們在本研究中發(fā)現(xiàn),與皮下異位移植瘤模型相比,腎上腺原位移植模型成瘤速度快、細(xì)胞需求量小、腫瘤體積大的優(yōu)點(diǎn)。 更符合臨床患兒體內(nèi)NB生長的特點(diǎn),我們在本研究中觀察到小鼠腎上腺原位移植腫瘤局限于特定位置而且在短期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移形成,更符合NB 在人體內(nèi)的生長特點(diǎn),是研究NB 的理想動物模型。 相較于皮下異位移植瘤模型,原位移植瘤模型成瘤率更高,各時間點(diǎn)成瘤率均為100%,腫瘤生長速度快、實(shí)驗(yàn)周期短,在實(shí)驗(yàn)研究中優(yōu)于皮下異位移植瘤模型[16-17]。

腎上腺原位移植造模方式可行性強(qiáng),在模型建立過程中需注意:(1)麻醉方式最好選擇氣體麻醉,本實(shí)驗(yàn)在擁有一定操作熟練度的情況下,每只鼠需要麻醉時間短,常規(guī)麻醉小鼠蘇醒慢、對機(jī)體影響較大,氣體麻醉是目前對于短時間麻醉和反復(fù)多次麻醉時首選的麻醉方式。 (2)原位移植時需要注意對脾和腎的保護(hù),由于脾與腎均為質(zhì)地較脆的實(shí)質(zhì)性器官,不當(dāng)?shù)牟僮鲿ζ湓斐蓳p傷,影響小鼠術(shù)后狀態(tài)甚至成活率。 盡量使用棉簽一類的柔性物體來觸碰。 (3)保護(hù)腎上腺,注射細(xì)胞時針尖位置要確保不會碰到腎上腺實(shí)質(zhì),以免造成小鼠術(shù)中死亡。 (4)防止腫瘤細(xì)胞漏液,在脂肪層注射細(xì)胞時要做到進(jìn)針既穩(wěn)又準(zhǔn),注射器針尖不能刺穿脂肪層,盡量使針尖前端多進(jìn)入脂肪層一段距離,注射時注射位置要能看到皮丘狀隆起,拔針的同時要迅速用棉簽抵住針眼防止漏液。 (5)術(shù)后要勤觀察小鼠狀態(tài),原位移植后腫瘤發(fā)展迅速,對小鼠生理狀態(tài)影響極大,每天稱量體重,觀察毛色等外觀變化。

本研究聚焦NB 原位移植瘤模型造模方法,為準(zhǔn)確高效地復(fù)制該動物模型提供一種標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)方案,為NB 的研究奠定了良好的科研基礎(chǔ)。