張念英，禚歡歡，郭 冰

（日照市市場監(jiān)管檢驗檢測中心，山東日照276800）

隨著人們生活水平的提高，動物源性產(chǎn)品消費量越來越大，產(chǎn)品中獸藥殘留問題逐漸成為人們普遍關(guān)注的社會熱點問題。獸藥被廣泛用于治療或者預防動物疾病，近年來我國畜牧業(yè)迅猛發(fā)展，由于缺乏科學飼養(yǎng)知識和利益驅(qū)使，一些養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中超量、超范圍使用獸藥，或不遵守休藥期規(guī)定提前宰殺，導致違禁藥物檢出、獸藥殘留檢測超過國家標準規(guī)定現(xiàn)象逐年攀升[1-2]，給整個畜禽養(yǎng)殖行業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失的同時也對消費者健康造成了極大威脅[3]。動物源性食品種類繁多，樣品基質(zhì)復雜，獸藥目標物種類和組分較多，檢測方法多，常用的獸藥殘留檢測方法有液相色譜法[4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-7]、氣相色譜法[8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9]等。超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）作為一種高靈敏度、高選擇性的檢測方法，越來越多應用于動物源樣品中多獸藥殘留檢測[10-12]。

目前，相關(guān)標準和文獻報道的獸藥殘留檢測多以某一類獸藥檢測為主，同時測定的多類獸藥殘留方法較少。一次樣品處理只檢測一類藥物，雖然針對性強，但若需對一個樣品檢測多類獸藥殘留，需要進行多次樣品前處理，檢測周期長、成本高、效率低。因此，建立一種同時檢測動物源性食品中多種獸藥殘留的檢測方法極其必要。

選取豬肉、雞肉、雞蛋3種代表性基質(zhì)，通過Prime HLB通過固相萃取柱凈化除去磷脂等雜質(zhì)，一次前處理可滿足對44種獸藥殘留組分的提取及凈化，同時結(jié)合LC-MS/MS，實現(xiàn)了對畜禽肉及雞蛋等動物源性食品中常見獸藥殘留組分的多殘留同時檢測，具有操作簡單、快速、可靠、準確等特點，可以作為應急保障、風險排查等需要快速響應的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

QTrap 4500型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國SCIEX公司產(chǎn)品；3-18KS型高速冷凍離心機，德國SIGMA公司產(chǎn)品；ET3301A型水浴氮吹儀，歐陸科技產(chǎn)品；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；IKA MS3 basic型高速均質(zhì)儀，德國IKA公司產(chǎn)品；PRESSURE+48型固相萃取裝置，瑞典Biotage公司產(chǎn)品；ME1002E型天平（梅特勒感量0.01 g），XPE205型分析天平（梅特勒感量0.01 mg）；移液器，德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑

標準品：44種標準品及6種內(nèi)標物，德國DR公司或上海CNW公司提供，純度均大于95%；甲醇（色譜純，CNW）；乙腈（色譜純，CNW）、甲酸（色譜純，CNW）、乙酸乙酯（色譜純，CNW）；HLB Prime固相萃取柱（150 mg，3 mL，Waters），其他試劑為分析純；所有試驗用水為一級水。

1.2 試驗條件

1.2.1 液相條件

色譜柱：Xbridge C18柱，2.1 mm×150 mm，3.5 μm；流速0.40 mL/min；進樣量10 μL；柱溫35℃。流動相：0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脫程序為：0～5.0 min，9%～7.5% A；5.0～10.0 min，7.5～4.5% A；10.0～16.0 min，4.5%～9.0% A。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，離子模式（ESI+、ESI-）；多反應監(jiān)測模式（MRM）；氣簾氣（CUR）流速35.0 L/min；碰撞氣：Medium；噴霧電壓（IS）：ESI+：5 500 V；ESI-：-4 500 V；離子源溫度550℃；霧化氣（GS1）流速55.0 L/min；輔助加熱氣（GS2）：55.0 L/min。霧化氣、氣簾氣、碰撞氣均為高純氮氣，使用前調(diào)節(jié)各氣體流量使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求。定性、定量離子及對應的去簇電壓（DP）和碰撞氣能量（CE）優(yōu)化到最佳數(shù)值。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取均質(zhì)后豬肉、雞肉2.5 g，雞蛋1.5 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL具塞離心管中，加入同位素內(nèi)標和80%乙腈溶液4.00 mL（含0.2%甲酸），渦旋2 min，超聲提取20 min，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中。殘渣重復提取1次，合并上清液。用含有0.2%甲酸的80%乙腈溶液定容至10.0 mL，待凈化。

準確移取3.00 mL上清液過Prime HLB固相萃取柱，保持一秒一滴的流速，收集全部流出液，準確吸取2.00 mL流出液，于45℃下氮吹至近干，用0.1%甲酸水∶乙腈（9∶1）1.00 mL定容，過0.22 μm有機濾膜，供LC-MS/MS測定。

1.3.2 標準曲線的制作

混合標準溶液及內(nèi)標溶液：按照磺胺類、喹諾酮類、β-受體激動劑類、氯霉素類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、硝基咪唑類、金剛烷胺類、鎮(zhèn)靜劑類及內(nèi)標分組，分別準確稱量標準品各10 mg于10 mL容量瓶中，磺胺類、β-受體激動劑類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、硝基咪唑類、金剛烷胺類、鎮(zhèn)靜劑類用色譜純甲醇溶解，喹諾酮類用濃度0.03 mol/L NaOH溶解后甲醇定容至10 mL，配制成1 000 μg/mL的單標準儲備液，置于-20℃的冰箱保存。取每種類別儲備液1.00 mL于10 mL容量中，以甲醇定容逐級配成100.0，10.0，1.00 μg/mL的標準中間液。

取適量的標準中間液，根據(jù)每種獸藥組分的響應，磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類、β-受體激動劑類、林可霉素、大環(huán)內(nèi)酯類配制成含有0.50～10.00 ng/mL、內(nèi)標質(zhì)量濃度為5 ng/mL；硝基咪唑類、抗病毒類、鎮(zhèn)靜劑類1.0～20.0 ng/mL內(nèi)標質(zhì)量濃度為50 ng/mL；四環(huán)素類、替米考星5.0～100 ng/mL、內(nèi)標質(zhì)量濃度為50 ng/mL的混合標準工作液。分別取豬肉、雞肉、雞蛋空白樣品，經(jīng)1.3.1樣品前處理后，加入1.00 mL混合標準工作液，制備成基質(zhì)標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理

2.1.1 提取溶劑的選擇

研究中涉及的化合物種類較多，化學性質(zhì)差異較大，依據(jù)每種獸藥組分不同的分子結(jié)構(gòu)和化學性質(zhì)，分別考查了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、（70%，80%，90%）乙腈水、（0.1%甲酸，0.2%甲酸，0.5%甲酸，1.0%甲酸）80%乙腈水等提取溶劑對44種化合物提取效率的影響。

結(jié)果顯示，甲醇、乙酸乙酯提取大量的脂肪和磷脂，雜質(zhì)較多。甲醇對大多數(shù)化合物提取效率較低，部分化合物低至10%左右，乙酸乙酯對喹諾酮類提取效率極低，雞蛋幾乎提取不出喹諾酮類藥物。乙腈溶解性好、滲透強，沉淀蛋白的同時不會提取很多脂肪[13]，作為提取溶劑的回收率較高。但蛋白質(zhì)遇到有機溶劑變性，均質(zhì)容易成團，因此試驗加入適量純水，減少乙腈比例使樣品中蛋白質(zhì)發(fā)生緩慢充分的變性。試驗采用70%，80%，90%乙腈水進行提取，80%乙腈水整體回收率高10%左右。由于待測物中含堿性基團，甲酸可提供酸性環(huán)境，與待測物形成有機鹽，進而提高待測物的回收率。試驗研究含0.1%，0.2%，0.5%，1.0%甲酸的80%乙腈水溶液對化合物提取效率的影響，結(jié)果表明采用80%乙腈水溶液（含0.1%甲酸），化合物回收率均偏低。采用80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）所有的化合物的回收率均在60%～110%。甲酸含量的增高降低磺胺類等堿性化合物的回收率。原因可能在酸性條件下堿性化合物的離子化趨勢增大，在高比例有機相中溶解性減弱。因此，綜合考慮選取80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）作為提取溶劑。

2.1.2 定容溶劑的選擇

在多種獸藥殘留檢測時，定容溶劑與目標物的響應和峰形密切相關(guān)，因此需要選擇對所有目標物均適合的定容溶劑。試驗考查了0.1%甲酸-乙腈（9∶1）水溶液、乙腈、0.1%甲酸水溶液作為定容溶劑時目標物的分離效果。結(jié)果表明，采用乙腈和0.1%甲酸溶液溶液作為定容溶劑時，部分目標物色譜峰分離效果較差且溶劑效應明顯，回收率偏低甚至個別目標物沒有響應，不能滿足檢測需求。選用0.1%甲酸乙腈（9∶1）作為定容溶劑時所有的目標物色譜峰均能有效分離，得到滿意的峰型，且回收率較高。綜合考慮采用0.1%甲酸乙腈（9∶1）水溶液作為定容溶劑。

2.2 流動相及色譜柱的選擇

流動相及色譜柱對目標物的峰形、靈敏度及分離度也有較大的影響，試驗比較了Xbridge C18柱、Waters HSS T3色譜柱分離目標化合物效果。試驗初期，采用乙腈和水作為流動相，溶劑效應明顯且部分化合物靈敏度不高、重復性差。大多數(shù)目標物在酸性條件下穩(wěn)定，更有利于離子化，因此流動相中的酸能明顯改善酸堿化合物的峰形。試驗流動相采用乙腈和0.1%甲酸水溶液，Xbridge C18柱、Waters HSS T3 2種色譜柱分離度均可滿足質(zhì)譜檢測需要[10]。但是，部分目標化合物在Xbridge C18柱上的分離效果和峰形明顯優(yōu)于Waters HSS T3色譜柱，綜合考慮，最終選取0.1%甲酸水和乙腈作為流動相、Xbridge C18柱為色譜柱進行分離。

2.3 質(zhì)譜條件

試驗采用三重四極桿質(zhì)譜，分別進行電噴霧正離子（ESI+）和負離子（ESI-）全掃描模式，采用0.10 μg/mL混合標準工作溶液經(jīng)針泵注射進樣，得到每種化合物響應最佳的準分子離子峰，分別為[M+H]+、[M-H]-。以準分子離子峰為母離子進行二級質(zhì)譜掃描，產(chǎn)生不同質(zhì)荷比（m/z）的碎片離子。選擇干擾最少、強度較高的2個碎片離子作為特征子離子，信號最強的為定量離子，其次為定性離子。然后再對得到的二級質(zhì)譜參數(shù)如去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）等參數(shù)進行優(yōu)化，使定量離子和定性離子強度達到最大，確定最佳質(zhì)譜參數(shù)。

44種化合物及6種內(nèi)標定性、定量離子及對應的去簇電壓（DP）和碰撞氣能量（CE）見表1。

2.4 基質(zhì)效應

采用LC-MS/MS分析樣品，基質(zhì)效應是影響定量結(jié)果準確性的重要因素。基質(zhì)效應（ME）指在樣品測定過程中，基質(zhì)存在導致目標物響應產(chǎn)生變化的現(xiàn)象。為評價基質(zhì)效應[10]，分別采用空白基質(zhì)曲線及相應含量溶劑曲線。在相同的儀器條件下，比較空白基質(zhì)曲線和溶劑曲線目標化合物的離子強度進而評價基質(zhì)效應[10]。

結(jié)果表明，豬肉的磺胺類除了磺胺嘧啶、磺胺氯噠嗪、甲氧芐啶表現(xiàn)出基質(zhì)抑制外，其余均為基質(zhì)增強。豬肉的氯霉素、強力霉素、多西環(huán)素為基質(zhì)增強，其余為基質(zhì)抑制。雞肉所有的化合物均為基質(zhì)抑制。雞蛋甲硝唑為基質(zhì)增強，其余均為基質(zhì)抑制。因此，試驗采取基質(zhì)匹配及添加內(nèi)標的方法抵消或補償基質(zhì)效應，氯霉素、克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、金剛烷胺、金剛乙胺、林可霉素、替米考星采用基質(zhì)匹配及內(nèi)標法定量，其余化合物采用基質(zhì)匹配外標法進行定量，保證試驗結(jié)果準確可靠。

2.5 工作曲線、線性范圍及檢出限、定量限的確認

標準曲線采用空白基質(zhì)配制，以質(zhì)量濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到每種化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限。

44種化合物的質(zhì)量濃度范圍、檢出限、定量限、相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 44種化合物的質(zhì)量濃度范圍、檢出限、定量限、相關(guān)系數(shù)

2.6 準確度和重復性

在空白豬肉、雞肉、雞蛋中做加標回收和精密度試驗，添加量分別為1倍，2倍，10倍檢出限，按上述前處理方法及測定條件進行回收率試驗，每個添加水平平行測定6次。結(jié)果表明，各化合物基質(zhì)加標回收率為62.5%～110.0%，相對標準偏差（RSD）均小于15%，證明方法的準確性和重復性良好。

3 結(jié)論

建立了一種快速、準確測定畜禽肉及雞蛋等動物源性食品44種獸藥殘留超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC-MS-MS)定性定量檢測方法。豬肉、雞肉、雞蛋中44種獸藥的檢出限為1.0～10.0 μg/kg，定量限為3.0～30.0 μg/kg。與現(xiàn)行國家標準和行業(yè)標準相比，該方法能實現(xiàn)同時分析多種獸藥殘留，大大縮短了檢測周期，具有簡單、快速、靈敏、準確高等優(yōu)點，適用于快速篩查畜禽肉及雞蛋等動物源性食品多種獸藥殘留的檢測。