胡善國，劉亞芹，王輝，周漢琛，雷攀登，杜志遠(yuǎn)，黃建琴，王海燕，朱紅閨

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，安徽黃山245000；2.黃山市松蘿茶業(yè)專業(yè)合作社，安徽休寧245400）

氨基酸（Amino acids，AAs）是茶鮮葉和成品茶中的重要生化成分，其含量與滋味密切相關(guān)。茶葉中氨基酸主要以兩種形態(tài)存在，一種是游離態(tài)，另一種是結(jié)合態(tài)，即結(jié)合在蛋白質(zhì)中的氨基酸。茶葉水浸出物中呈游離狀態(tài)且具有α-氨基的氨基酸，均稱為游離氨基酸（Free amino acids，F(xiàn)AAs）。茶葉中游離氨基酸雖僅占干物質(zhì)的1%～4%[1-2]，卻是影響茶葉品質(zhì)的重要物質(zhì)，是茶葉鮮爽味和香氣的主要組分。

鮮葉攤放是綠茶加工過程中重要的前處理工序，已在名優(yōu)綠茶制作中廣泛應(yīng)用。目前普遍認(rèn)為，攤放可促進茶鮮葉的化學(xué)變化，酶系活力增強，淀粉、多糖、蛋白質(zhì)和果膠類等物質(zhì)水解生成可溶性糖和氨基酸等簡單物質(zhì)，有利于提高茶湯滋味和香氣品質(zhì)[3-7]。控制好鮮葉攤放環(huán)境是提高茶葉品質(zhì)的關(guān)鍵，溫（濕）度是攤放環(huán)境的重要影響因子，攤放環(huán)境溫（濕）度不同會對茶鮮葉化學(xué)成分的變化產(chǎn)生影響。楊健[8]進行的鄂茶10號茶鮮葉攤放預(yù)試驗的結(jié)果表明，溫度15℃、濕度70%是采后茶鮮葉理想的貯青條件；尹軍峰等[9]研究發(fā)現(xiàn)相對低溫（20℃）高濕（90%）環(huán)境條件下，攤放茶鮮葉中咖啡堿、氨基酸、可溶性總糖含量等都有較大的增加；張應(yīng)根等[10]為改進白茶萎凋工藝，以福鼎大白毫茶鮮葉為原料，研究不同溫、濕度環(huán)境對白茶品質(zhì)的影響，認(rèn)為在高溫（35℃）高濕（85%）條件下氨基酸、咖啡堿含量增加；葉玉龍[11]通過不同攤放溫度對福鼎大白茶鮮葉主要化學(xué)成分的影響進行分析研究，結(jié)果表明茶氨酸（Thea）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）是四種主要氨基酸，在攤放過程中其含量總是高于其他氨基酸；虞昕磊[12]研究不同攤放處理對非揮發(fā)性成分的代謝以及綠茶滋味品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)低溫環(huán)境下脯氨酸和苯丙氨酸的積累量更高，氨基酸總量增多。大量試驗研究[13-17]為名優(yōu)茶的攤放提供一定的理論依據(jù)，然而目前對同一環(huán)境濕度下不同攤放溫度條件對茶鮮葉氨基酸變化的影響研究較少。

“鳧早2號”是安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所于1980～1989年選育的國家級茶樹良種，具有發(fā)芽早、適制綠茶、春茶干樣氨基酸含量高（4.7%）等特點[18]，是黃山地區(qū)名優(yōu)綠茶的重要鮮葉來源。名優(yōu)綠茶中游離氨基酸是影響茶湯鮮爽、潤度及香氣、色澤的重要品質(zhì)指標(biāo)[19]，同時也是名優(yōu)綠茶中的重要功能成分。研究以鳧早2號茶樹品種茶鮮葉為原料，利用智能人工氣候箱設(shè)定攤放環(huán)境溫度條件，系統(tǒng)研究不同攤放處理對茶鮮葉游離氨基酸組分含量的影響。研究結(jié)果對完善名優(yōu)綠茶設(shè)施攤放技術(shù)和提高名優(yōu)綠茶品質(zhì)都具有重要的理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試茶鮮葉采自安徽省農(nóng)科院茶葉研究所品種園內(nèi)6年生茶樹品種“鳧早2號”，采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽一葉、一芽二葉。采摘于2021年4月中上旬，晴天采摘，溫度20℃，濕度78%。茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品購自北京百靈威科技有限公司；35種游離氨基酸分析標(biāo)準(zhǔn)品為德國Sykam公司產(chǎn)品。

PRX-450D人工氣候箱（寧波賽福實驗儀器有限公司）；MA-150C紅外水份測定儀（德國賽多利斯公司）；M1-211A微波爐（美的集團）；6CH-941茶葉烘焙機（浙江上洋機械股份有限公司）；FZ102植物樣品粉碎機 （天津泰斯特公司）；ME104電子分析天平（梅特勒－托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司）；HWS-24電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；S433D氨基酸自動分析儀（德國Sykam公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制作

供試鮮葉材料采回后，均勻分成4組，1組不攤放，立即取100 g鮮葉用微波固樣（方法同下），其余3組進行攤放處理，按2.5～3 cm厚度均勻攤放于人工氣候箱中。分別設(shè)置15℃、18℃與21℃3個溫度水平和78%環(huán)境濕度水平。每隔一定時間取鮮葉用水份快速測定儀測定，直至攤放葉含水率70%左右，取100 g攤放葉，采用微波固樣法[20]，在1200 W的功率下3 min終止物質(zhì)代謝，攤涼后，再于80℃條件下烘干60 min。磨樣過篩（40目）后-20℃儲存?zhèn)溆?。不攤放?5℃攤放、18℃攤放、21℃攤放處理組分別命名為NTS、LTS、MTS和HTS，如表1所示。

表1 樣品設(shè)置Table 1 Sample setup

1.2.2 茶樣審評

由茶葉審評專家對茶樣進行密碼審評，對樣品各項指標(biāo)評分計算出總分。

1.2.3 游離氨基酸含量測定

上機樣品制備：準(zhǔn)確稱取0.25 g茶樣，加7mL沸水，90℃水浴10 min，重復(fù)3次，冷卻后過濾茶湯，定容至25 mL，搖勻。取上述提取液500 μL，樣品稀釋液1500μL，搖勻后過0.45μm水系膜，待測。測定條件[21]：色譜柱為LCA K07/Li，柱溫為38～74℃梯度升溫；流動相A為pH 2.9檸檬酸鋰溶液，流動相B為pH 4.2檸檬酸鋰溶液，流動相C為pH 8.0檸檬酸鋰溶液；洗脫泵流速為0.45 mL/min，衍生泵流速為0.25 mL/min，進樣體積為50μL。以標(biāo)準(zhǔn)品響應(yīng)面積、含量計算樣品游離氨基酸含量[22]。每個樣品平行測定3次。

1.2.4 滋味活性值分析

滋味活性值（taste active value，TAV）是樣品中呈味物質(zhì)的測定值與其滋味閾值之比，計算公式如下[23]：

式中：ρ1為呈味氨基酸的質(zhì)量濃度，mg/g；ρ2為該氨基酸滋味閾值質(zhì)量濃度，mg/g。

TAV可反映單一化合物對整體滋味的貢獻大小，當(dāng)TAV＞1時，認(rèn)為該物質(zhì)對呈味有貢獻，而TAV＜1時，認(rèn)為該物質(zhì)對呈味貢獻較小，由此確定攤放葉主要的呈味氨基酸[24-25]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel 2016進行描述性分析，SPSS 20進行差異顯著性檢驗（LSD法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同攤放溫度茶鮮葉含水率的變化及待測樣品篩選

如圖1所示，攤放過程中，茶鮮葉含水率從77.21%降到67.54%，隨著攤放溫度的遞增，攤放鮮葉平均失水速率呈升高的趨勢，表明攤放環(huán)境溫度越高，茶鮮葉的失水速率越大[26]。從圖中可以看出，茶鮮葉在整個攤放過程中的失水速率均可分為兩個階段，即攤放前期（0～1.5 h）和攤放后期（1.5～8 h）。攤放前期，茶鮮葉的失水速率均明顯快于攤放后期，平均失水速率高達2.50%，表明前期水分散失比較劇烈[27]。攤放后期，隨著攤放時間的推移，3個攤放樣品組失水速率存在不同的變化趨勢，當(dāng)鮮葉含水率降到70%以下時，失水速率又有所加快。依據(jù)最佳含水率70%的公認(rèn)攤放程度標(biāo)準(zhǔn)[28]，故篩選6 h（21℃）、7 h（18℃）、8 h（15℃）樣品用于游離氨基酸組分含量檢測，樣品設(shè)置如表1所示。

圖1攤放過程茶鮮葉含水率的變化Fig.1 Changes of moisture content in fresh tea leaves during spreading

2.2 茶鮮葉游離氨基酸組分含量的比較

不同攤放處理茶鮮葉游離氨基酸組分含量如表2所示，4種“鳧早2號”鮮葉樣品檢測出的游離氨基酸種類存在較大差異，攤放處理組共分離得到16種游離氨基酸，不攤放處理組僅測得12種游離氨基酸，纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸以及酪氨酸均未檢出。分析原因在于攤放促使葉細(xì)胞組織脫水，細(xì)胞液濃縮，酶活增強，一些貯藏物質(zhì)如淀粉、多糖、蛋白質(zhì)類物質(zhì)開始水解生成氨基酸等簡單物質(zhì)[29]。4種攤放鮮葉樣品中，除茶氨酸外，其他氨基酸均屬于蛋白質(zhì)氨基酸。攤放樣總游離氨基酸含量相較于不攤放樣顯著（p＜0.05）增加，各樣本依次為LTS（39.45±0.79 mg/g）＞HTS（38.09±0.43mg/g）＞MTS（35.18±0.23 mg/g）＞NTS（32.59±0.60 mg/g）。

表2 不同攤放處理茶鮮葉游離氨基酸組分含量表Table 2 Content of amino acid components in fresh tea leaves under different spreading treatments

4種不同攤放處理樣品中，含量最高的均為茶氨酸，茶氨酸是茶葉中游離氨基酸的主體部分，對茶葉品質(zhì)有極顯著影響[30]。在研究中，茶氨酸占氨基酸總量的76.62%～83.54%，其次是谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、絲氨酸含量較高，比例占到14.17%～16.16%。含量較少的為甘氨酸、組氨酸、纈氨酸、脯氨酸。

攤放處理組相較于不攤放處理組，茶氨酸含量呈明顯（p＜0.05）增加的趨勢，該結(jié)果與王云等[31]進行的名優(yōu)綠茶鮮葉攤放試驗結(jié)果相似，且增幅大小依次為NTS＜MTS＜HTS＜LTS，這可能是因為濕度（78%）恒定的黑暗環(huán)境對茶氨酸降解有一定的抑制作用；谷氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸和脯氨酸的含量在攤放后也均呈上升趨勢；相反，天冬氨酸的含量呈下降趨勢，樣品HTS的降幅最大。

在攤放處理組間，隨著攤放溫度的增加，氨基酸各組分含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢，天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸和組氨酸的含量均持續(xù)減少，精氨酸的含量保持增大，其余組分含量均為波動狀態(tài)。

總體而言，相較于不攤放處理，攤放處理下除天冬氨酸外，各游離氨基酸的含量均有不同程度的增加。攤放處理組間，較低溫（15℃）條件下，茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、組氨酸以及總游離氨基酸的保留量相對較高，可能由于在相對低溫高濕的攤放環(huán)境，采后茶鮮葉的失水速度變慢，延長了有機體內(nèi)的酶促反應(yīng)時間，使得蛋白質(zhì)的水解更充分。

2.3 不同攤放處理對茶鮮葉呈味氨基酸的影響

游離氨基酸是食品中的主要基礎(chǔ)呈味物質(zhì)之一，根據(jù)游離氨基酸滋味特征，可將其分為鮮味氨基酸（Asp、Glu、The）、甜味氨基酸（Thr、Ser、Gly、Ala、His、Pro）、 苦 味 氨 基 酸（Val、Ile、Leu、Arg）和芳香族氨基酸（Tyr、Phe、Lys、Cys）四大類[32-33]。茶湯中的滋味是由不同呈味游離氨基酸之間的平衡及相互影響決定的，對綠茶風(fēng)味具有重要作用。

對“鳧早2號”茶樹鮮葉在不同攤放處理條件下的4組樣品FAAs的滋味活性值進行了分析，結(jié)果見表3。從呈味氨基酸比較來看，鮮味氨基酸含量較高，苦味氨基酸其次，甜味氨基酸和芳香族氨基酸相當(dāng)，主要呈味氨基酸為谷氨酸、茶氨酸、天冬氨酸以及精氨酸。谷氨酸和天冬氨酸是鮮味的基本組成成分，谷氨酸的鮮味最強，呈味閾值為0.3 mg/mL，它是味精中的主要成分，能呈現(xiàn)出較強的鮮味[37]。攤放組樣品的不同類呈味氨基酸總含量均顯著高于不攤放組樣品，15℃攤放處理樣的鮮味氨基酸和甜味氨基酸總含量均較高，且鮮味氨基酸+甜味氨基酸+芳香族氨基酸的相對含量大于其余攤放處理樣。甜味氨基酸能掩蓋苦澀味，還能與鮮味氨基酸協(xié)同作用，起到增香增鮮的效果[38]。在研究中，這些甜味成分的含量均較低，實際沖泡后達不到甜味閾值[39]。18℃處理樣的芳香族氨基酸總量較高。21℃處理組樣的苦味氨基酸含量最高，其中亮氨酸的TAV值＞1，呈味作用顯著。

表3 不同攤放處理茶鮮葉游離氨基酸TAV值Table 3 Taste active values of free amino acids of fresh tea leaves under different treatments

2.4 不同攤放處理對茶葉品質(zhì)的影響

不同攤放處理茶葉感官審評結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示，不攤放處理樣的品質(zhì)得分均低于攤放處理樣，15℃攤放制得干茶LTS的感官品質(zhì)最好，湯色綠清澈明亮，滋味鮮醇，香氣清香持久。攤放處理組間，隨著攤放溫度的升高，處理茶樣感官品質(zhì)總分呈下降趨勢，21℃處理茶樣除香氣指標(biāo)外，其余感官得分均低于另外兩個攤放處理茶樣。

表4 不同攤放處理茶葉感官審評結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results of fresh tea leaves under different treatments

3 討論

攤放處理茶樣共檢出16種游離氨基酸，不攤放處理組樣品僅測得12種游離氨基酸，纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸以及酪氨酸均未檢出。攤放組樣品相較于不攤放處理組，谷氨酸、苯丙氨酸、茶氨酸以及總游離氨基酸含量呈明顯（p＜0.05）增加的趨勢，增幅大小依次為NTS＜MTS＜HTS＜LTS；攤放處理組間，隨著攤放溫度的增加，氨基酸各組分含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢，天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸、組氨酸的含量均持續(xù)減少，精氨酸的含量保持增大，谷氨酸、茶氨酸、苯丙氨酸的含量先減后增，甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸、脯氨酸的含量先增后減。

不同攤放處理對茶鮮葉樣品呈味特性影響顯著。從呈味氨基酸比較來看，鮮味氨基酸含量較高，苦味氨基酸其次，甜味氨基酸和芳香族氨基酸相當(dāng)。主要呈味氨基酸為谷氨酸、茶氨酸、天冬氨酸以及精氨酸。15℃攤放處理樣的鮮味氨基酸和甜味氨基酸總量較高，且鮮味氨基酸、甜味氨基酸、芳香族氨基酸的相對含量大于其余攤放處理組，通過感官審評，發(fā)現(xiàn)較低溫（15℃）比常溫（18℃、21℃）攤放與不攤放處理的鮮葉樣滋味鮮爽。

綜上所述，低溫攤放有利于茶鮮葉游離氨基酸的積累，制得的干茶感官品質(zhì)較優(yōu)，尤以15℃攤放處理茶樣綜合品質(zhì)最好。